CN110618211B - 一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法 - Google Patents

一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，具体步骤为：低共熔溶剂的制备：将甜菜碱和乙酸、水混合，加热，得到混合液即为低共熔溶剂；提取：将黄芩干燥粉碎、过筛，将筛选后的黄芩与低共熔溶剂、水混合，超声，离心，取上清液，即为黄酮提取液。甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：1‑4：1，低共熔溶剂中水占的质量为20％‑80％，料液比为1：60‑200，提取的时间为10‑55min。解决了黄芩中黄酮类物质提取率低，杂质含量高的问题。

Description

一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法
技术领域
本发明属于药材提取技术领域，具体涉及一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，随着人们对绿色化学概念的提出，人们对环保的意识不断提高，为了减少化工生产过程中的环境污染，在世界范围内兴起了离子液体的研究热潮，现如今绿色化学的研究热点之一便是对绿色溶剂的开发，各种各样的离子液体涌现，且其应用范围亦在不断扩大。但是离子液体在某些条件下是具有一定的毒性，而低共熔溶剂相对较为安全，Abbott首先提出低共熔溶剂，将其定义为直接将胆碱盐和配位剂(如金属盐、金属盐水合物或氢键供体)组合而成的低共熔混合物。
低共熔溶剂与传统离子液体制备相比较，DES的制备相对比较简单，无需提纯，不需辅助技术也经济，同时对水和空气也较稳定，即在常温常压下制备即可。从各研究看，制备方法大致分为两种，一种是直接加入一定比例的水组成DES，另外一种是不加水直接进行合成组成。总的来说，DES的制备方法简要概括为：分别按一定的化学计量比精确称取氢键供体和氢键受体，然后在圆底烧瓶中混合，再置于高于共晶温度下加热搅拌，形成均匀稳定的无色透明液体，即得。
中药材黄芩，也叫虹胜、山茶根，色黄为佳，是临床上常用的大宗药材，其化学成分主要有黄酮类，如黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等，另外，还有挥发油、微量元素等，中药中有效化学成分提取方法有常见的有机溶剂提取、升华法、固相微萃取等，但这些传统的方法操作过程相对复杂、有效成分会与有机溶剂发生作用、在整个操作中有效成分会经常发生变化或者产生杂质多等，所以提取方法有待于优化改进。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法。本发明针对黄芩提取过程复杂，而且杂质较多的问题，提供了一种可以减少杂质，使有效成分被充分提取出来的方法。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，具体步骤为：
低共熔溶剂的制备：将甜菜碱和乙酸、水混合，加热，得到混合液即为低共熔溶剂；
提取：将黄芩干燥粉碎、过筛，将筛选后的黄芩与低共熔溶剂、水混合，超声，离心，取上清液，即为黄酮提取液。
本发明解决了现有的提取黄芩的方法，由于受到杂质的影响，有效成分与提取剂之间的作用，导致有效成分的提取率降低的问题。本发明提取的黄酮类物质的提取率较高，对细胞无毒性，而且抗炎活性更高。
在一些实施例中，甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：1-4：1；优选的，甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：2-2：1；进一步优选的，甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：4。甜菜碱和乙酸的配合解决了现有的低共熔溶剂对黄芩的提取率较低的问题，提取的黄酮类含量高，杂质含量少，低共熔溶剂的两种组分之间是通过氢键相互作用组合而成的一种特殊溶剂，这两种物质对形成的低共熔溶剂的性质具有较大的影响，甜菜碱和葡萄糖、柠檬酸、尿素、D-果糖和或甲酸的组合对黄酮的提取效果均低于本申请的甜菜碱和乙酸的提取效果。
在一些实施例中，低共熔溶剂中水占的质量为20％-80％；优选的，低共熔溶剂中水占的质量为20％-40％；进一步优选的，低共熔溶剂中水占的质量为20％。在低共熔溶剂甜菜碱、乙酸和水形成的一种均一、稳定的无色透明的液体，水分在低共熔溶剂中可以降低低共熔溶剂的粘度，有利于提取的进行，所以水分的含量影响对黄芩的提取率。
在一些实施例中，甜菜碱和乙酸混合后加热的温度为70-90℃。在一些实施例中，黄芩干燥粉碎后，经过90-110目筛进行筛选。在一些实施例中，料液比(过筛后的黄芩与低共熔溶剂和水的混合体积的比)为1：60-200；优选的，料液比为1：80-150；进一步优选的，料液比为1：100。料液比对黄芩中黄酮类物质的提取的影响为：并不是料液比越高提取出来的黄酮类物质越多，当比值超过一个值后，反而不利于黄酮类物质的浸出。
在一些实施例中，黄芩中加入低共熔溶剂和水后提取的时间为10-55min；优选的，提取时间为15-45min；进一步优选的，提取时间为25min。低共熔溶剂和水与黄芩作用的过程影响作用的时间，时间较长并不能带来较好的提取效果，时间较长反而会使提取的效果下降。
在一些实施例中，黄芩中加入低共熔溶剂和水后提取的温度为35-75℃；优选的，提取的温度为45-65℃；进一步优选的，提取的温度为55℃。提取的温度影响低共熔溶剂与黄芩中黄酮类物质的作用活性，影响低共熔溶剂的物理性质和化学性质，进而影响浸提的效果。在一些实施例中，提取过程中超声的时间为5-15min。超声的作用是使低共熔溶剂与黄芩能够充分的接触，提高浸取速度和浸取效果。在一些实施例中，离心的转速为2000-4000r/min，离心时间为3-8min。
本发明的有益效果：
本发明的黄芩提取方法可从黄芩中提取出的黄酮类物质包括野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A等化学成分，提取出的这两种黄酮成分的量相比于传统的乙醇溶剂，低共熔溶剂与黄酮类化合物具有多重氢键的相互作用，提取效率较高并且提取时间短，而且，乙酸相比于其他如葡萄糖、柠檬酸、尿素、D-果糖或甲酸，与黄芩中的黄酮类物质具有相溶性，具有更好的提取效果。
本发明选择低共熔溶剂进行浸取黄芩，黄芩是一种具有解热、抗炎、保肝、抗肿瘤、清除自由基等作用。但是现有的方法，并没有将黄芩的黄酮成分有效的提取出来，以致于需要提取更多的黄芩，才能得到所需药量，并且现有的方法存在提取溶剂有低毒、提取时间长等缺点，开发新型绿色溶剂对黄酮类化合物的提取具有重要意义，在本发明中，利用甜菜碱和乙酸组成的低共熔溶剂与黄芩具有较好的相溶性，并且基于甜菜碱无毒，物理化学性质稳定，耐酸碱及高温等优点，乙酸的应用范围也较广，二者合成的低共熔溶剂可以做到利用较少的提取剂即可以得到较多的黄酮量，提取出的黄酮的量，足可以达到具有抗炎性能的作用。所以本发明的黄芩提取方法，取得了较好的提取效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为样品的HPLC图谱；a为实施例1的提取得到的提取液的HPLC图谱，b为混合标准品的HPLC图谱；
图2为实施例1-6的不同摩尔比对黄酮化学成分总含量的影响图；
图3为实施例1和实施例7-实施例10的料液比对黄酮化学成分总含量的影响图；
图4为实施例1和实施例11-实施例14的提取时间对黄酮化学成分总含量的影响图；
图5为实施例1和实施例15-实施例18的温度对黄酮化学成分总含量的影响图；
图6为实施例19-21和对比例1的含水量对黄酮化学成分总含量的影响图；
图7为不同溶剂提取液对RAW264.7细胞活力影像图；
图8为不同溶剂提取液对RAW264.7细胞释放NO量的影响图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下述的提取液的检测方法和条件为：
1)色谱条件
色谱柱：Agilent 5TC-C18柱(250×4.6mm)，流速：0.8mL/min，柱温：35℃，检测波长：274nm，进样量：10μL，流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件：0～5min，18％～24％(B)，5～10min，24％～26(B)，10～30min，26％～40％(B)，30～40min，40％～50％(B)，40～50min，50％～100％(B)。
2)标准溶液的制备
精密称取适量的黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A标准品，分别用甲醇溶解、定容、摇匀，作为对照品储备液，在4℃的条件中冷藏，待用。
精密吸取少量对照品稀释液至10mL量瓶，甲醇溶解、定容、摇匀，即得335μg·mL-1的野黄芩苷、36μg·mL-1的黄芩苷、167.5μg·mL-1的汉黄芩苷、85μg·mL-1的黄芩素、42.5μg·mL-1的汉黄芩素、18μg·mL-1的千层纸素A的浓度分别为的混合对照品溶液。
3)利用本发明的提取液制备供试品溶液的方法：
分别精密吸取0.5mL上述黄芩低共熔溶剂提取液及传统溶剂的提取液，以甲醇定容至10mL，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
4)样品的测定过程
通过高效液相色谱仪，分别进样体积为10μL的对照品溶液和供试品溶液，按照上述色谱条件对供试品和样品进行检测，记录相应的高效液相色谱图，并记录保留时间和对应峰面积。
下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
原料为甜菜碱和乙酸、水，甜菜碱和乙酸按1：4的化学计量比混合于圆底烧瓶中，再加入水，水的含量占总的低共熔溶剂的质量百分数为40％，料液比为1：100。放在80℃的油浴中充分加热搅拌，直到形成均一、稳定的无色透明液体，即得低共熔溶剂；
黄芩药材经干燥粉碎后，过100目筛，然后精确称取0.1g药品粉末装在10mL带塞玻璃管中，加入含水为40％的甜菜碱/乙酸低共溶剂4mL，55℃下超声10min，提取时间为25min，补足失重，然后将提取液3000r/min离心5min，取其上清液，即黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液。
实施例1的提取液，分为三个供试品分别进行检测，得到如表1所示结果。
表1化学成分含量表
Figure BDA0002211694420000061
Figure BDA0002211694420000071
从表1可以得到，实施例1的提取液的各个成分的含量是比较稳定的，而且各个成分的含量及总含量是比较高的。
实施例2
将甜菜碱和乙酸、水按一定的化学计量比混合于圆底烧瓶中，放在85℃的油浴中充分加热搅拌，直到形成均一、稳定的无色透明液体，即得低共熔溶剂；
黄芩药材经干燥粉碎后，过90目筛，然后精确称取0.1g药品粉末装在10mL带塞玻璃管中，加入含水为40％的甜菜碱/乙酸低共溶剂4mL，55℃下超声10min，提取时间为25min，补足失重，然后将提取液3500r/min离心8min，取其上清液，即黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液。
实施例3
与实施例1不同的是甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：1。
实施例4
与实施例1不同的是甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：2。
实施例5
与实施例1不同的是甜菜碱和乙酸的摩尔比为2：1。
实施例6
与实施例1不同的是甜菜碱和乙酸的摩尔比为4：1。
实施例1-6的黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液的不同摩尔比对黄酮化学成分总含量的影响图如图2所示，其中纵坐标的总含量是指野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A这六种成分的总含量，由图2可以得到当甜菜碱与乙酸的摩尔比为1：4时，六种化学成分的含量较高，当摩尔比大于1：4时，提取的黄酮类物质的总含量反而会下降。
实施例7
与实施例1不同的是料液比为1：60。
实施例8
与实施例1不同的是料液比为1：80。
实施例9
与实施例1不同的是料液比为1：150。
实施例10
与实施例1不同的是料液比为1：200。
实施例1和实施例7-实施例10的黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液的料液比对黄酮化学成分总含量的影响图如图3所示，由图3可以得到随着料液比的增加，含量先升高再降低，料液比为1：100时，化学成分的含量最高，故实验优选料液比为1：100。
实施例11
与实施例1不同的是提取时间为10min。
实施例12
与实施例1不同的是提取时间为15min。
实施例13
与实施例1不同的是提取时间为45min。
实施例14
与实施例1不同的是提取时间为55min。
实施例1和实施例11-实施例14的黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液的提取时间对黄酮化学成分总含量的影响图如图4所示，由图4可以得到随着提取时间的增加，化学成分的总含量也是先升高再降低，45min以后化学成分的含量基本不变，当提取时间为25min时，化学成分的总含量最高。
实施例15
与实施例1不同的是提取温度为35℃。
实施例16
与实施例1不同的是提取温度为45℃。
实施例17
与实施例1不同的是提取温度为65℃。
实施例18
与实施例1不同的是提取温度为75℃。
实施例1和实施例15-实施例18的黄酮类化学成分低共熔溶剂提取液的温度对黄酮化学成分总含量的影响图如图5所示，由图5可以得到随着提取温度的升高，化学成分的总含量也是先升高再降低，65℃与75℃化学成分的含量相当，当提取温度为55℃时，化学成分的总含量最高。温度大于55℃时，不利于黄芩中黄酮成分的溶出，降低了黄酮成分溶出的活性。
实施例19
与实施例1不同的是低共熔溶剂中含水量为20％。
实施例20
与实施例1不同的是低共熔溶剂中含水量为60％。
实施例21
与实施例1不同的是低共熔溶剂中含水量为80％。
对比例1
与实施例1不同的是低共熔溶剂中含水量为0％。
实施例19-21和对比例1的含水量对黄酮化学成分总含量的影响图如图6所示，可以得到，增加水的量，可以降低低共熔溶剂的粘度，有利于提取的进行，并且随着含水量的增加，提取效率增加，化学成分的溶出效率增加，但是当含水量超过40％时，化学成分的含量开始降低。本发明的低共熔溶剂的含水量在40％时，粘度的值正好复合与黄芩的相溶性，提高了提取率。
对比例2
传统溶剂的提取液的制备：按照2015版《中国药典》中对黄芩的测定方法，精确称取约0.3g黄芩药品粉末，加40mL 70％乙醇，加热回流3h，冷却、过滤，将滤液转至100mL量瓶中，容器和残渣用少许70％乙醇洗涤两至三次，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1mL，至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
对比例3
与实施例4不同的是利用葡萄糖代替乙酸。
对比例4
与实施例4不同的是利用柠檬酸代替乙酸。
对比例5
与实施例4不同的是利用尿素代替乙酸。
对比例6
与实施例4不同的是利用D-果糖代替乙酸。
对比例7
与实施例4不同的是利用甲酸代替乙酸。
对比例8
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和尿素代替甜菜碱和乙酸。
对比例9
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和柠檬酸代替甜菜碱和乙酸。
对比例10
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和葡萄糖代替甜菜碱和乙酸。
对比例11
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和D-果糖代替甜菜碱和乙酸。
对比例11
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和甲酸代替甜菜碱和乙酸。
对比例12
与实施例4不同的是利用氯化胆碱和乙酸代替甜菜碱和乙酸。
实施例4与对比例2至对比例12的提取液中黄酮类物质的化学成分含量如表2所示：
表2提取液中化学成分含量表
Figure BDA0002211694420000111
Figure BDA0002211694420000121
由表2可以得到传统方法，利用乙醇进行提取，乙醇与甲醇这两种有机溶剂，具有一定的毒性，对化学成分的提取效率也较低，很容易导致有效成分的损失，产生一定的废物。本发明实施例4的各个黄酮成分及总黄酮含量都比对比例2-对比例12高，说明本发明的甜菜碱与乙酸的配合相比于其它低共熔溶剂具有更好的相溶性，与黄芩中的黄酮成分具有更好的溶出效果。
甜菜碱分别与甲酸、乙酸配合形成低共熔溶剂，甜菜碱与乙酸的低共熔溶剂的提取效果更好，可能由于乙酸相对于甲酸来说，酸性弱，所以黄酮类成分较易溶出。
试验例
低共熔溶剂及传统溶剂提取液体外抗炎活性研究
1)细胞培养及配制
取对数期生长的若干细胞，用含10％胎牛血清、0.1g/L硫酸链霉素、100mL/L青霉素的高糖DMEM培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，2～3天传代一次，备用。另分别吸取一定量的黄芩提取液，DMSO溶解，配成储存液，4℃下保存。
2)实验分组
实验分为三组，分别是对照组(LPS，1mg/L)、实验组(黄芩提取液用DMSO溶解)和空白组。然后按照分组加适量的药物，在培养箱(37℃与5％CO2)中进行孵育。
3)MTT法测定细胞存活率
RAW264.7细胞与不同浓度的黄芩提取物进行连续培养24h以后，孔内培养基直接弃去，并加入100μL质量浓度为0.5mg/mL的MTT溶液继续培养4h。培养结束后将上清液舍弃，每孔再加入100μL DMSO避光摇晃10min至均匀，按条件测定OD490 nm，然后按下列公式计算细胞生存率：
细胞存活率(％)＝(OD样品组/OD正常组)×100
4)测定RAW264.7细胞释放NO浓度
将RAW 264.7细胞稀释至2×105/mL，每孔加100μL，置于37℃、5％CO2培养24h，按分组给药，设3个平行孔，作用24h，取50μL样品及标准品，每孔加50μL Griess Reagent I及Griess Reagent II，酶标仪测定各样品在540nm下的吸光度，以标准曲线法计算NO的浓度。实验重复3次。
如图7所示为不同溶剂提取液对RAW264.7细胞活力影像图，从图7可以得到经LPS处理细胞后，细胞活力出现明显的降低。而低共熔溶剂和传统溶剂提取液与LPS共孵育后，并没有明显的加重细胞毒性，但同时也没有增加巨噬细胞的活力。
如图8所示为不同溶剂提取液对RAW264.7细胞释放NO量的影响图，从图8中可以得到，本发明中实施例1和对比例2-对比例12合成的12种提取剂、单因素实验优化甜菜碱/乙酸(1：4)及70％乙醇提取液组与LPS组对比，均可增加RAW264.7细胞释放NO的生成量，不同低共熔溶剂对于NO的抑制效果有差异，其中甜菜碱/乙酸(1：4)明显抑制NO的释放量，从而表明黄酮类成分可通过降低NO的释放达到抗炎效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：具体步骤为：
低共熔溶剂的制备：将甜菜碱和乙酸、水混合，加热，得到混合液即为低共熔溶剂；
提取：将黄芩干燥粉碎、过筛，将筛选后的黄芩与低共熔溶剂、水混合，超声，离心，取上清液，即为黄酮提取液；
其中，甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：4-4：1；低共熔溶剂中水占的质量为20%-80%。
2.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：2-2：1。
3.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：甜菜碱和乙酸的摩尔比为1：4。
4.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：低共熔溶剂中水占的质量为20%-40%。
5.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：低共熔溶剂中水占的质量为20%。
6.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：甜菜碱和乙酸混合后加热的温度为70-90℃。
7.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：黄芩干燥粉碎后，经过90-110目筛进行筛选。
8.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：料液比为1：60-200。
9.根据权利要求8所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：料液比为1：80-150。
10.根据权利要求9所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：料液比为1：100。
11.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：黄芩中加入低共熔溶剂和水后提取的时间为15-45min。
12.根据权利要求11所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：提取时间为25min。
13.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：黄芩中加入低共熔溶剂和水后提取的温度为35-75℃。
14.根据权利要求13所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：提取的温度为45-65℃。
15.根据权利要求14所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：提取的温度为55℃。
16.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：提取过程中超声的时间为5-15min。
17.根据权利要求1所述的低共熔溶剂提取黄芩化学成分的方法，其特征在于：离心的转速为2000-4000r/min，离心时间为3-8min。
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