CN106420851B

CN106420851B - 一种舒血宁注射液及其制备方法

Info

Publication number: CN106420851B
Application number: CN201610928988.7A
Authority: CN
Inventors: 方同华; 范玉奇; 周广红; 贾文娟; 崔玉海
Original assignee: HAERBIN ZHENBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HAERBIN ZHENBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: CN106420851A

Abstract

本发明涉及一种银杏叶组合物，具体涉及一种舒血宁注射液及其制备方法。该注射液由银杏叶提取物制成，所述银杏叶提取物中总黄酮醇苷25‑40％，银杏内酯6.5‑16％，白果内酯3‑5％，银杏酸小于5ppm。本发明的方法有效去除了有害成分总银杏酸，降低了类过敏反应的发生。本发明制得的舒血宁注射液，成分比例明确，稳定性好，刺激性小，溶解度好，疗效稳定。

Description

一种舒血宁注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种银杏叶组合物，具体涉及一种舒血宁注射液及其制备方法。

背景技术

舒血宁注射液为银杏叶经提取制成的灭菌水溶液。银杏叶是银杏科植物银杏的干燥叶，其为传统的活血化瘀中药材，银杏叶提取物是经现代提取工艺从银杏叶中提取的活性物质的富集产品。可用于疗肺虚咳喘、冠心病、高血脂、抑郁症、糖尿病、神经疾病、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。其主要活性成分为黄酮类和萜类。黄酮类成分包括单黄酮、黄酮醇苷、乙酰化黄酮醇苷、双黄酮、黄烷-3-醇类以及原花色素等。萜类银杏内酯有银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯。

舒血宁注射液是银杏叶经提取制成的灭菌水溶液。主要的化学成分包括总银杏酸、内酯和黄酮等化合物。内酯和黄酮是有效活性成分，总银杏酸为有毒成分。目前，银杏叶提取物标准收载于《中国药典》2015年版一部。商务部中国医药保健品进出口商会正式对外发布的《银杏叶提取物国际商务标准》指出，国内外大量文献报道显示，总银杏酸具有细胞毒性、胚胎毒性、致敏性及致突变作用，被广泛认为是银杏叶提取物及其制剂中的毒性物质，WHO及多国药典(包括现行版EP和USP)要求银杏叶提取物中总银杏酸的含量不得大于5mg/kg，现行《中国药典》2015年版要求银杏叶提取物中含总银杏酸不得过10mg/kg，舒血宁注射液国家药品标准中对总银杏酸的限量已与国际接轨。控制总银杏酸的含量即可降低不良反应的发生，提高产品安生性。总银杏酸是公认的致敏物质，总银杏酸的去除，可使舒血宁注射液产品质量上升一个新台阶。

目前，关于银杏叶提取物的文献很多。

中国专利申请201610053191.7公开了一种由银杏叶提取物形成的中药组合物，以占所述中药组合物的质量百分比计，包括，24-40％的银杏总黄酮，6-16％的银杏内酯，银杏酸小于5ppm。优选地还包括，1-1.68％的槲皮素-3-O-葡萄糖苷，2.11-3.53％的槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷。进一步优选地还包括，1.4-3％的银杏内酯A，0.9-1.8％的银杏内酯B和1.2-1.3％的银杏内酯C。本申请的中药组合物明确了两种对其药物具有重要影响的槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，并进一步的将其含量精确限定为1-1.68％和2.11-3.53％，进一步的，清楚的界定其银杏内酯A1.4-3％，银杏内酯B0.9-1.8％和银杏内酯C1.2-1.3％。该申请采用乙醇－水溶液进行提取，有效成分提取率低。

中国专利申请CN200910154390.7公开了一种银杏提取物的生产工艺，将银杏叶原料加入8倍50-70％的乙醇对银杏叶分3次进行浸提，浸提温度70度，然后收集提取液，真空蒸发，回收乙醇，离心后收集上清液；将经过离心处理的提取液过径高比为1∶10的大孔树脂层析柱，用5-15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然后用70％的乙醇解吸，解吸完毕后，收集解吸液，将上述解吸液再过径高比为1∶30的大孔树脂层析柱，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏后，真空干燥即得银杏提取物。该方法乙醇对银杏叶分3次进行浸提，但无纯化步骤，杂质多，树脂柱径高比偏高，不适规模化大生产。

中国专利申请200910217956.6体公开了一种扩张血管，改善微循环药物舒血宁注射液的制备方法。其将银杏叶粉碎后，经乙醇浸泡、浓缩过滤、乙醇冷藏、树脂吸附、乙醇洗脱等技术处理，得到银杏提取液。其仅采用浸泡乙醇提取，提取方法较为简单，提取率偏低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种舒血宁注射液。

本发明还提供了一种舒血宁注射液的制备方法。

本发明提供一种舒血宁注射液，该注射液由银杏叶提取物制成，所述银杏叶提取物中总黄酮醇苷25-40％，银杏内酯6.5-16％，白果内酯3-5％，银杏酸小于5ppm。

所述银杏叶提取物中总黄酮醇苷29-40％，银杏内酯7-16％，白果内酯3-5％，银杏酸小于1ppm。

所述总黄酮醇苷的苷元是由组合物槲皮素、山奈素和异鼠李素组成，其重量比为1.0-1.25:1:0.4-0.75。

所述注射液中银杏内酯A不低于0.07mg/ml，银杏内酯B不低于0.03mg/ml，银杏内酯C不低于0.04mg/ml。

所述银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取银杏叶超微粉碎，用4-6倍的50-60％的乙醇，50-60℃下浸泡0.5-2h，回流提取0.5-2h，收集提取液，滤渣用3-5倍的50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷组成的混合溶剂回流提取0.5-1.5h，收集提取液；

(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.5-8.0，静置12-24h，过滤，加水定容至银杏叶量的5-6倍体积；

(3)加浓盐酸调节pH为4.5-5.0，4500-5000r/min离心；

(4)离心液以1.6-1.8BV/h过大孔吸附树脂柱；用1-1.5BV的纯化水、1.5-2BV的15％乙醇以3.0-4.0BV/h的流速冲洗树脂，用5-6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5-1h，以1.3-1.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；

(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2-3次；浓缩至4g/ml；

(6)加入无水乙醇，使醇含量为85-88％，加入NaOH溶液调节pH为7.3-7.8，冷却静置24-36h，上清液经0.45μm的微孔滤膜精滤，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

所述银杏叶于60-65℃烘3-5h。

所述混合溶剂中50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的体积比为5-8：1：2。

所述树脂为HPD450和S-8，二者的质量比为2-3：1。

所述萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4-5：1：4-5。

所述舒血宁注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取所述银杏叶提取物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；

(2)调节pH至3.5-4.0，加热至80-85℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min，

(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7-5.0，定容，搅拌均匀

(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。

本发明舒血宁注射液的使用方法为：肌肉注射，一次10ml，一日1～2次；静脉滴注，每日20ml，用5％葡萄糖注射液或0.9％生理盐水注射液稀释250ml或500ml后使用，或遵医嘱。

乙醇浓度对于银杏叶提取物的质量影响较大，银杏叶提取物的制备过程中，醇浓度越高，杂质去除的越多，有效成分损失也越大。因此，本发明所选取乙醇的浓度有利于提取物中杂质的去除及降低有效成分的损失。

与现有技术相比本发明的有益效果在于：本发明的银杏提取物的提取方法采用两种树脂吸附，有效去除了有害成分总银杏酸，降低了类过敏反应的发生；同时，采用两次提取方法，并采用乙醇、丙三醇和二氯甲烷组成的混合溶剂提取，还采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂多次萃取，目标成分含量高，纯度好，提高了产品质量。本发明制得的舒血宁注射液，成分比例明确，稳定性好，杂质少，溶解度好，疗效稳定。

具体实施方式

实施例1：银杏叶组合物

一、提取方法

(1)取银杏叶于65℃烘4h，超微粉碎，用5倍的55％的乙醇，50-60℃下浸泡1.5h，回流提取1h，收集提取液，滤渣用4倍的55％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷组成的混合溶剂回流提取1h，收集提取液；其中，50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的体积比为6：1：2。

(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.6，静置18h，过滤，加水定容至银杏叶量的5倍体积；

(3)加浓盐酸调节pH为4.8，4750r/min离心；

(4)离心液以1.7BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.2BV的纯化水、1.8BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速冲洗树脂，用5.5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；其中，树脂柱中的树脂为HPD450和S-8的混合物，二者的质量比为3：1；

(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为3次；浓缩至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为5：1：4。

(6)加入无水乙醇，使醇含量为86％，加入NaOH溶液调节pH为7.6，冷却静置30h，上清液经0.45μm的微孔滤膜精滤，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

二、含量检测

1、总黄酮醇苷照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；

2)对照品溶液的制备：分别取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液；

3)供试品溶液的制备：取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液(或对照提取物溶液)与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素与异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：

总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。

2、萜类内酯照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512))测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丁醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。

2)对照品溶液的制备：分别取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

3)供试品溶液的制备：取本品约0.15g，精密称定，加水10ml，至水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得。

3、总银杏酸

照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512))测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90∶10)为流动相；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。

2)对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。

3)供试品溶液的制备：取本品粉末约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60-90℃)50ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60-90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。

4)测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。

4、杂质成分检测

4.1炽灼残渣：取本品1.0g置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在500-600℃炽灼使完全炭化，移至干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500-600℃炽灼至恒重，称重。该重量与取样量的比值为炽灼残渣值。

4.2重金属及有害元素(电感耦合等离子体质谱法)

1)标准品储备液的制备：分别精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含铅、砷、镉、汞、铜为1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液，即得。

2)标准品溶液的制备：精密量取铅、砷、镉、铜标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml含铅、砷0ng、1ng、5ng、10ng、20ng，含镉0ng、0.5ng、2.5ng、5ng、10ng，含铜0ng、50ng、100ng、200ng、500ng的系列浓度混合溶液。另精密量取汞标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5ng的溶液，本液应临用配制。

3)内标溶液的制备：精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量，用水稀释制成每1ml各含1μg的混合溶液，即得。

4)供试品溶液的制备取供试品于60℃干燥2小时，粉碎成粗粉，取约0.5g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5-10ml。密闭并按各微波消解仪的相应要求及一定的消解程序进行消解。消解完全后，消解液冷却至60℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50ml量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液(1μg/ml)，200μl，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

除不加金单元素标准溶液外，余同法制备试剂空白溶液。

5)测定法：以测量值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，读取3次读数的平均值。从标准曲线上计算相应的浓度。在相同的分析条件下进行空白试验，扣除空白干扰。

4.3大孔吸附树脂残留检查：照残留溶剂测定法(《中国药典》2015年版四部附录0861第二法)测定。

1)色谱条件与系统适用性试验：以键合/交联聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氢火焰离子化检测器，柱温，程序升温，起始温度为60℃，维持16分钟，再以每分钟20℃升温至200℃，维持2分钟；检测器温度300℃；进样口温度240℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟。理论板数以邻二甲苯峰计算应不低于40000，各待测峰之间的分离度应符合规定。

2)对照品溶液的制备：精密称取正己烷，苯，甲苯，对二甲苯，邻二甲苯，苯乙烯，1，2-二乙基苯和二乙烯苯对照品适量，加N，N-二甲基乙酰胺制成每1ml中分别含20μg、4μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作为对照品储备液。精密吸取上述储备液2ml，置50ml量瓶中，加25％N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。

3)供试品溶液的制备：取本品约0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入25％的N，N-二甲基乙酰胺溶液5ml，密封瓶口，摇匀，即得。

4)测定法：分别精密量取顶空气体1ml，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

检测结果：总黄酮醇苷(％)：43.0(其中槲皮素的含量为6.7％、山柰素的含量为6.15％、异鼠李素的含量为4.29％)；银杏内酯(％)：11.8；白果内酯(％)：4.3；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.29；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例2：银杏叶组合物

一、提取方法

(1)取银杏叶于60℃烘3h，超微粉碎，用4倍的50％的乙醇，50℃下浸泡2h，回流提取0.5h，收集提取液，滤渣用3倍的50％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷组成的混合溶剂回流提取1.5h，收集提取液；其中，50％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的体积比为5：1：2。

(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.5，静置12h，过滤，加水定容至银杏叶量的5倍体积；

(3)加浓盐酸调节pH为4.5，4500r/min离心；

(4)离心液以1.6BV/h过大孔吸附树脂柱；用1BV的纯化水、2BV的15％乙醇以3.0BV/h的流速冲洗树脂，用5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5h，以1.3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；其中，树脂柱中的树脂为HPD450和S-8的混合物，二者的质量比为2：1；

(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4：1：5。

(6)加入无水乙醇，使醇含量为85％，加入NaOH溶液调节pH为7.3，冷却静置24h，上清液经0.45μm的微孔滤膜精滤，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

二、含量检测，方法同实施例1。

检测结果：总黄酮醇苷(％)：38.4(其中槲皮素的含量为7.21％、山柰素的含量为5.78％、异鼠李素的含量为2.31％)；银杏内酯(％)：7.2；白果内酯(％)：3.4；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.27；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例3：银杏叶组合物

一、提取方法

(1)取银杏叶于65℃烘5h，超微粉碎，用6倍的60％的乙醇，60℃下浸泡0.5h，回流提取2h，收集提取液，滤渣用5倍的60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷组成的混合溶剂回流提取0.5h，收集提取液；其中，60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的体积比为8：1：2。

(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为8.0，静置24h，过滤，加水定容至银杏叶量的6倍体积；

(3)加浓盐酸调节pH为5.0，5000r/min离心；

(4)离心液以1.8BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.5BV的纯化水、1.5BV的15％乙醇以4.0BV/h的流速冲洗树脂，用6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；其中，树脂柱中的树脂为HPD450和S-8的混合物，二者的质量比为3：1；

(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为3次；浓缩至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4：1：4。

(6)加入无水乙醇，使醇含量为88％，加入NaOH溶液调节pH为7.8，冷却静置36h，上清液经0.45μm的微孔滤膜精滤，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

二、含量检测，方法同实施例1。

检测结果：总黄酮醇苷(％)：29.7(其中槲皮素的含量为4.37％、山柰素的含量为4.26％、异鼠李素的含量为3.2％)；银杏内酯(％)：7.9；白果内酯(％)：3.8；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.32；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实施例4：舒血宁注射液

(1)取实施例1银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；

(2)调节pH至3.8，加热至82℃，加入0.3wt％药用炭，搅拌均匀，煮沸6min，

(3)冷却至50℃以下，调节pH4.8，定容，搅拌均匀

注射液含量测定方法基本同组合物的，仅总黄酮醇苷的供试品制备有所不同：

总黄酮醇苷测定中供试品溶液的制备：精密量取本品10ml，加甲醇16ml，18％盐酸溶液6ml，置水浴中加热回流1.5小时，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

经检测，含总黄酮醇苷0.92mg/ml，银杏内酯0.24mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，银杏酸未检出。

实施例5：舒血宁注射液

(1)取实施例2银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；

(2)调节pH至3.5，加热至80℃，加入0.35wt％药用炭，搅拌均匀，煮沸5min，

(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7，定容，搅拌均匀

经检测，含总黄酮醇苷0.87mg/ml，银杏内酯0.22mg/ml，白果内酯0.09mg/ml。

实施例6：舒血宁注射液

(1)取实施例3银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；

(2)调节pH至4.0，加热至85℃，加入0.2wt％药用炭，搅拌均匀，煮沸8min，

(3)冷却至50℃以下，调节pH5.0，定容，搅拌均匀

经检测，含总黄酮醇苷0.89mg/ml，银杏内酯0.23mg/ml，白果内酯0.11mg/ml。

对比例1

(1)取银杏叶于65℃烘4h，超微粉碎，用5倍的55％的乙醇，50-60℃下浸泡1.5h，回流提取1h，收集提取液，滤渣用4倍的55％的乙醇回流提取1h，收集提取液；

(3)加浓盐酸调节pH为4.8，4750r/min离心；

(4)离心液以1.7BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.2BV的纯化水、1.8BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速冲洗树脂，用5.5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；其中，树脂柱中的树脂为HPD450；

含量检测，方法同实施例1，结果如下：

检测结果：总黄酮醇苷(％)：26.7(其中槲皮素的含量为3.92％、山柰素的含量为3.8％、异鼠李素的含量为2.91％)；银杏内酯(％)：6.3；白果内酯(％)：3.1；银杏酸(百万分之)：6；炽灼残渣(％)：0.67；铅(百万分之)：1；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：5；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。

实验例1：对小鼠脑膜微循环影响的试验

(一)动物:昆明种小鼠，雌雄兼有，体重18-22g。

(二)药物

S4:实施例4制备得到的舒血宁注射液，

D1:对比例1的银杏叶提取物配制形成的银杏叶注射液(同实施例4的制备方法)。

(三)仪器：AL-21型激光流量仪

(四)方法：

1、动物分组

将小鼠随机分为4组：假手术对照组、脑缺血模型组、S4用药组(3.5mg/kg，相当于人用剂量的1.3倍)、D1用药组(3.5mg/kg，相当于人用剂量的1.3倍)。每组10只，雌雄各半。

2、脑膜血流量的测定

动物以戊巴比妥麻醉，俯卧固定，沿矢状缝切开头部皮肤，轻轻刮去颅骨表面结缔组织，将激光探头固定于颅骨表面(大脑皮层运动区)，用激光微循环流量仪测定脑膜微循环变化。实验在常温(22-25℃)下进行。

3、给药和测定

药物经尾静脉注射。测定给药前(0)和给药后1、2、10分钟的血流量。

(五)结果:如表1所示

表1.S4对小鼠脑膜微循环的影响

X±S：与空白对照组比**p<0.01；

从表1可以看出：空白对照组动物在10分钟内，脑膜微循环流量稳定。溶媒对照组动物在给予溶媒10分钟内，脑膜微循环流置基本无变化。给小鼠静脉注射相当于人用剂量1.3S4,可明显增加小鼠脑膜微循环，本发明的效果优于D1。

实验例2：对冠心病心绞痛的作用

1、病例：120例住院患者均符合1979年WHO制定的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，根据卫生部1993年制定的中药新药治疗胸痹(冠心病心绞痛)的临床研究指导原则，确定中医证型和冠心病心绞痛轻重分级标准。

轻度：有较典型的心绞痛发作，但疼痛不重，有时需含硝酸甘油；

中度：每天有数次较典型的心绞痛发作，每次持续数分钟至10分钟，一般都需含服硝酸甘油；

较重度：每天有多次典型发作，影响日常生活活动，每次发作持续时间较长，需多次含服硝酸甘油；

重度：疼痛发作次数及程度均比较严重者。

随机分为2组，治疗1组60例，男31例，女29例，平均年龄(55.1±9.1)岁，平均病程(6.8±7.1)年；治疗2组60例，男28例，女32例，平均年龄(55.8±8.6)岁，平均病程(7.0±6.8)年。

2、治疗方法：

治疗1组给予5％葡萄糖注射液250ml+实施例6 20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；

治疗2组给予5％葡萄糖注射液250ml+市售注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天。

3、观察指标：每天观察2次，了解临床症状、体征、舌象、脉象及有关反应，心率、血压等一般体格检查项目，并做详细记录。用药前后各查一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，三大常规化验及心、肝、肾功能检查，常规12导联心电图。

心绞痛症状疗效评定标准按轻度、中度、分别评定：

轻度：症状消失或基本消失为显效；疼痛发作次数、程度及持续时间明显减轻为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“中度、较重度”标准)为加重。

中度：症状消失或基本消失为显效；症状减轻到“轻度”标准为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“较重度”标准)为加重。

心电图疗效评定标准：显效：心电图恢复到“大致正常”或达到“正常心电图”；有效：ST段降低，以治疗后回升0.05mv以上，但未达到正常标准，在主要导联倒置T波变浅(达25％以上者)，或T波由平坦变为直立，房室或室内传导阻滞改善者；无效：心电图基本与治疗前相同；加重：ST段较治疗前降低0.05mv以上，在主要导联倒置T波加深(达25％以上者)或直立T波变平坦，平坦T波变倒置，以及出现异位心律、房室传导阻滞或室内传导阻滞。

4、结果

实验期间未见任何不良反应。

4.1NO、NOS、SOD、MDA变化情况：见表2。

表2：治疗前后NO、NOS、SOD、MDA比较

注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较#P＜0.05。

从表2可以看出：

一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)：与治疗前相比，治疗1组的NO、NOS、SOD显著增加(P＜0.01)，治疗2组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；与治疗2组相比，治疗1组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；

丙二醛(MDA)：与治疗前相比，治疗1组的MDA显著减少(P＜0.01)，治疗2组的MDA明显减少(P＜0.05)；与治疗2组相比，治疗1组的MDA明显减少(P＜0.05)。

4.2心绞痛临床疗效比较：见表3。

表3：心绞痛疗效比较

	例数	显效	有效	无效	加重
						1组	60	18	40	2	0
2组	60	12	31	17	0

从表3可以看出：从有效来说，治疗1组的心绞痛效果明显优于治疗2组；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为96.7％，治疗2组的总有效率为71.7％，治疗1组的总有效率优于治疗2组。

4.3心电图疗效比较：见表4。

表4：心电图疗效比较

组别	例数	显效	有效	无效	加重
						1组	60	6	37	17	0
2组	60	4	28	28	0

从表4可以看出：从有效来说，治疗1组的心电图疗效有效和显效(37+6)明显优于治疗2组(28+4)；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为71.7％，治疗2组的总有效率为53.3％，治疗1组心电图疗效的总有效率优于治疗2组。

4.4动态心电图缺血性ST-T改变时间比较：见表5。

表5：动态心电图缺血性ST-T改变时间比较

组别	例数	治疗前	治疗后
				1组	60	130.69±17.40	32.33±5.26**<sup>#※</sup>
2组	60	128.52±18.21	65.42±7.87*

从表5可以看出：与治疗前相比，治疗1-2组心电图缺血性ST-T改变时间有不同程度的减少(P＜0.05，P＜0.01)；与治疗2组分别相比，治疗1组心电图缺血性ST-T改变时间明显减少(P＜0.05)。

5、实验小结：本发明提供的组合物可以治疗心绞痛，效果优于市售产品。

以上对本发明实施例所提供的一种舒血宁注射液及其制备方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种舒血宁注射液，其特征在于，所述注射液由银杏叶提取物制成，所述银杏叶提取物中总黄酮醇苷29-40％，银杏内酯7-16％，白果内酯3-5％，银杏酸小于1ppm；

所述银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

(3)加浓盐酸调节pH为4.5-5.0，4500-5000r/min离心；

(6)加入无水乙醇，使醇含量为85-88％，加入NaOH溶液调节pH为7.3-7.8，冷却静置24-36h，上清液经0 .45μm的微孔滤膜精滤，浓缩，干燥，得银杏叶提取物；

其中，所述混合溶剂中50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的体积比为5-8：1：2；

所述树脂为HPD450和S-8，二者的质量比为2-3：1；

2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述总黄酮醇苷的苷元是由组合物槲皮素、山奈素和异鼠李素组成，其重量比为1.0-1.25:1:0.4-0.75。

3.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述注射液中银杏内酯A不低于0.07mg/ml，银杏内酯B不低于0.03mg/ml，银杏内酯C不低于0.04mg/ml。

4.如权利要求1所述的舒血宁注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取所述银杏叶提取物，经0 .22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；

(2)调节pH至3.5-4.0，加热至80-85℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min；

(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7-5.0，定容，搅拌均匀；

(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0 .22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。

5.根据权利要求1所述的舒血宁注射液，其特征在于，所述注射液采用5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水注射液，稀释250ml或500ml后使用。