CN101322748B - 一种贯叶连翘总黄酮及其制剂的制备方法和质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贯叶连翘总黄酮及其制剂的制备方法和质量检测方法。本发明制备方法主要采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤，较现有技术具有热敏性成分损失小，有效成分含量稳定，产品收率与质量能得到更好的保证等优势。本发明质量检测方法能很好地控制产品的质量，并能保证产品的相关药效。本发明贯叶连翘总黄酮及其制剂用于治疗抑郁症具有很好的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种贯叶连翘总黄酮及其制剂的制备方法和质量检测方法，特别涉及一种抗抑郁贯叶连翘总黄酮及其制剂的制备方法和质量检测方法。
背景技术
抑郁症为情感性精神障碍的主要类型，是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合症。随着现代工业化进程加快以及市场经济所带来的快节奏和精神、心理等方面的压力，精神抑郁症的发病率明显增加。世界大型流行病学研究显示，抑郁症目前在世界致残性疾病中排名第四，到2020年将排名第二，仅次于心血管疾病。科学研究证实，心理因素，非心理因素都能诱发忧郁症，如帕金森氏病等躯体疾病伴发抑郁症的比例也非常高。精神抑郁症一旦发病，轻则使患者心理造成很大的痛苦，影响患者正常工作和交往，重则导致自杀，后果十分严重。
目前抗抑郁药大致分为三类：单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁剂及杂环类抗抑郁剂。单胺氧化酶抑制剂：是50年代初期最早发现的抗抑郁药，当时被广泛应用，有一定的疗效。由于有严重的毒副反应，很快被三环类抗抑郁药所取代；三环类抗抑郁剂：是当前应用最广泛的抗抑郁药。此类药物可以使心情振奋，有镇静作用，对失眠症状有一定的治疗作用，但奏效较慢，副作用明显，如口干、便秘、视物模糊、排尿困难、尿储留，少数可发生震颤或癫痫发作等；杂环类抗抑郁药对抑郁症也有一定的治疗作用，但存在引起白细胞减少、致眩晕、视力模糊、嗜睡、便秘、体重增加等副作用，另一方面皮疹也较多见，虽然对心脏的毒性较小，但偶尔也有癫痫发作等缺陷。由此可以看出，在治疗抑郁症方面，西药存在着明显的副作用等缺陷，而中药、天然药物抗抑郁制剂的开发可以避免以上的不足，在未来的市场及应用中将具有广阔的前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种贯叶连翘总黄酮；本发明的另一个目的在于提供一种贯叶连翘总黄酮及其制剂的制备方法；本发明的第三个目的在于提供一种贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法；本发明的第四个目的在于提供一种贯叶连翘总黄酮及其制剂的用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法包括如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：240-260nm；柱温：15-35℃；以乙腈为流动相A，以0.1-1.0％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，流动相中A的比例为5-25％；30～60min，流动相中A的比例由5-25％线性变化到30-50％；60～80min，流动相中A的比例由30-50％线性变化到90-100％；80～85min，流动相中A的比例由90-100％线性变化到5-25％；85～100min，流动相中A的比例为5-25％；进样量：8-12μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36-54小时的对照品适量，用70-95％甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.2-0.4mg/ml，金丝桃苷0.2-0.4mg/ml，槲皮素0.2-0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：精密量取单组分对照品溶液芦丁2-4ml，金丝桃苷2-4ml，槲皮素2-4ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的1/2-3/2，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入40-60％乙醇40-60ml，称定总量，超声处理10-20分钟，冷却至室温，再称定总量，用40-60％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液1-3ml，置10ml量瓶中，加40-60％乙醇至刻度，混匀，用0.35-0.55μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液5-15μl，注入高效液相色谱仪，即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法优选如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱Kromasil，4.6mm×254mm，5μm；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：25℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为15:85；30～60min，A-B的比例由15:85线性变化到40:60；60～80min，A-B的比例由40:60线性变化到100:0；80～85min，A-B的比例由100:0线性变化到15:85；85～100min，A-B的比例为15:85；进样量：10μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品适量，以85％甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：精密量取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法优选如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：240nm；柱温：35℃；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为10:90；30～60min，A-B的比例由10:90线性变化到50:50；60～80min，A-B的比例由50:50线性变化到95:5；80～85min，A-B的比例由95:5线性变化到10:90；85～100min，A-B的比例为10:90；进样量：12μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36小时的对照品适量，以70％甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.4mg/ml，金丝桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁2ml，金丝桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的3/2，置100ml具塞锥形瓶中精密加入40％乙醇60ml，称定总量，超声处理10分钟，冷却至室温，再称定总量，用40％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，混匀，用0.35μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法优选如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：260nm；柱温：15℃；以乙腈为流动相A，以0.8％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为20:80；30～60min，A-B的比例由20:80线性变化到30:70；60～80min，A-B的比例由30:70线性变化到90:10；80～85min，A-B的比例由90:10线性变化到20:80；85～100min，A-B的比例为20:80；进样量：8μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36小时的对照品适量，以95％甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.2mg/ml，金丝桃苷0.4mg/ml，槲皮素0.2mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁2ml，金丝桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的2/3，置100ml具塞锥形瓶中精密加入60％乙醇40ml，称定总量，超声处理20分钟，冷却至室温，再称定总量，用60％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液3ml，置10ml量瓶中，加60％乙醇至刻度，混匀，用0.55μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置。
上述HPLC指纹图谱检测的测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法包括如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，称取日用剂量的1/20-1，加甲醇5ml，超声提取10-20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-1.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以30-70：1比例的乙醇一甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，吹干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：
A、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以5-25：60-100比例的乙腈—0.1-1.0％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以25-45：40-80比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.15-0.35mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的1/2-3/2，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇40-60ml，称定重量，超声处理10-20分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本贯叶连翘总黄酮制剂每日用剂量含芦丁不得低于15-25mg，金丝桃苷不得低于8-15mg，槲皮素不得低于8-15mg，三者总含量不得低于40-60mg；
B、黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁对照品25mg，置40-60ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀；吸取上述溶液10-30ml，置40-60ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含芦丁0.10-0.30mg；
标准曲线的制备：精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加3-7％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置1-10分钟，加10％硝酸铝1ml，混匀，放置1-10分钟，加1mol/L氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置10-20分钟：以相应的溶剂为空白；照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法：精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，得吸收度A1；再精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，以1ml水代替10％硝酸铝，按上述方法制备供试品溶液，依法测定吸收度，得吸收度A2；以不加供试品的相应溶液作空白；按下式计算供试品的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；
供试品的吸收度A＝A1-A2；本贯叶连翘总黄酮制剂每日用剂量含总黄酮以芦丁干燥品计不得低于200-300mg。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂的质量检测方法优选如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，称取日用剂量的1/9，加甲醇5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以50：1比例的乙醇一甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，吹干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：
A、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以17：83比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以36：64比例的乙腈——0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的1/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本贯叶连翘总黄酮制剂每日用剂量含芦丁不得低于18.6mg，金丝桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者总含量不得低于51mg；
B、总黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含芦丁0.20mg；
标准曲线的制备：精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝1ml，混匀，放置6分钟，加1mol/L比氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟：以相应的溶剂为空白；照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法：精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，得吸收度A1；再精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，以1ml水代替10％硝酸铝，按上述方法制备供试品溶液，依法测定吸收度，得吸收度A2；以不加供试品的相应溶液作空白；按下式计算供试品的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；
供试品的吸收度A＝A1-A2；本贯叶连翘总黄酮制剂每日用剂量含总黄酮以芦丁干燥品计不得低于240mg。
本发明贯叶连翘总黄酮由常规方法制备，也可以由如下方法制成：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40—80％的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1-3次，过滤得提取液：将提取液控制温度50-70℃以下浓缩，至比重1.08—1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3-8倍重量份的石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18—1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心或过滤后上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积2—5倍：纯水用量为3—8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用3—8倍柱体积的5—20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
本发明贯叶连翘总黄酮的制备方法优选为：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6倍重量份的石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30—60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
本发明贯叶连翘总黄酮的制备方法优选为：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用5倍重量份的80％的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3倍重量份的石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心或过滤后上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
本发明贯叶连翘总黄酮的制备方法优选为：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用12倍重量份的40％的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取3次，过滤得提取液：将提取液控制温度70℃以下浓缩，至比重1.08喷雾干燥，得提取物：将提取物用8倍重量份的石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心或过滤后上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积5倍：纯水用量为3倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用8倍柱体积的20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
取上述贯叶连翘总黄酮，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的各种剂型，包括但不限于胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂、缓释剂。
上述本发明贯叶连翘总黄酮制剂中片剂由如下方法制备：得贯叶连翘总黄酮后，将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以1-3：1比例混匀，加入40-60％乙醇，制成软材，制粒，再加入常规辅料，压片，包薄膜衣，即得。
上述本发明贯叶连翘总黄酮制剂中片剂的制备方法优选为：得贯叶连翘总黄酮后，将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以1.6：1比例混匀，加入50％乙醇，制成软材，制粒，再加入羧甲基淀粉钠、硬酯酸镁，滑石粉，压片，包薄膜衣，即得。
本发明药物组合物不同制剂的日用剂量(每日服用剂量或每日使用剂量)因制剂不同而不同，但不同制剂的日用剂量中含相当生药材量相同。本发明质量检测方法以日用剂量为计量单位。
本发明所述重量份与体积份的关系为克/毫升。
本发明贯叶连翘总黄酮及其制剂用于治疗抑郁症、焦虑或烦躁不安。
本发明贯叶连翘总黄酮制剂临床药效学实验证实：可明显对抗小鼠行为绝望及获得性无助；失望和不动行为时间明显缩短，表明有抗抑郁的作用；可明显抑制利血平效应引起的小鼠体温降低、眼睑下垂及自主活动减少，显著增加脑内5—HT、NE的含量；对化学刺激有明显的保护作用；可轻度减缓心率；同时还可拮抗安钠咖，起到镇静催眠及镇痛的作用，表明对抑郁症有明确的治疗作用。本发明贯叶连翘总黄酮制剂通过一、二期临床证实，治疗早期抑郁症有效率93％以上。
本发明制备方法主要采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤，将提取物用石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物；使用石油醚或正已烷脱脂，主要用于除去工艺中极性很小的脂溶性成分以保证乙酸乙脂萃取后，所含有效成分金丝桃素、槲皮素类成分的含量，同时使其所含金丝桃素、槲皮素类成分能充分地溶出，保证进一步纯化分离的效果。本发明制备方法较现有技术具有热敏性成分损失小，有效成分含量稳定，产品收率与质量能得到更好的保证等优势。
采用本发明质量检测方法对本发明贯叶连翘总黄酮制剂进行检测，结果显示出能很好地控制产品的质量，并能保证产品的相关药效。
附图说明：
图1：混合对照品的HPLC色谱图
图2：本发明贯叶连翘总黄酮片剂样品的HPLC色谱图
下述实验例和实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明.
实验例1HPLC指纹图谱实验
(一)仪器和材料：
DIONEX高效液相系统(P680HPLC Pμmp，ASI-100Aμtomated Sample Injector，Thermostatted Colμmn Compartment TCC-100，MVD170M)，电子天平(SartoriμsCP225D)、微孔滤膜(0.45μm)、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯、水为双蒸水，金丝桃苷(hyperoside)对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：1521-200202)、芦丁(rμtin)对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：100080-200306)、槲皮素(qμercetin)对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：0211050702)。本发明贯叶连翘总黄酮片剂样品由武汉健民中药工程有限责任公司提供，其批号见表1。
表1不同批次样品来源
(二)实验方法
色谱条件：汉邦C18色谱柱(Kromasil，4.6mm×254mm，5μm)；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：25℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，(A+B＝100％)，梯度洗脱，0～30min，A-B的比例为15:85，30～60min，A-B的比例由15:85线性变化到40:60，60～80min，A-B的比例由40:60线性变化到100:0，80～85min，A-B的比例由100:0线性变化到15:85，85～100min，A-B的比例为15:85；进样量：10μl。(见表2)
表2流动相线性梯度
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品适量，用甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml.
混合对照品溶液制备：精密量取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取本发明贯叶连翘总黄酮片剂15片，除去薄膜衣，研细，混匀，精密称取1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，密塞，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
样品分析：将10个不同批次的本发明贯叶连翘总黄酮片剂制成供试品溶液，按以上色谱条件进行分析，得各样品的HPLC图谱。同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置。
(三)实验结果
1、相对保留值指纹图谱的建立：根据公式和混合对照品，样品的HPLC色谱图(见图1和图2)计算各样品色谱峰的α值(α值为各组分色谱峰的保留时间与内参照峰的保留时间之比)相同(误差≤1％)，即可认为同一化合物，将各个样品每个峰的RA值(RA值是以峰面积总和最大的样品的总峰面积为分母，样品中各色谱峰面积为分子，计算得到各色谱峰的相对面积值。)列于相应的α值项下，得到相对保留值指纹图谱，见表3。
表3不同批次样品的HPLC相对保留值指纹图谱
根据表3结果可知：HPLC指纹图谱检测结果共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰，各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。共有峰的检出率≥75％。
2、样品之间的相似性：将10个批次的本发明贯叶连翘总黄酮片剂样品计算两两之间的峰重叠率并列表，组成反映样品间相似性的峰重叠率矩阵，该矩阵成为对称矩阵，见表4。
表4不同批次样品HPLC峰重叠率(％)
根据表4结果可知：10个批次的样品的HPLC指纹峰重叠率均在75％以上，大多数重叠率在85％以上，表明相似性较好。
3、特征指纹峰：每个样品均选出其中峰面积最大的4个峰排列成表，得10个样品的4强峰表，10批样品中均出现此4强峰，相对保留值a分别为0.900、1.000、1.100、2.300，故规定这4强峰，即第2，3，4，7个峰为本发明贯叶连翘总黄酮片剂的特征指纹峰(见表5)。将不同批次样品中芦丁，金丝桃苷和槲皮素的含量数值列于表6，以规定期间的相关性。
表5不同批次样品的HPLC4强峰
表6不同批次样品中芦丁，金丝桃苷和槲皮素含量(mg/片，片重0.3g)
由表5、表6可以看出：特征指纹峰的检出率为100％，共有峰的检出率≥75％，故含量测定中以芦丁、金丝桃苷、槲皮素为指标，具有很好的代表性，确实能控制本发明贯叶连翘总黄酮片剂的质量。
4、特征指纹峰的相似率和差异率
(1)特征指纹峰的相似率：不同批次本发明贯叶连翘总黄酮片剂的特征指纹峰的相似率(每批均以相对保留值a由小到大的顺序排列)见表7。
表7不同批次样品的特征指纹峰的相似率
表7表明十批样品的特征指纹峰相似率的平均值分别为0.93、0.98、0.99、0.97，特征指纹峰的相似度很好。进一步说明特征指纹峰选择比较合理，能将本发明贯叶连翘总黄酮片剂的特征性表达出来。
(2)特征指纹的差异率：不同批次本发明贯叶连翘总黄酮片剂的特征指纹峰的差异率(每批均以相对保留值a由小到大的顺序排列)见表8。
表8不同批次样品的特征指纹峰的差异率
由表8可知特征指纹峰的差异率较少，进一步阐述了特征指纹峰选择的合理性。
(四)结论
本次试验选定金丝桃苷为内参照峰。由以上数据可以看出不同批次本发明贯叶总黄酮片剂的峰重叠率高，特征指纹峰检出率为100％；不同批次本发明贯叶总黄酮片剂特征指纹峰的相似率均在0.9—1.0之间，说明它们的相似性好；不同批次本发明贯叶总黄酮片剂特征指纹峰的差异率小。综合上述试验数据，可以知道本发明贯叶总黄酮片剂HPLC指纹图谱能有效的实施生产上的在线控制，保证不同批次产品质量的稳定一致。
实验例2本发明贯叶总黄酮制剂的药效学实验
一、对利血平致小鼠抑郁模型的影响实验
试验材料
1、药物本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶连翘总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，20mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；利血平注射液，上海医科大学红旗制药厂生产，批号：970505。试验时以上药物均配成所需浓度。去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、磷酸二氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸四钠(EDTA)、辛烷磺酸钠均为Sigma产品；乙腈(ACN)为Fisher产品、甲醇、高氯酸、焦亚硫酸钠及其它试剂均为国产AR级。水为超纯水。
2、动物ICR种小鼠，72只，雌雄各半，18-22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
3、仪器超速离心机(日本HITACHI55P-72)；16通道Coμlarray电化学高效液相色谱仪及色谱工作站，580泵，5200A电化学检测器，542自动进样器，美国ESA公司产品。Waters，SymmetryC18柱子(3.9mm×150mm，3.5μm)。
4、色谱条件流动相组成：磷酸二氢钠6.21g，柠檬酸2.4g，加入0.25ml100μM的EDTA水溶液，溶解于约300ml超纯水中。上述溶液以0.2μm水系膜过滤。滤过液中加入辛烷基磺酸钠0.184g及乙腈50ml。超纯水定容到500ml。流动相流速：0.6ml/min，工作电极1:-150mV，工作电极2：450mV，工作电极3：500mV，工作电极4：550mV。
5、标准液的配制以0.1mol/L高氯酸配标准品作为储备液(100μg/ml)-80℃冰箱中保存。将储备液稀释至10μg/ml作为稀释液。将稀释液配成系列浓渡作为标准液。用0.15mol/L的高氯权(含0.04％焦亚硫酸钠和0.04％EDTA)作为工作
表9对小鼠脑内NE及5-HT、5-HIAA含量的影响(X±SD)
注：与对照组比较：##P<0.001；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
结果表明，在本实验条件下，标准品的浓度在0-600ng/ml范围内与峰面积之间有良好的线性关系。与对照组比较，小鼠皮下注射利血平后，中枢单胺类递质耗竭，NE、5-HT等含量显著降低(p<0.01)，5-HIAA含量有所升高；与模型组比较，盐酸氟西汀组5-HT含量显著增加；本发明贯叶连翘总黄酮片剂三个剂量组NE含量均有明显增加(p<0.05)；其中60mg/kg组5-HT含量亦显著增加(p<0.01)，30mg/kg、15mg/kg组有增加趋势；表明本发明贯叶连翘总黄酮片剂可明显抑制利血平化效应引起的小鼠眼睑下垂及自主活动减少，显著增加脑内NE、5-HT的含量，对抑郁症有治疗作用。
二、对小鼠失望和不动行为的影响实验
(一)试验材料
药物：本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶连翘总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，200mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；试验时以上药物均配成所需浓度。动物ICR种小鼠，130只，雌雄各半，18-22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
(二)实验方法
1、小鼠游泳绝望实验
动物放入水深10cm、直径16cm的桶内，水温保持在25℃。小鼠在游泳一段时间后因“失望”而漂浮不动，筛选出6min内不动时间在70-160s的小鼠，随机分为5组，每组12只：对照组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组。按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，未次给药后60min同上法测定小鼠的不动时间。结果进行统计学处理。
2、小鼠悬尾实验
小鼠随机分为5组，每组14只：对照组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组。按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，末次给药后60min将小鼠尾端1cm的部位贴在自制木盒上，头朝下，使小鼠前后左右均无攀抓的地方，一段时间后小鼠因失望而活动减少，记录小鼠的不动时间。结果进行统计学处理。
(三)实验结果
1、对小鼠游泳绝望的影响
小鼠在初放入水桶内时，拼命游泳并试图爬上桶壁，一段时间后，动物活动减弱，活动之间有较长时间的不动间歇，表现为身体微曲，保持垂直姿势，鼻孔露出水面，并且间歇时间越来越长。与对照组比较，氟西汀组小鼠6min内不动时间明显缩短(p<0.05)，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg、30mg/kg小组小鼠6min内不动时间也明显缩短(p<0.05)，结果见表10。表明该药有抗抑郁作用。
表10对小鼠游泳绝望的影响(X±SD)
注：与对照组比较：*p<0.05
2、对小鼠悬尾不动时间的影响
与对照组比较，氟西汀组小鼠6min内不动时间明显缩短(p<0.01)，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg、30mg/kg组小鼠6min内不动时间也明显缩短(p<0.05～0.01).见表11。表明该药有抗抑郁作用。
表11对小鼠悬尾不动时间的影响(X±SD)
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
三、对小鼠获得性无助模型的影响实验
(一)试验材料
药物
本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶连翘总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，20mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；
动物
ICR种小鼠，50只，雌雄各半，18—22g，由北京维通利华试验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK—11—00—0008。
仪器
跳台程序自动控制仪(TT—28型)中国医学科学院药物研究所生产。
(二)试验方法
动物随机分为5组，每组10只：对照组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组，盐酸氟西汀5mg/kg组。
动物按20ml/kg体积灌胃给药，对照组给予等量蒸馏水，每日一次，连续21日，试验当日动物放入一底部装有电流38V网栅的盒中，刺激10s，休息20s，30min内刺激10次，盒中无可逃避的环境，经处理后动物灌胃给予所试药物，60min后如上法再进行试验，但盒中放置可供动物逃避的平台，记录10s内不会跳上平台的动物数，结果进行统计学处理。
(三)试验结果
对照组经无法逃避的电刺激处理后，在随后的可逃避条件下有86％小鼠表现为获得性无助，嘶叫、挣扎、跳跃，但不会跳上平台；盐酸氟西汀组有65％表现为获得性无助，与对照组比较发生率显著降低(P<0.01)；本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg、30mg/kg也有减轻获得性无助的作用，与模型组比较有明显差异(P<0.05～0.01)；见表12。说明给小鼠灌胃本发明贯叶连翘总黄酮片剂后，可反转获得性无助的发生，表明该药对抑郁症有预防作用。
表12对小鼠获得性无助的影响(X2检验)
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
四、对安钠咖兴奋作用的影响实验
(一)试验材料
1、药物本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶金丝桃总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，20mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；安钠咖注射液，2ml:无水咖啡因0。24g，苯甲酸0.26g，上海信谊药厂生产，批号：950501。
2、动物ICR种小鼠，72只，雌雄各半，18—22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
3、仪器小鼠自主活动测定仪：型号Qh-1，清华大学生产。
(二)实验方法
动物随机分为6组，每组12只：对照组，模型组，氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂10g生药/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂5g生药/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂2.5g生药/kg组。
动物按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，末次给药后60min腹腔注射5-THP(10ml/kg)，记录20min内各组出现震颤的动物数，结果进行统计学处理。
(三)实验结果
腹腔注射安钠咖20min后，模型组小鼠躁动，嘶叫，自主活动次数显著多于对照组(P<0.01)；氟西汀组及本发明贯叶连翘总黄酮片剂三个剂量组小鼠自主活动次数与模型组比较也明显减少(P<0.05～0.01)，见表13。说明本发明贯叶连翘总黄酮片剂可拮抗安钠咖，显著减少安钠咖所致小鼠自主活动增加，表明该药有抑制大脑皮层兴奋的作用。
表13对小鼠自主活动的影响(X±SD)
注：与对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
五、对小鼠睡眠的影响实验
(一)试验材料
药物本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶金丝桃总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，20mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；试验时以上药物均配成所需浓度，戊巴比妥钠，化学纯，佛山市化工实验厂分装，批号：860901。
动物ICR种小鼠，60只，雌雄各半，18—22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
(二)实验方法
动物随机分为5组，每组12只：对照组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂15mg/kg组。
动物按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，末次给予开郁宁片后60min腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)，动物翻正反射消失为入睡时间，从入睡至恢复翻正反射为睡眼时间，记录结果进行统计学处理。
(三)实验结果
与空白对照比较，对照药氟西汀有明显延长小鼠睡眠时间的作用(P<0.01)，但无延长入睡时间的作用；本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg剂量可明显延长小鼠的睡眼时间(P<0.05).。提示该药有一定的镇静作用。
表14对戊巴比妥钠的协同作用(X±SD)
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
六、对小鼠脑内单胺氧化酶的影响实验
(一)试验材料
药物本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶金丝桃总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；吗氯贝胺片(商品名：朗天)，150mg/粒，上海信谊百路达药业有限公司生产，批号：D000401；L-5-羟色胺酸，Sigma公司产品，试验当天配成20mg/ml。考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，单胺氧化酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。
动物ICR种小鼠，115只，雌雄各半，18—22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
(二)实验方法
1、对L-5羟色胺酸(5-HTP)所致小鼠震颤的影响
动物随机分为5组：对照组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂15mg/kg组。
动物按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，末次给予药物后60min腹腔注射5-HTP(200mg/kg)，记录20min后小鼠出现震颤的只数，结果进行统计学处理(X2检验)。
2、对小鼠脑内MAO活性的影响
动物随机分为5组：对照组，吗氯贝胺50mg/kg组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂15mg/kg组。
动物按20ml/kg体积灌胃给药，每日一次，连续21日，末次给药后60min小鼠断头、取脑，立即加入9倍冰冷的生理盐水，匀浆器匀浆15s(11000转/min)，离心机离心(4℃，3000rpm)，取上清测定蛋白含量(双缩尿法)及单胺氧化酶活性(比色法)。结果进行统计学处理(t检验)。
(三)试验结果
1.对L-5羟色胺酸所致小鼠震颤的影响
表15对L-5羟色胺酸所致小鼠震颤的影响
注：与对照组比较：**P<0.01
腹腔注射5-THP后20min内，对照组小鼠略显懒动，肢体未出现震颤；吗氯贝胺片组小鼠10只均在20min内出现晃头、后肢外展、全身震颤等症状；本发明贯叶连翘总黄酮片剂三个剂量组也有部分动物出现了晃头、震颤等表现，但幅度小于码氯贝胺片组小鼠，其中60mg/kg组呈阳性反应的动物最多，与对照组比较有显著性差异(P<0.01).
2.对小鼠脑内MAO活性的影响
灌胃给药21天后，与对照组比较，吗氯贝胺片组小鼠脑内MAO活性显著降低(P<0.01)，开郁宁片60mg/kg组亦有相同作用(P<0.01)。见表16。表明本发明贯叶连翘总黄酮片剂可引起小鼠刻板行为，经小鼠脑内MAO活性测定显示开郁宁片可显著降低小鼠脑内MAO活性，与吗氯贝胺片有相似的作用。
表16对小鼠脑内MAO活性的影响(X±SD)
注：与对照组比较：**P<0.01
七、镇痛作用实验
(一)试验材料
药物：本发明贯叶连翘总黄酮片剂，每片含贯叶金丝桃总黄酮150mg，北京大学中医药现代研究中心提供，批号：20000901；盐酸氟西汀胶囊(商品名：奥麦伦)，20mg/粒，上海中西药业股份有限公司生产，批号：001001；试验时以上药物均配成所需浓度；盐酸哌替啶，50mg/ml，批号：940428，试验时生理盐水配成0.5mg/ml；冰乙酸，北京化工厂，批号901212。
动物：ICR种小鼠，120只，雌雄各半，18—22g，由北京维通利华实验动物技术发展有限公司提供，合格证号：SCXK-11-00-0008。
(二)实验方法
1.小鼠醋酸刺激法
动物随机分为5组，每组12只：对照组，盐酸氟西汀5mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂30mg/kg组，本发明贯叶连翘总黄酮片剂15mg/kg组。
动物灌胃(20ml/kg)给药21日，末次给药后60min腹腔注射0.6％醋酸(10ml/kg)，观察10min内动物扭体次数，以腹部收缩内陷、躯体扭曲、后肢伸展及蠕行等为阳性反应。结果进行统计学处理(t检验)
1、小鼠尾电刺激法
动物随机分为6组，每组10只：对照组，盐酸哌替啶13mg/kg组，盐酸氟西汀5mg/kg组，开郁宁片60mg/kg组，开郁宁片30mg/kg组，开郁宁片15mg/kg组。
动物灌胃(20ml/kg)给药每日一次，连续21天，按文献方法，分别在药后30、60min进行电刺激。记录各组不引起嘶叫的动物数，求出各组镇痛百分率，进行组间比较(X2检验)。
(三)实验结果
小鼠醋酸刺激法实验结果证实，与对照组比较，氟西汀组扭体次数显著减少，疼痛反应显著减轻(P<0.01)；本发明贯叶连翘总黄酮片剂60mg/kg、30mg/kg扭体次数也显著减少(P<0.01)，有明显的止痛作用。
表17对小鼠醋酸所致疼痛的影响(X±SD)
注：与对照组比较：**P<0.01
实验例3本发明贯叶总黄酮制剂的制备工艺筛选实验
一、热敏性成分损失小的对比实验
由于金丝桃素、槲皮素类成分遇热很不稳定，水溶性很小，工艺中使用大孔树脂进行纯化，一方面以上成分水溶性很小，另一方面将提取物用水加热溶解，工艺中加热时温度很高通常90℃以上，如以金丝桃素为指标，进行浓缩试验：温度高于60℃时为0.2％，当温度低于60℃以下时为0.35％，如果作为提取物后者是合格的，而前者是不合格的。为了证实工艺中相关有效成分的损失程度，本发明进行了如下对比试验，1、称取50克贯叶连翘提取物，直接加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，2、称取50克贯叶连翘提取物、脱脂、乙酸乙脂萃取后，加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，所得大孔洗脱部分与乙酸乙脂萃取部分混合后干燥、检测。相关结果见表18。
表18热敏性成分损失小的对比实验
通过以上试验检测证实，脱脂、萃取后所含金丝桃素、槲皮素类成分明显高于直接水溶纯化后含量，而直接水溶部分金丝桃素含量很少或不含，总黄酮类成分明显低于乙酸乙脂进行萃取后纯化部分的含量。
二、有效成分含量稳定的对比实验
提取物中金丝桃素、槲皮素类成分是不稳定性成分，水溶性很小，而工艺中黄酮类另一成分芦丁，贯叶金丝桃苷在水中溶解性较好，在工艺中使用大孔树脂进行纯化，能将其进行纯化分离，用水加热溶解时通常较高的温度对其影响不是很大。通过脱脂、萃取后有利于以上成分的溶出，通常所含金丝桃素、槲皮素受高温影响而被分解、氧化而破坏，随着时间的延长，损耗会越来越多，从而影响药效，而使用乙酸乙脂可以避免以上的不足，并将其充分提取出来，从而保证了产品收率与质量。因此有必要对其进行分开提取，为了证实以上理论的可行性，特进行相关试验如下：1、称取50克贯叶连翘提取物，直接加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，2、称取50克贯叶连翘提取物、脱脂、乙酸乙脂萃取后，加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，所得大孔洗脱部分与乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品、分别对以上所得提取物进行检测，并计算收率。结果见表19。
表19有效成分含量稳定的对比实验
通过以上试验及检测证实，采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤的纯化方法所得到的金丝桃素、槲皮素类成分明显高于现有技术，而芦丁、贯叶金丝桃苷黄酮类成分含量也有所提高，且总黄酮与产品收率明显提高。
三、产品收率高的对比实验
称取五个批号的提取物分别进行对比试验，1、每个批号称取50克贯叶连翘提取物，直接加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，2、每个批号称取50克贯叶连翘提取物、脱脂、乙酸乙脂萃取后，加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，所得大孔洗脱部分与乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品，并计算收率。结果见表20。
表20产品收率高的对比实验
通过比试验证实，与现有技术相比，采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤的方法所得到的提取物收率明显提高，且质量得到有效的保证。
四、产品质量好的对比实验
本发明以产品所含总黄酮为检测指标，称取五个批号的提取物分别与现有工艺(即未采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤的方法)进行对比试验，1、每个批号称取50克贯叶连翘提取物，直接加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，2、每个批号称取50克贯叶连翘提取物、脱脂、乙酸乙脂萃取后，加热、水溶解放冷后过大孔吸附脂，所得大孔洗脱部分与乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品，并计算总黄酮含量。结果见表21。
表21产品质量好的对比实验
从有效部位新药研发的角度来看，以总黄酮为指标，可以看出直接水溶后纯化即未采用脱脂及乙酸乙脂萃取等步骤的方法，所得到有效部位部分批号是不合格的，因此工艺得不到有效的保证，而采用本发明工艺(脱脂萃取后水溶纯化方法)所生产出来的产品，所含的总黄酮均是合格的，因采用本发明工艺所得的产品质量明显优于现有工艺。
下述实施例均可实现上述实验例的效果
具体实施方式
实施例1：
常规方法制备得贯叶连翘总黄酮颗粒剂，进行HPLC指纹图谱检测：
色谱条件：汉邦C18色谱柱Kromasil，4.6mm×254mm，5μm；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：25℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为15:85；30～60min，A-B的比例由15:85线性变化到40:60；60～80min，A-B的比例由40:60线性变化到100:0；80～85min，A-B的比例由100:0线性变化到15:85；85～100min，A-B的比例为15:85；进样量：10μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品，用85％的甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml混合，加85％的甲醇稀释到10ml备用；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮颗粒剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液2ml用50％乙醇定容至10ml，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
实施例2：
贯叶连翘全草1kg粉碎后，用5kg的80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心后上聚苯乙烯类弱极性大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的速崩片；
HPLC指纹图谱检测；色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：240nm；柱温：15℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为10:90；30～60min，A-B的比例由10:90线性变化到50:50；60～80min，A-B的比例由50:50线性变化到95:5；80～85min，A-B的比例由95:5线性变化到10:90；85～100min，A-B的比例为10:90；进样量：12μl；对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36小时的对照品，用70％的甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.4mg/ml，金丝桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁2ml，金丝桃苷4ml，槲皮素2ml混合，加95％的甲醇稀释到12ml备用；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮速崩片，研细，混匀，精密称取日用剂量的3/2，置100ml具塞锥形瓶中精密加入40％乙醇60ml，称定总量，超声处理10分钟，冷却至室温，再称定总量，用60％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液1ml用40％乙醇定容至15ml，混匀，用0.4μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
实施例3：
贯叶连翘全草1kg切段后，用8kg的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯类中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30—60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以1.6：1比例混匀，加入50％乙醇，制成软材，制粒，再加入羧甲基淀粉钠、硬酯酸镁，压片，包薄膜衣，即得薄膜衣片；
HPLC指纹图谱检测；色谱条件：汉邦C18色谱柱Kromasil，4.6mm×254mm，5μm；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：25℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为15:85；30～60min，A-B的比例由15:85线性变化到40:60；60～80min，A-B的比例由40:60线性变化到100:0；80～85min，A-B的比例由100:0线性变化到15:85；85～100min，A-B的比例为15:85；进样量：10μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品，用85％的甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml混合，加85％的甲醇稀释到10ml备用；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮薄膜衣片，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液2ml用50％乙醇定容至10ml，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055；
质量检测方法：
鉴别：取贯叶连翘总黄酮薄膜衣片日用剂量的5/3，除去薄膜衣，研细，混匀，称取日用剂量的1/9，加甲醇5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以50：1比例的乙醇一甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，吹干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：
A、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以17：83比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以36：64比例的乙腈——0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮薄膜衣片，除去薄膜衣，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本贯叶连翘总黄酮薄膜衣片每日用剂量含芦丁不得低于18.6mg，金丝桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者总含量不得低于51mg；
B、黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含芦丁0.20mg；
标准曲线的制备：精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝1ml，混匀，放置6分钟，加1mol/L比氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟：以相应的溶剂为空白；照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法：精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，得吸收度A1；再精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，以1ml水代替10％硝酸铝，按上述方法制备供试品溶液，依法测定吸收度，得吸收度A2；以不加供试品的相应溶液作空白；按下式计算供试品的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；
供试品的吸收度A＝A1-A2；本贯叶连翘总黄酮薄膜衣片每日用剂量含总黄酮以芦丁干燥品计不得低于240mg。
实施例4：
贯叶连翘全草1kg粉碎后，用12kg的40％的甲醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取3次，过滤得提取液：将提取液控制温度70℃以下浓缩，至比重1.08喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类弱极性大孔树脂，流速为柱体积5倍：纯水用量为3倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用8倍柱体积的20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的胶囊剂；
HPLC指纹图谱检测；色谱条件：汉邦C18色谱柱Kromasil，4.6mm×254mm，5μm；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：35℃；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为10:90；30～60min，A-B的比例由10:90线性变化到50:50；60～80min，A-B的比例由50:50线性变化到95:5；80～85min，A-B的比例由95:5线性变化到10:90；85～100min，A-B的比例为10:90；进样量：12μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品，用85％的甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml混合，加85％的甲醇稀释到10ml备用；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮胶囊剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液2ml用50％乙醇定容至10ml，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055；
质量检测方法：
含量测定：
A、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以17：83比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以36：64比例的乙腈——0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮胶囊剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本贯叶连翘总黄酮胶囊剂每日用剂量含芦丁不得低于18.6mg，金丝桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者总含量不得低于51mg；
B、黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含芦丁0.20mg；
标准曲线的制备：精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝1ml，混匀，放置6分钟，加1mol/L比氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟：以相应的溶剂为空白；照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法：精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，得吸收度A1；再精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，以1ml水代替10％硝酸铝，按上述方法制备供试品溶液，依法测定吸收度，得吸收度A2；以不加供试品的相应溶液作空白；按下式计算供试品的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；
供试品的吸收度A＝A1-A2；本贯叶连翘总黄酮胶囊剂每日用剂量含总黄酮以芦丁干燥品计不得低于240mg。
实施例5：
贯叶连翘全草1kg切段后，用5kg的80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类中极大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以2：1比例混匀，加入45％乙醇，制成软材，制粒，再加入羧甲基淀粉钠、微粉硅胶，压片，包薄膜衣，即得分散片；
HPLC指纹图谱检测；色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：260nm；柱温：15℃；以乙腈为流动相A，以0.8％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为20:80；30～60min，A-B的比例由20:80线性变化到30:70；60～80min，A-B的比例由30:70线性变化到90:10；80～85min，A-B的比例由90:10线性变化到20:80；85～100min，A-B的比例为20:80；进样量：8μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36小时的对照品，用95％的甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.4mg/ml，金丝桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁2ml，金丝桃苷4ml，槲皮素2ml混合，加70％的甲醇稀释到12ml备用；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮分散片，研细，混匀，精密称取日用剂量的1/2，置100ml具塞锥形瓶中精密加入60％乙醇40ml，称定总量，超声处理20分钟，冷却至室温，再称定总量，用40％乙醇补足减失的总量，过滤，取续滤液3ml用40％乙醇定容至15ml，混匀，用0.4μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055；
质量检测方法：
鉴别：取贯叶连翘总黄酮分散片日用剂量的5/3，除去薄膜衣，研细，混匀，称取日用剂量的1/9，加甲醇5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以50：1比例的乙醇—甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，吹干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例6：
贯叶连翘全草1kg粉碎后，用8kg的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30—60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与植物油以1：2比例混匀，以明胶加入适量甘油、着色剂为软胶囊壳、用软胶囊机压制成软胶囊；
含量测定：
A、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以17：83比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以36：64比例的乙腈——0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮软胶囊，除去囊壳，混匀，精密称取日用剂量的10/6，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本贯叶连翘总黄酮软胶囊每日用剂量含芦丁不得低于18.6mg，金丝桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者总含量不得低于51mg；
B、黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含芦丁0.20mg；
标准曲线的制备：精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝1ml，混匀，放置6分钟，加1mol/L比氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟：以相应的溶剂为空白；照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；
测定法：精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，得吸收度A1；再精密量取高效液相色谱法中的供试品溶液1ml，以1ml水代替10％硝酸铝，按上述方法制备供试品溶液，依法测定吸收度，得吸收度A2；以不加供试品的相应溶液作空白；按下式计算供试品的吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；
供试品的吸收度A＝A1-A2；本贯叶连翘总黄酮软胶囊每日用剂量含总黄酮以芦丁干燥品计不得低于240mg。
实施例7：
贯叶连翘总黄酮由以下方法制成缓释胶囊剂后，进行如下质量检测：
贯叶连翘全草1kg切段后，用10kg的70％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类中极大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以2：1比例混匀，加入45％乙醇，制成软材，制粒，所得颗粒包缓释蔳薄膜衣后，加入适量硬脂酸镁填充胶囊，即得缓释胶囊；
鉴别：取贯叶连翘总黄酮缓释胶囊剂日用剂量的5/3，研细，混匀，称取日用剂量的1/9，加甲醇5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以50：1比例的乙醇一甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，吹干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定为芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：测定芦丁、金丝桃苷以17：83比例的乙腈—0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000：测定槲皮素以36：64比例的乙腈——0.5％磷酸水溶液为流动相，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/分钟，检测波长为254nm；
对照品溶液的制备：`精密称取60℃真空干燥3小时的芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮缓释胶囊剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本贯叶连翘总黄酮胶囊剂每日用剂量含芦丁不得低于18.6mg，金丝桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者总含量不得低于51mg。
实施例8：
贯叶连翘全草1kg切段后，用5kg的80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类弱极性大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的颗粒剂。
实施例9：
贯叶连翘全草1kg粉碎后，用12kg的40％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取3次，过滤得提取液：将提取液控制温度70℃以下浓缩，至比重1.08喷雾干燥，得提取物：将提取物用8kg的正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类中极大孔树脂，流速为柱体积5倍：纯水用量为3倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用8倍柱体积的20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以2.5：1比例混匀，加入55％乙醇，制成软材，制粒，再加入常规辅料，压片，包薄膜衣，即得片剂。
实施例10：
贯叶连翘全草1kg切段后，用8kg的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30—60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮；将贯叶连翘总黄酮与微晶纤维素以1.6：1比例混匀，加入50％乙醇，制成软材，制粒，再加入羧甲基淀粉钠、硬酯酸镁，滑石粉，压片，包薄膜衣，即得片剂。
实施例11：
贯叶连翘全草1kg切段后，用5kg的80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1次，过滤得提取液：将提取液控制温度50℃以下浓缩，至比重1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类弱极性大孔树脂，流速为柱体积2倍：纯水用量为8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用5倍柱体积的5％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮。
实施例12：
贯叶连翘全草1kg粉碎后，用12kg的40％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取3次，过滤得提取液：将提取液控制温度70℃以下浓缩，至比重1.08喷雾干燥，得提取物：将提取物用8kg的正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，过滤后上聚苯乙烯类中极大孔树脂，流速为柱体积5倍：纯水用量为3倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用8倍柱体积的20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30—60％浓度的乙醇洗脱，并收集30—60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮。
实施例13：
贯叶连翘全草1kg切段后，用8kg的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6kg的石油醚脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30—60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空干燥，得贯叶连翘总黄酮。
Claims (9)
1.一种贯叶连翘总黄酮，其特征在于该贯叶连翘总黄酮是由如下方法制备的：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40-80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1-3次，过滤得提取液：将提取液控制温度50-70℃以下浓缩，至比重1.08-1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3-8倍重量份的石油醚或正己烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18-1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心或过滤后上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积2-5倍：纯水用量为3-8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用3-8倍柱体积的5-20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30-60％浓度的乙醇洗脱，并收集30-60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
2.如权利要求1所述的贯叶连翘总黄酮，其特征在于该贯叶连翘总黄酮是由如下方法制备的：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6倍重量份的石油醚或正己烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30-60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
3.如权利要求1-2任一所述的贯叶连翘总黄酮制成的制剂，其特征在于取贯叶连翘总黄酮，加入常规辅料，按照常规工艺，制备成临床接受的胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂或缓释剂。
4.如权利要求3所述的贯叶连翘总黄酮制成的制剂的质量检测方法，其特征在于包括如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：240-260nm；柱温：15-35℃；以乙腈为流动相A，以0.1-1.0％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，流动相中A的比例为5-25％；30～60min，流动相中A的比例由5-25％线性变化到30-50％；60～80min，流动相中A的比例由30-50％线性变化到90-100％；80～85min，流动相中A的比例由90-100％线性变化到5-25％；85～100min，流动相中A的比例为5-25％；进样量：8-12μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36-54小时的对照品适量，用70-95％甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.2-0.4mg/ml，金丝桃苷0.2-0.4mg/ml，槲皮素0.2-0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：精密量取单组分对照品溶液芦丁2-4ml，金丝桃苷2-4ml，槲皮素2-4ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的1/2-3/2，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入40-60％乙醇40-60ml，称定总量，超声处理10-20分钟，冷却至室温，再称定总量，用40-60％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液1-3ml，置10ml量瓶中，加40-60％乙醇至刻度，混匀，用0.35-0.55μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液5-15μl，注入高效液相色谱仪，即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
5.如权利要求4所述的贯叶连翘总黄酮制成的制剂的质量检测方法，其特征在于包括如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱Kromasil，4.6mm×254mm，5μm；Dikma预保护柱；检测波长：254nm；柱温：25℃；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为15∶85；30～60min，A-B的比例由15∶85线性变化到40∶60；60～80min，A-B的比例由40∶60线性变化到100∶0；80～85min，A-B的比例由100∶0线性变化到15∶85；85～100min，A-B的比例为15∶85；进样量：10μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥48小时的对照品适量，以85％甲醇溶解，各组分浓度分别为芦丁0.3mg/ml，金丝桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：精密量取单组分对照品溶液芦丁3ml，金丝桃苷3ml，槲皮素3ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的10/9，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定总量，超声处理15分钟，冷却至室温，再称定总量，用50％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
6.如权利要求4所述的贯叶连翘总黄酮制成的制剂的质量检测方法，其特征在于包括如下HPLC指纹图谱：
色谱条件：汉邦C18色谱柱；Dikma预保护柱；检测波长：240nm；柱温：35℃；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，A与B浓度之和为100％，进行梯度洗脱；0～30min，A-B的比例为10∶90；30～60min，A-B的比例由10∶90线性变化到50∶50；60～80min，A-B的比例由50∶50线性变化到95∶5；80～85min，A-B的比例由95∶5线性变化到10∶90；85～100min，A-B的比例为10∶90；进样量：12μl；
对照品溶液制备：单组分对照品溶液制备：精密量取经五氧化二磷干燥36小时的对照品适量，以70％甲醇溶解，制成浓度分别为芦丁0.4mg/ml，金丝桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合对照品溶液制备：取单组分对照品溶液芦丁2ml，金丝桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取贯叶连翘总黄酮制剂，研细，混匀，精密称取日用剂量的3/2，置100ml具塞锥形瓶中精密加入40％乙醇60ml，称定总量，超声处理10分钟，冷却至室温，再称定总量，用40％乙醇补足减失的总量，过滤，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加40％乙醇至刻度，混匀，用0.35μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪即得HPLC图谱；同时用对照品溶液进样，确定芦丁，金丝桃苷和槲皮素的出峰位置；测定结果为：共计8个共有峰，其中第3个峰为金丝桃苷内参照峰，第2、3、4、7个峰为特征指纹峰；各个峰的相对保留时间依次分别为0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相对峰面积比依次分别为0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。
7.如权利要求1-2任一所述的贯叶连翘总黄酮在制备治疗抑郁症的药物中的应用。
8.一种贯叶连翘总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40-80％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取1-3次，过滤得提取液：将提取液控制温度50-70℃以下浓缩，至比重1.08-1.15喷雾干燥，得提取物：将提取物用3-8倍重量份的石油醚或正己烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.18-1.32，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，离心或过滤后上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积2-5倍：纯水用量为3-8倍柱体积进行水洗，水洗至颜色较浅，尽无色，用3-8倍柱体积的5-20％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；再用30-60％浓度的乙醇洗脱，并收集30-60％部分，将洗脱液浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
9.如权利要求8所述的贯叶连翘总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：贯叶连翘全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65％的乙醇提取，置于提取罐中，在回流状态下提取2次，过滤得提取液：将提取液控制温度60℃以下浓缩，至比重1.12喷雾干燥，得提取物：将提取物用6倍重量份的石油醚或正已烷脱脂，除去脂溶性成份，得脱脂后提取物：将脱脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，将乙酸乙脂萃取液浓缩至比重1.25，得到主要含金丝桃素、槲皮素类成分的乙酸乙脂部分，即A部分：将沉淀部分用水溶解，并同时挥发多余的有机溶剂，得水溶液部分；将水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯类弱极性或中极大孔树脂，流速为柱体积4倍：用纯水5倍柱体积进行洗脱，至颜色较浅，尽无色，用5倍量柱体积的55％乙醇溶剂洗脱，至颜色较浅，即可停止加入；将醇浓度在30-60％之间的部分单独收集，浓缩得B部分：将A部分和B部分混合，进行真空或喷雾干燥，得贯叶连翘总黄酮。
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