CN1935203B

CN1935203B - 草乌提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN1935203B
Application number: CN2005100217071A
Authority: CN
Inventors: 彭成; 郭力
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2025-09-20
Also published as: CN1935203A

Abstract

一种草乌提取物，其特征在于：它是由草乌Radix Aconiti Kusnezoffii或其炮制品为原料，加水或有机溶剂提取制备而成的提取物，其中，每克提取物中含有乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.01mg～0.7mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.90～2.40mg。本发明草乌提取物在质量控制范围内，解决了患者使用不便和安全性的问题，在质量上对生品和炮制品进行了比较明确的区分，解决了生草乌在临床上使用的安全性问题，扩大了药源，节约了炮制成本，且明确了不同提取条件下，具有不同的功效，为临床提供了一种新的选择。

Description

草乌提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种草乌提取物，属于中药制剂领域。

背景技术

生草乌是毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根。秋季茎叶枯萎时采挖，除去须根及泥沙，干燥。中国药典2005版中，规定有大毒，一般为炮制后用。因其良好的祛风除湿，温经止痛作用。在民间和制剂中用于治疗风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒癌作痛等症。而目前因风湿导致的病例越来越多，同时丧失生活劳动能力，现代医学的毒副作用较大，疗效并不乐观，许多人求知生草乌的治疗效果，导致中毒事故事故的频繁发生。

在临床应用其加工品制草乌，加工炮制过程中，生品中所含毒性很强的双酯类生物碱(乌头碱等)，易水解生成毒性较小的单酯类生物碱，继续水解，则生成毒性更小的不带酯键的生物碱，而起到减毒的作用。文献表明：主要通过加热和水漂的过程，是双酯类生物碱的含量下降，达到减毒的目的，但时在炮制过程中不可避免降低总生物碱的含量，加工时间又长。

在临床上，酒剂仍是目前草乌应用最广的剂型，文献统计表明，酒剂引发的毒性比例可达55.53％，主要原因酒本身有行血活络的功效，易于吸收和扩散，通常用于风寒湿痹具有祛风活血，止痛散瘀的功能。乌头类生物碱属主要包括乌头碱，中乌头碱，次乌头碱等脂溶性生物碱，其在酒中易溶。在一般自配的药酒中，药物来源复杂，用量较大，配伍的方药不当；酒的浓度较高，可达35％-45％；泡制时间较长，浓度较高；服用时间长，或急症服用，易导致中毒，而且乌头碱在醇中是不稳定的，至于是否和毒性有关，有待进一步研究。在患者使用时，药典规定要先煎，久煎使用，至于要先煎多久，加水量、煎煮次数、火力很难在实际中得到控制，不便于大生产操作及质量的控制。

发明内容

本发明的技术方案在于提供一种草乌提取物，本发明的另一技术方案是提供含有该草乌提取物的药物组合物及其制备方法。

本发明提供了一种草乌提取物，它是由草乌Radix Aconiti Kusnezoffii或其炮制品为原料，加水或有机溶剂提取制备而成的提取物，其中，每克提取物中含有乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.01mg～0.7mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.90～2.40mg。

其中，所述的草乌或其炮制品为生草乌、制草乌，其中，生草乌每克提取物中含乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.01mg～0.05mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在1.20～2.40mg；制草乌每克提取物中含双酯性生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.15mg～0.7mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.90～1.80mg。

以乌头碱为指标成分，测定本发明提取物中双酯性生物碱及总生碱的含量，因为生物碱类成分既是本发明提取物的活性成分，也是毒性成分，因此，对生物碱类成分的质量控制非常重要，直接影响了药物的有效、安全。只有在上述质量控制的范围内的药物才能满足安全、有效，才能便于临床使用。

进一步地，它是由草乌Radix Aconiti Kusnezoffii及其炮制品为原料，加水或有机溶剂提取而得。

所述的生草乌提取物是由如下方法制备：生草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2.5～3.5小时，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得；

所述的制草乌提取物是由如下方法制备：取制草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡30分钟，煎煮4.5～5.5小时，第2次加9～11倍量水，煎煮4.5～5.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得。

进一步地，它是由如下方法制备：

取生草乌药材，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次3小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得；

取制川乌药材，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次4小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由所述的草乌提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

其中，所述的药剂是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、合剂。

本发明还提供了该药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：

a、称生草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2.5～3.5小时，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得；

或称取制草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡30分钟，煎煮4.5～5.5小时，第2次加9～11倍量水，煎煮4.5～5.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得；

b、将a步骤的干燥物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

进一步地，步骤a具体如下：取生草乌药材，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次3小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得；

取制草乌药材，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次4小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得。

其中，所述浓缩是将滤液减压浓缩至1.02～1.05，60℃；所述干燥方法为一步制粒法，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。

本发明草乌提取物在质量控制范围内，解决了患者使用不便和安全性的问题，在质量上对生品和炮制品进行了比较明确的区分，解决了生草乌在临床上使用的安全性问题，扩大了药源，节约了炮制成本，且明确了不同提取条件下，具有不同的功效，为临床提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

原料购自成都荷花池市场，经成都中医药大学生药鉴定教研室鉴定为北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥叶，当年采收。

实施例1生草乌水提取物的制备

取生草乌药材13.50kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后3h，第2次加10倍量水，煎煮3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得2.45Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。

实施例2制草乌水提取物的制备

取制草乌药材12.50kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后3h，第2次加10倍量水，煎煮3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得2.21Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。

实施例3生草乌水提取物颗粒剂的制备

取生草乌药材13.00kg，以水浸泡30min，加至9倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后2.5h，第2次加7倍量水，煎煮2.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得2.25Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃，取提取物加入淀粉制颗粒、整粒，制成颗粒剂。

实施例4生草乌水提取物片剂的制备

取生草乌药材10.50kg，以水浸泡30min，加至11倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后3.5h，第2次加9倍量水，煎煮3.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得1.92Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃，取提取物加入淀粉制颗粒、整粒，压片，制成片剂。

实施例5制草乌水提取物胶囊剂的制备

取制草乌药材11.50kg，以水浸泡30min，加至9倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后4.5h，第2次加9倍量水，煎煮4.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得2.0Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃，取提取物加入淀粉制颗粒、整粒，装胶囊，制成胶囊剂。

实施例6制草乌水提取物胶囊剂的制备

取制草乌药材11.50kg，以水浸泡30min，加至11倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后5.5h，第2次加11倍量水，煎煮5.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02～1.05(60℃)，干燥即得2Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃，取提取物加入淀粉制颗粒、整粒，装胶囊，制成胶囊剂。

实施例6质量控制方法

【鉴别】取本品2g，研细，置具塞锥形瓶中，加氨试液5ml，加入乙醚30ml，超声提取10分钟，振摇20分钟，滤过，滤液置分液漏斗中，加0.25mol/L硫酸溶液，振摇提取，分取酸液，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定。在231nm和275nm波长处有最大吸收.

【检查】应符合颗粒剂项下有关的各项规定(中国药典2000年版一部附录IC)。

【限量检查】

一、生草乌照高效液相法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

2、标液曲线和线性范围精密称取乌头碱对照品5.0mg，用二氯甲烷溶解后，移入100ml容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇匀，即得(乌头碱为0.01mg/ml)。分别取对照液2、4、6、8、10μl进样，在色谱条件VP-ODS 150L×4.6mm色谱柱流动相∶甲醇∶水∶氯仿∶三乙胺(70∶30∶2∶0.1)，检测波长：230nm流速1.00ml/min柱温：30℃下依法测定，以生物碱量与峰面积值作图，得线性回归方程。精密本品3g加氨试液3ml，用乙醚30ml连续振摇1小时，再用乙醚50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液和洗液，低温蒸干，加乙醚5ml溶解，挥干，残渣加二氯甲烷使溶解，转移至1ml容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液备用。在选定的色谱条件下，供试品溶液进样10μl，依法测定，记录峰面积值，按外标法分别计算含量。

本品每袋2g，含生草乌以乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)计，不得高于0.05mg。

二、制草乌照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定。

1、标准曲线的绘制精密称取乌头碱对照品20mg加适量无水乙醇溶解，移入10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。精密量取乌头碱标准液0、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50ml，置25ml容量瓶中，加乙醇至2.5ml，精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5ml，于60～65℃中水浴10分钟，取出，放冷，加入13ml高氯酸铁试液，摇匀，放置5分钟，精密加入高氯酸试液8ml，摇匀，用高氯酸铁试液定容至刻度。以空白作参比，在520nm下测定其吸光度，以生物碱量与吸收度值作图并经直线回归处理，得线性方程式。

2、供试品溶液的制备分别精密称取2个最小包装内容物，加氨试液5ml，用乙醚50ml连续振摇1小时，冷浸过夜，再用乙醚50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液和洗液，低温蒸干，加乙醚5ml溶解，挥干，加乙醇2.5ml溶解，置25ml容量瓶中，自“精密加入碱性盐酸羟胺”起至“在520nm下测定其吸光度”计算求得双酯性生物碱含量本品每袋含制草乌以乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)计，不得高于1.0mg。

【含量测定】照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定。

1、标推曲线的绘制精密称取乌头碱对照品10mg加适量氯仿溶解，移入100ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。精密量取乌头碱标准液0、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50ml，分别置于分液漏斗中，并精密加入氛仿至20.0ml。以第一份为空白对照，然后各加入10mlpH6.1±0.1溴甲酚绿染料，充分振摇，静置1小时，氯仿液过滤至25ml容量瓶中并用氯仿稀释至刻度。于410nm波长处，分别测定空白、供试液的吸收度。以生物碱量与吸收度值作图并经直线回归处理，得线性方程式。

2、供试品溶液的制备分别精密称取单个最小包装内容物，按鉴别法备用，用乙醚-氯仿(3∶1)混合液代替氯仿，置蒸发皿中，水浴低温蒸干加乙醚-氯仿(3∶1)混合液5ml蒸干，加氯仿使溶解，定容于1ml，每次测定分别取0.1ml的溶液，转移至分液漏斗中，加氯仿至20ml，即得。自“加入10mlpH6.1±0.1溴甲酚绿染料”起至“410nm波长处”依法测定，计算求得总生物碱含量

本品每袋2g，含生草乌以乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)计，不得少于2.4mg。

本品每袋2g，含制草乌以乌头碱(C₃₄H₄₇NO₁₁)计，不得少于1.8mg。

【功能主治】祛风除湿，温经止痛。用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛，麻醉止痛。

【用法用量】生草乌0.5～1.5g、制草乌1～2g相当于制草乌药材1.5～3g

以下通过药效试验的方法对本发明的有益效果做进一步详述。

试验例1本发明草乌提取物提取工艺不同参数的筛选试验

(一)筛选试验

1、实验材料

1.1药物

草乌(生草乌、制草乌)：受试药物，购自四川江油，经本校生药鉴定教研室鉴定为北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根，当年采收。生品和炮制品分别以3倍量水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后15min、30min、60min、120min、3h、4h、6h 7个时间点，煎煮完毕减压浓缩为每ml含原生药1g。根据均匀设计表，草乌(生草乌、制草乌)煎煮15min、30min、60min、120min、3h、4h、6h 7个时间点分别取临床剂量(3g/60kg.d^-1)的24倍、3倍、48倍、12倍、1倍、36倍和6倍。临用时用蒸馏水分别配制成12％、1.5％、24％、6％、0.5％、18％、3％的药液备用。

醋酸地塞米松：阳性药物，浙江仙琚制药股份有限公司生产。批准文号：国药准字H33020822。生产批号：040209。规格：0.75mg/片。实验时用蒸馏水配制成0.03％的药液备用。

强的松：阳性药物，浙江仙居制药股份有限公司生产。批准文号：国药准字H33021207。生产批号：040610。规格：5mg/片×100片/瓶。实验时用蒸馏水配制成0.05％的药液备用。

盐酸曲马多片：阳性药物，石家庄制药集团有限公司生产。批准文号：国药准字H10960106。生产批号：031003。规格：50mg/片。实验时用蒸馏水配制成2％的药液备用。

1.2动物

昆明种小鼠，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：04-11。SD大鼠，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：04-11。检疫后备用。

2、实验方法

2.1抗炎试验

2.1.1二甲苯耳廓肿胀试验

2.1.11生草乌二甲苯耳廓肿胀试验

徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第2版).北京：人民卫生出版社，1991，719

2.1.1.2制草乌二甲苯耳廓肿胀试验

2.1.2蛋清足跖肿胀试验

徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第3版).北京：人民卫生出版社，2002，911

2.1.3巴豆油肉芽肿试验

徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第3版).北京：人民卫生出版社，2002，918

2.2镇痛试验

2.2.1扭体试验

2.2.1.1生草乌扭体试验

徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第3版).北京：人民卫生出版社，2002，882

2.2.1.2制草乌扭体试验

2.2.2热板试验

2.2.2.1生草乌热板试验

徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第3版).北京：人民卫生出版社，2002，885

2.2.2.2制草乌热板试验

3、实验结果

3.1抗炎试验

3.1.1二甲苯耳廓肿胀试验

模型组小鼠造模后1.5h耳廓肿胀显著。生草乌15min组、30min组、1h组及6h组小鼠耳廓肿胀度明显减轻，与模型组比较有显著性差异。制草乌各给药组肿胀耳廓均缩小，其中6h组肿胀耳廓缩小显著，与模型组比较有显著性差异。经回归分析，生草乌发挥药效的最佳时间剂量为6h，48倍；制草乌发挥药效的最优条件为6h，22.43倍。结果详见表1、2及回归分析。

表1生草乌对二甲苯致炎小鼠耳廓肿胀的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05。

回归分析：

最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝13.5

表2制草乌对二甲苯致炎小鼠耳廓肿胀的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**＜P0.01。

回归分析：

最优条件：X₁＝6h，X₂＝22.43倍预期试验结果：Y＝3.58

3.1.2蛋清足跖肿胀试验

模型组大鼠右足跖注射鸡蛋清后很快肿胀，注射后1h肿胀达高峰，注射后6h仍肿胀明显。生草乌各组均有明显抑制大鼠足跖肿胀的作用，6h组作用尤为显著。经回归分析，生草乌发挥药效的最优条件：0.5h、1h、2h、3h、4h、6h分别为6h，48倍、6h，48倍、5h，1倍、6h，48倍、6h，33.99倍和4.862h，1倍。结果详见表37和回归分析。

表3对鸡蛋清致炎大鼠足跖肿胀的影响

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

回归分析：

0.5h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝11.1

1h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝17.1

2h：最优条件：X₁＝5h，X₂＝1倍预期试验结果：Y＝5.69

3h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝17.0

4h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝33.99倍预期试验结果：Y＝5.44

6h：最优条件：X₁＝4.862h，X₂＝1倍预期试验结果：Y＝5.98

3.1.3巴豆油肉芽肿试验

模型组大鼠造模后1周体重未增加，渗出液量较多，肉芽增生显著。生草乌各组体重均逐渐增加，其中15min组、3h组体重增加显著，与模型比较有显著性差异。各给药组渗出液量较少，15min组、4h组和6小时组渗出液量显著减少，与模型组比较有显著或极显著性差异。肉芽重量除30min组外其余各组亦显著减轻，与模型组比较，有显著性或极显著性差异。经回归分析，生草乌发挥药效的最佳时间剂量为，体重：0.25h、36.63倍，渗出液：6h、48倍，肉芽肿：0.25h、48倍；结果详见表4和回归分析。

表4生草乌对巴豆油致炎大鼠的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**＜P0.01，***＜P0.001。

回归分析：

体重：最优条件：X₁＝0.25h，X₂＝36.63倍预期试验结果：Y＝4.37

渗出液：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝15.3

肉芽重：最优条件：X₁＝0.25h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝6

3.2镇痛试验

3.2.1扭体试验

模型组小鼠注射0.6％醋酸后疼痛明显，频繁扭体。生草乌各时间剂量组扭体潜伏期与模型组比较，无显著差异；扭体次数除30min组外，其余各组与模型组比较，均显著减少。制草乌30min、1h、3h、4h、6h组扭体潜伏期显著延长，与模型组比较，有显著或极显著性差异。各给药组扭体次数亦显著减少，与模型组比较均有极显著性差异。经回归分析，生草乌发挥药效的最佳时间剂量为6小时48倍。制草乌发挥药效的最佳时间剂量为，潜伏期：6小时48倍；扭体次数：6小时21.77倍。结果详件表5、6和回归分析。

表5生草乌对冰乙酸致痛小鼠的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**＜P0.01，***P＜0.001。

回归分析：

扭体次数：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝3.78

潜伏期：最优条件：X₁＝4.068h，X₂＝1倍预期试验结果：Y＝1.93

表6生草乌对冰乙酸致痛小鼠的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**＜P0.01，***P＜0.001。

回归分析：

潜伏期：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝14.5

扭体次数：最优条件：X₁＝6h，X₂＝21.77倍预期试验结果：Y＝11.5

3.2.2热板试验

各试验组给药前基础痛阈值无显著性差异。生草乌15min组给药后30min、60min、90min，1h组60min，2h组90min，3h组120min，4h组60min痛阈值均显著延长，与模型组比较，有显著或极显著性差异。制草乌除15分钟组和4小时组外，其余各组与模型组比较，均在不同时间有显著性差异。经回归分析，生草乌给药后30min、60min、90min、120min发挥药效的最佳时间剂量分别为0.25h，38.69倍、4.873h，1倍、0.25h，27.41倍、6h，30.7倍。制草乌药后0.5h发挥药效的最佳时间剂量为6小时48倍。结果详见表7、8及回归分析。

表7生草乌对热板致痛小鼠痛阈值(秒)的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

回归分析：

0.5h：最优条件：X₁＝0.25h，X₂＝38.69倍预期试验结果：Y＝3.71

1h：最优条件：X₁＝4.873h，X₂＝1倍预期试验结果：Y＝3.97

1.5h：最优条件：X₁＝0.25h，X₂＝27.41倍预期试验结果：Y＝2.60

2h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝30.7倍预期试验结果：Y＝5.97

表8制草乌对热板致痛小鼠的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**＜P0.01。

回归分析：

0.5h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝3.96

1h：最优条件：X₁＝2.964h，X₂＝48倍预期试验结果：Y＝5.27

1.5h：最优条件：X₁＝6h，X₂＝1倍预期试验结果：Y＝2.38

2h：最优条件：X₁＝3.424h，X₂＝10.49倍预期试验结果：Y＝3.32

上述药效试验证明，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮15min、2h、3h、4h、6h抗炎、镇痛作用较优。

试验例2本发明草乌提取物提取工艺不同参数的安全性试验

1.生草乌动物急性毒性试验资料

1.1.实验材料

1.1.1.药物

生草乌各时间点水煎液，受试药物，分别含生药量为15min、30min为4g/ml，1h、2h、3h、4h及6h均为3.3g/ml，均由成都中医药大学药学院提供，试验批号：050905，用原水煎液灌胃小鼠。

1.1.2.动物

SPF小鼠，雌雄各半，体重18-21g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质04-11，检疫后备用。

1.2.实验方法

预试：取SPF小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12hr，通过试验测得15min、30min的全死、全活量，做LD₅₀；1h、2h、3h、4h及6h以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W的剂量灌胃，24h连续给药3次。连续观察3d，记录动物有无毒性反应以及实验前后体重变化，以不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。

取SPF小鼠100只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按体重随机分为10组，每组10只。在15min、30min的全死全活量之间再设定3个剂量组，分别灌胃相应浓度的药液；连续观察7天，记录动物死亡只数，求其LD₅₀。

取SPF小鼠120只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按体重随机分为6组，每组20只。即空白对照组(N＝20)、1h组(N＝20)、2h组(N＝20)、3h组(N＝20)、4h组(N＝20)及6h组(N＝20)。以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W的剂量分别灌胃相应浓度的药液，24h连续给药3次；连续观察7天，记录动物有无毒性反应以及实验前后体重变化，以不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。

1.3.实验结果

1.3.1生草乌15min时间点药液结果

SPF小鼠灌胃生草乌15min时间点药液后，均出现行动迟缓、神情淡漠等不同程度的中毒反应，死亡多发生在给药后24小时内死亡。动物死亡情况详见表9。

Y＝-4.554+0.1109X r＝0.916

LD₅₀＝40.94g/kg。

表9 15min生草乌灌胃给药对动物死亡的影响

组别	动物(只)	剂量(g/kg)	死亡数(只)
组别	动物(只)	剂量(g/kg)	死亡数(只)	12345	1010101010	3035.742.4850.5560	136810

1.3.2生草乌30min时间点药液结果

SPF小鼠灌胃生草乌30min时间点药液后，均出现行动迟缓、神情淡漠等不同程度的中毒反应，死亡多发生在给药后24小时内死亡。动物死亡情况详见表10。

Y＝-5.416+0.7781X r＝0.609

LD₅₀＝69.60g/kg。

表10 30min生草乌灌胃给药对动物死亡的影响

组别	动物(只)	剂量(g/kg)	死亡数(只)
组别	动物(只)	剂量(g/kg)	死亡数(只)	12345	1010101010	5059.570.8184.26100	036810

1.3.3生草乌1h、2h、3h、4h及6h时间点药液结果

SPF小鼠灌胃生草乌其他各时间点药液后，发育健康，肌肉丰满，被毛浓密而有光泽、紧贴其身，眼睛明亮而灵活、无异常的分泌物，肛周洁净，摄食正常，四肢健壮，自发活动正常，体重逐渐增加。7d内未内动物死亡及毒副反应。实验结束时肉眼尸解未见明显病理改变。

1.4.实验结论

SPF小鼠灌胃生草乌15min、30min时间点药液的LD₅₀分别为40.94g/kg(相当于人临床日用量的818.8倍)和69.60g/kg(相当于人临床日用量的1392倍)。SPF小鼠灌胃生草乌1h、2h、3h、4h及6h时间点药液后，动物未出现死亡和异常中毒反应，与人临床日服剂量生草乌3g原生药/60kg相比较，动物日摄入量相当于人临床日用量的7992倍。

生草乌煎煮15min、30min仍然具有一定毒性，煎煮1h以上基本没有明显毒性。

2.制草乌动物急性毒性试验资料

2.1.实验材料

2.1.1.药物

制草乌各时间点水煎液，受试药物，分别含生药量为15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h为3.33g/ml，均由成都中医药大学药学院提供，试验批号：0500627，用各水煎液灌胃小鼠。

2.1.2.动物

SPF小鼠，雌雄各半，体重18-22g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质04-11，检疫后备用。

2.2.实验方法

预试：取SPF小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12hr，将15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各时间点水煎液以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W的剂量灌胃，24h连续给药3次。连续观察3d，动物均无死亡和明显的毒性反应，以此不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。

取SPF小鼠160只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按体重随机分为8组，每组20只。即空白对照组(N＝20)、15min组(N＝20)、30min组(N＝20)、1h组(N＝20)、2h组(N＝20)、3h组(N＝20)、4h组(N＝20)及6h组(N＝20)。以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W的剂量分别灌胃相应浓度的药液，24h连续给药3次；连续观察7天，记录动物有无毒性反应以及实验前后体重变化，以不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。

以上结果均用SPSS12.0统计软件处理。

2.3.实验结果

SPF小鼠灌胃制草乌5min、30min、1h、2h、3h、4h及6h各时间点水煎液后，发育健康，肌肉丰满，被毛浓密而有光泽、紧贴其身，眼睛明亮而灵活、无异常的分泌物，肛周洁净，摄食正常，四肢健壮，自发活动正常，体重逐渐增加。7d内未内动物死亡及毒副反应。实验结束时肉眼尸解未见明显病理改变。

2.4.实验结论

SPF小鼠灌胃制草乌15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h MTD均为399.6g原生药/kg(相当于人用量的7992倍)；所有动物均未出现死亡或异常中毒反应。

制草乌水煎液没有明显毒性。

上述实验说明本发明生草乌煎煮1h以上无明显毒性，制草乌各时间点水煎液无明显毒性。

上述药效、安全试验证明，采用本发明所述的方法制备的产品，在质量控制的标准范围内，达到了安全、有效，为临床提供了一种新的选择。

Claims

1.草乌提取物，其特征在于：它是由草乌或其炮制品为原料，加水提取制备而得的提取物；

其中，所述的草乌或其炮制品为生草乌、制草乌；

采用如下方法制备，

取生草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2.5～3.5小时，第2次加7～9倍量水，煎煮2.5～3.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得生草乌提取物；

或取制草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮4.5～5.5小时，第2次加9～11倍量水，煎煮4.5～5.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得制草乌提取物；

所得每克提取物中含有乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.01mg～0.7mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.90～2.40mg。

2.根据权利要求1所述的草乌提取物，其特征在于：所述的生草乌提取物中每克含乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.01mg～0.05mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在1.20～2.40mg；所述的制草乌提取物中每克含双酯性生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.15mg～0.7mg，含总生物碱以乌头碱C₃₄H₄₇NO₁₁计在0.90～1.80mg。

3.药物组合物，它是由权利要求1-2任一项所述的草乌提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、合剂。

5.一种制备权利要求3所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

或称取制草乌药材饮片，第一次加9～11倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮4.5～5.5小时，第2次加9～11倍量水，煎煮4.5～5.5小时，滤过，浓缩，干燥，即得；

6.根据权利要求5所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：所述浓缩是将滤液减压浓缩至1.02～1.05，60℃；所述干燥方法为一步制粒法，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。

7.草乌提取物，其特征在于：它是由如下方法制备：

取生草乌药材，加10倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2次，每次3小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得；

取制川乌药材，加10倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2次，每次4小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得。

8.药物组合物，它是由权利要求7所述的草乌提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、合剂。

10.一种制备权利要求8所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、取生草乌药材，加10倍量水，浸泡20-40分钟，煎煮2次，每次3小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得；

或取制川乌药材，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次4小时，滤过，滤液浓缩，干燥即得；

11.根据权利要求10所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：所述浓缩是将滤液减压浓缩至1.02～1.05，60℃；所述干燥方法为一步制粒法，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。