CN101856449A - 一种清热利湿,活血通淋中药组合物及制备方法和质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种清热利湿，活血通淋的中药组合物，该组合物由金钱草、绵萆薢、瞿麦、黄柏、三七等制成临床或药学上可接受的剂型，该中药组合物具有很好的清热利湿，活血通淋的作用，具有显著的抗炎、消肿效应；本发明中药组合物制剂的质量检测方法检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高，更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。
Description
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物及制备方法和质量检测方法，特别涉及一种清热利湿，活血通淋的中药组合物及制备方法和质量检测方法。
背景技术：
前列腺疾病是男性泌尿生殖系常见病，主要包括前列腺炎、前列腺增生及前列腺癌。男性的大多数一生都要不同程度的受到前列腺疾病的困扰，其中尤以慢性前列腺炎为多见。在20-65岁的男性中均有发现，22-40岁男子发病率高，发病趋势呈年轻化发展。
现有治疗前列腺疾病的药物有些属于治标不治本，有些使用价格昂贵的物质，有些在应用过程中由于疗效不确切而中断使用。本发明的目的是提供一种疗效确切、安全方便、副作用小、价格低廉的纯中药治疗前列腺疾病的药物组合物及其制备方法。
发明内容：
本发明第一个目的在于提供一种清热利湿，活血通淋的中药组合物；本发明的第二个目的在于提供该中药组合物制剂的制备方法。本发明的第三个目的在于提供该中药组合物制剂的质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明一种清热利湿，活血通淋的本发明组合物制剂的原料组成为：
金钱草300-500重量份、绵萆薢300-500重量份、瞿麦150-300重量份、黄柏150-350重量份、三七30-60重量份、川楝子150-350重量份、桃仁150-300重量份、乌药150-300重量份、牛膝150-350重量份。
本发明一种清热利湿，活血通淋的本发明组合物制剂的原料组成优选为：
金钱草420重量份、绵萆薢420重量份、瞿麦210重量份、黄柏250重量份、三七42重量份、川楝子250重量份、桃仁210重量份、乌药210重量份、牛膝250重量份。
本发明一种清热利湿，活血通淋的本发明组合物制剂的制备方法为：
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加50-90％乙醇回流提取1-5次，每次0.5-3.0小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮1-5次，每次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.30(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达50-90％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
本发明一种清热利湿，活血通淋的中药组合物颗粒剂的制备方法优选为：
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
本发明一种清热利湿，活血通淋的中药组合物胶囊剂的制备方法优选为：
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，装胶囊，即得。
本发明提供该中药组合物制剂的质量控制方法，该方法包括步骤：
A、鉴别：取本发明组合物制剂2-10g，加乙醇10-30ml，置水浴上回流15-60分钟，取上清液2-15ml，加盐酸0.5-2ml，加热回流0.5-2小时后浓缩至约1-10ml，加水5-20ml，用环己烷5-30ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷1-3ml使溶解，作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材1-5g，同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含1-10mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照药材及对照品溶液各2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(14-5∶2)比例的环己烷-乙酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B鉴别：取本发明组合物制剂2-4g，加甲醇10-30ml，超声处理5-45分钟，滤过，滤液浓缩至1-4ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.05-1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.1-1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(20-5∶4-8∶1∶1)比例的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。
C鉴别：取本发明组合物制剂0.5-5g，加甲醇5-50ml，超声处理5-60分钟，静置，取上清液5-20ml，蒸干，残渣加水10-50ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液1-10ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取1-3次，每次10-50ml，合并正丁醇液，加水洗涤1-3次，每次20-50ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水1-5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水20-100ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇10-50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.1-2g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.1-2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各1-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(10-1∶1∶4-7)比例的正丁醇-乙酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
D含量测定：色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以(30-60∶40-70)比例的甲醇-0.4％磷酸溶液混合溶剂为流动相；检测波长为330-380nm。对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素5-25μg，山奈素10-30μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本发明组合物制剂约1-10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液25-75ml，密塞，称定重量，加热回流0.5-2小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明组合物制剂每1g含金钱草以槲皮素(C15H11O7)和山奈素(C15H10O6)的总量计，不得少于0.20mg。
上述质量控制方法中优选包括如下鉴别法：
绵萆薢薄层鉴别：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液5μl、对照药材及对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
黄柏薄层鉴别：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。
三七薄层鉴别：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定：色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(48∶52)为流动相；检测波长为360nm。对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素15μg，山奈素20μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本发明组合物制剂约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述质量控制方法本发明组合物制剂为：金钱草420g、绵萆薢420g、瞿麦210g、黄柏250g、三七42g、川楝子250g、桃仁210g、乌药210g、牛膝250g的颗粒剂，并通过如下方法制备：以上九味，三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
本发明中药组合物具有很好的清热利湿，活血通淋的作用，本发明组合物制剂均表现显著的抗炎、消肿效应。
本发明中药组合物制剂的质量检测方法，经实验证明：本发明含量测定方法检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高，更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
本发明所有实验例所选用的制剂均为根据本发明实施例1制得的本发明颗粒剂，但是本发明实验结果并不仅限于该颗粒剂。
实验例1：本发明组合物制剂治疗前列腺炎的药效学研究
1、实验材料：本发明组合物制剂；醋酸泼尼松片(5mg/片)，使用时用0.5％缩甲基纤维素钠配成所需浓度的混悬液备用；前列舒乐颗粒(4g/袋)；0.9％NaCl注射液。试剂：二甲苯(分析纯)；角叉菜胶；伊文思兰；冰醋酸。
动物：昆明种小鼠(二级)，雄性，体质量18～22g；SD大鼠(二级)，体质量180～200g；
仪器：722光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。FA2004电子天平，上海精科天平；大鼠足容积测量装置(自制)。
2、实验方法：
2.1对角叉菜胶致大鼠非细菌性前列腺炎的影响
将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、本发明组合物制剂小剂量组(1.5g/kg，相当于人临床用量的3.5倍)、本发明组合物制剂中剂量组(3.0g/kg，相当于人临床用量的7倍)、本发明组合物制剂大剂量组(6.0g/kg，相当于人临床用量的14倍)及阳性药前列舒乐颗粒组(2.4g/kg，相当于人临床用量的14倍)，每组10只，各给药组大鼠连续灌胃给药7d，每日1次，模型对照组给予等容量蒸馏水。末次给药后30min，将大鼠用乙醚麻醉，无菌条件下剖开腹腔，在每鼠前列腺内注入灭菌的1.5％角叉菜胶0.05mL，缝合切口，24h后断头处死大鼠，取致炎前列腺组织50mg加入200μL白细胞稀释液和200μL生理盐水中，充分混匀，镜下记录白细胞数和卵磷脂小体密度。
2.2对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
将小鼠随机分为模型对照组、本发明组合物制剂小剂量组(2.0g/kg，相当于人临床用量的4.5倍)、本发明组合物制剂中剂量组(4.0g/kg，相当于人临床用量的9倍)、本发明组合物制剂大剂量组(8.0g/kg，相当于人临床用量的18倍)及阳性药醋酸泼尼松组(8.0mg/kg，相当于人临床用量的9倍)，每组10只，给药组连续灌胃给药7d，每日1次，容量为0.2mL/10g，模型对照组给予等量蒸馏水。末次给药后30min，分别在小鼠右耳两面涂以二甲苯0.05mL/只，左耳作对照，15min后处死动物，用直径6mm的打孔器将双耳同部位切下，用FA2004电子天平称质量，以左、右耳片质量之差为肿胀度，计算各组肿胀度。
2.3对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
将小鼠随机分为模型对照组、本发明组合物制剂小剂量组(2.0g/kg，相当于人临床用量的4.5倍)、本发明组合物制剂中剂量组(4.0g/kg，相当于人临床用量的9倍)、本发明组合物制剂大剂量组(8.0g/kg，相当于人临床用量的18倍)及阳性药醋酸泼尼松组(8.0mg/kg，相当于人临床用量的9倍)，每组10只，给药组连续灌胃给药7d，每日1次，容量为0.2mL/10g，模型对照组给予等量蒸馏水。末次给药后30min，分别尾静脉注射0.5％伊文思兰生理盐水0.1mL/10g，同时腹腔注射0.6％醋酸0.2mL/只。20min后处死动物，剪开腹部皮肤肌肉，用6mL生理盐水分3次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液，合并后加生理盐水至10mL，300r/min离心15min。取上清液于590nm处测吸光度(OD，表示渗入腹腔的染料量)。
2.4对角叉菜胶至大鼠足跖肿胀的影响
将大鼠随机分为模型对照组、本发明组合物制剂小剂量组(1.5g/kg，相当于人临床用量的3.5倍)、本发明组合物制剂中剂量组(3.0g/kg，相当于人临床用量的7倍)、本发明组合物制剂大剂量组(6.0g/kg，相当于人临床用量的14倍)及阳性药醋酸泼尼松组(6.0mg/kg，相当于人临床用量的7倍)，每组10只，各给药组大鼠连续灌胃给药7d，每日1次，模型对照组给予等容量蒸馏水，末次给药后30min，在每鼠右后肢踝部皮下注入1％角叉菜胶0.1mL致炎，于致炎前后不同时间点测量右后足跖容积，计算肿胀度(致炎后容积与致炎前容积之差)。
统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件处理，组间比较采用t检验。
3结果
3.1对角叉菜胶致大鼠细菌性前列腺炎的影响：
模型对照组大鼠前列腺内白细胞数明显较正常对照组大鼠增多(P＜0.01)，卵磷脂小体明显较正常对照组大鼠减少(P＜0.01)；本发明组合物制剂(1.5g/kg、3.0g/kg、6.0g/kg)组大鼠前列腺内白细胞数明显较模型对照组大鼠减少(P＜0.01)，卵磷脂小体明显较模型对照组大鼠增多(P＜0.01)。见表1。
表1 各组大鼠前列腺内白细胞数及卵磷脂小体密度比较
与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。
3.2对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响：
模型对照组小鼠耳肿胀度为(9.8±1.23)mg，本发明组合物制剂小剂量组为(7.5±2.23)mg，本发明组合物制剂中剂量组为(6.8±2.14)mg，本发明组合物制剂大剂量组为(6.7±2.16)mg，醋酸泼尼松组为(5.7±2.45)mg。各给药组与模型对照组均有显著性差异(P＜0.05或0.01)。
3.3对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响：
模型对照组吸光度为0.434±0.0656，本发明组合物制剂小剂量组为0.367±0.0565，本发明组合物制剂中剂量组为0.365±0.0334，本发明组合物制剂大剂量组为0.312±0.0465，醋酸泼尼松组为0.243±0.0454。各给药组小鼠吸光度均明显低于模型对照组(P＜0.01)。
3.4对1％角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响：
本发明组合物制剂(1.5g/kg、3.0g/kg、6.0g/kg)组大鼠足跖肿胀在致炎后1h、2h、4h、6h均较对照组大鼠轻，见表2。
表2 各组大鼠致炎后不同时间的肿胀度(mL)
与模型对照组比较*p＜0.05。
本实验证明：本发明组合物制剂(1.5g/kg、3.0g/kg、6.0g/kg)可明显减少1.5％角叉菜胶致非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织内白细胞数，增加前列腺组织内卵磷脂小体密度，并可明显抑制棉球肉芽肿形成。本发明组合物制剂(2.0g/kg、4.0g/kg、8.0g/kg)对二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显抑制作用；可明显抑制0.6％醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加。
实验例2：绵萆薢薄层鉴别试验
本发明组合物制剂处方中含有绵萆薢，主要有效成分为薯蓣皂苷类成分。本发明利用薄层色谱鉴别制剂水解后的薯蓣皂苷元，来鉴定制剂中的绵萆薢药材。
1、薄层色谱方法的选择：
绵萆薢中的薯蓣皂苷元极性较弱，故选择硅胶层析进行实验。
2、供试品的制备：
2.1供试品制备方法的选择：
通过实验确定是否需要将供试品水解后鉴别。
方法1：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液1。
取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液1。
方法2：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，减压浓缩至干，加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液2。
取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液2。
取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液5μl、对照药材及对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
在对照药材溶液1中没有观察到明显色谱斑点；在对照药材溶液2中在薯蓣皂苷元色谱相应位置上观察到明显色谱斑点，且供试品溶液色谱中在其位置上也有明显色谱斑点。
所以选择将供试品水解后鉴别其中的薯蓣皂苷元。
2.2供试品溶液提取条件的优化：
采用L93(4)正交实验设计，对供试品溶液提取条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份，各5g，分别按照表格中条件进行提取。样品提取后均将体积调整至20ml，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液1-9
取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液5μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
综合考虑确定供试品溶液最优提取方法为：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟。
2.3供试品溶液水解条件的优化：
采用L93(4)正交实验设计，对供试品溶液水解条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份，各5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，分别按照表格中实验条件进行水解，样品水解浓缩后，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液1-9。
取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液5μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml。
2.4供试品溶液萃取条件的优化：
采用L93(4)正交实验设计，对供试品溶液水解条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份，各5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，按表格中实验方法进行萃取，作为供试品溶液1-9。
取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液5μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。
3、对照药材溶液的制备方法：
对照品溶液的制备方法同供试品溶液制备方法。
4、供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液点样量的确定：
分别吸取供试品溶液2、5、10ul，对照药材、对照品溶液1、2、5ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
对照药材及对照品溶液点样量为1μl时，斑点强度较低，不宜观察；点样量为2μl时，四季红对照药材溶液薄层上荧光斑点清晰，大小适中；点样量为5μl时，斑点太大，拖尾。
确定对照药材及对照品溶液的最佳点样量为2μl。
供试品溶液点样量为2μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点强度较低，不宜观察；点样量为5μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点明显，斑点大小适中，前后无干扰；点样量为10μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上荧光斑点较大，明显拖尾，与前后荧光斑点相连。
确定供试品的最佳点样量为5μl。
5、展开剂条件的优选
薯蓣皂苷元极性较小，因此选择环己烷和极性稍大的醋酸乙酯为展开剂，通过实验选择合适的比例，使所需成分得到分离。
取缺绵萆薢的绵萆薢阴性制剂按供试品制备方法制备缺绵萆薢阴性对照溶液。
精密吸取供试品溶液、缺绵萆薢阴性对照溶液5μl，对照药材及对照品溶液2μl点于同一硅胶G薄层板上，反复五块薄层板。分别用以下展开剂展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。试验结果如下：
方法1：展开剂为环己烷-乙酸乙酯(20∶2)，展开剂极性较小，薯蓣皂苷元斑点Rf值接近0.2，供试品色谱中薯蓣皂苷元斑点与前后斑点未分开；
方法2：展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8∶2)，极性适宜，对照药材斑点Rf值接近0.5，供试品色谱中，在与薯蓣皂苷元对照品溶液相对应的斑点，分离良好，前后无干扰；
方法3：展开剂为环己烷-乙酸乙酯(2∶2)，极性偏高，供试品色谱中薯蓣皂苷元斑点Rf值接近0.85，供试品色谱中薯蓣皂苷元斑点与前后斑点未分开；
确定分离本发明组合物制剂中薯蓣皂苷元的最优薄层展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8∶2)。
6、显色剂的选择
薯蓣皂苷元薄层色谱斑点在日光下没有颜色，需显色后观察。常用的显色剂为磷钼酸试液、10％的硫酸乙醇溶液以及碘蒸气。
按上述方法制备供试品溶液、对照药材溶液。取三块硅胶薄层分别点样、展开、晾干。
方法一：喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；
方法二：喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；
方法三：碘蒸气显色。
实验结果如下：
方法一：薄层喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰后观察，在薯蓣皂苷元对照品相对应的位置上，供试品溶液有明显相同颜色的斑点，斑点清晰，前后无干扰；方法二：薄层在喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。在薯蓣皂苷元对照品相对应的位置上，供试品溶液色谱中斑点有干扰；方法三，碘蒸气熏后斑点较多。在四季红对照药材相对应的位置上，供试品溶液色谱中斑点供试品溶液与对照药材溶液色谱中没有观察到颜色及Rf值一致的斑点。
确定最佳显色条件为喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
最后确定本发明组合物制剂中绵萆薢的薄层色谱鉴别条件为：
取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液5μl、对照药材及对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验例3：黄柏薄层鉴别试验
本发明组合物制剂中所含黄柏药材中的有效成分为以小檗碱类为代表的生物碱类成分。本发明利用薄层色谱鉴别制剂中的盐酸小檗碱，鉴定制剂中的黄柏药材。
1、供试品溶液提取条件的优化：
采用L93(4)正交实验设计，对提取供试品中的盐酸小檗碱实验条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份，各2g，分别按照表中实验条件进行实验，提取液浓缩至2ml，作为供试品溶液1-9
盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
综合考虑，确定供试品溶液提取方法为：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。
2、供试品溶液点样量的考察：
分别吸取供试品溶液1、2、5μl点于同一硅胶G板上，展开、检识。
试验结果如下：
供试品溶液点样量为1μl时，斑点强度较低，不宜观察；供试品溶液点样量为2μl时，薄层上荧光斑点清晰，大小适中，无拖尾，前后无干扰；供试品溶液点样量为5μl时，供试品溶液薄层上荧光斑点较大，与前后荧光斑点相连。
确定供试品溶液的最佳点样量为2μl。
最后确定本发明组合物制剂中黄柏的薄层色谱鉴别条件为：
取本制剂组合物2g，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。
实验例4：三七薄层鉴别试验
本发明组合物制剂中所含三七药材中的有效成分为皂苷类成分。本发明利用薄层色谱鉴别制剂中的人参皂苷Rg1及三七皂苷R1，鉴定制剂中的三七药材。
1、供试品溶液的提取、纯化方法：
1.1供试品溶液提取条件的优化：
采用L93(4)正交实验设计，对制剂中的人参皂苷Rg1及三七皂苷R1提取实验条件进行优化。
精密称取本发明组合物制剂九份，各2g，分别按照表中实验条件进行考察，各组取一半提取液，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。浓缩至2ml，作为供试品溶液1-9
取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
综合考虑确定供试品溶液提取方法为：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟。
1.2供试品溶液纯化方法的考察：
皂苷类成分常见的纯化方法为正丁醇萃取，本发明采用正丁醇萃取的方法并结合其他方法纯化制剂中的皂苷类成分。
1.2.1水提液调节pH值：
取本发明组合物制剂2g三份，分别加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，分别加入10％氢氧化钠溶液0、5ml摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1-3。
取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
供试品溶液1水提液中不加入氢氧化钠溶液，色谱中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点受其他杂质干扰；供试品溶液2水提液中加入氢氧化钠溶液5ml氢氧化钠溶液5ml，色谱中参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点前后无干扰。
所以确定供试品水提液中需加入氢氧化钠溶液5ml调节pH值后萃取。
1.2.2正丁醇萃取液的洗涤：
取本发明组合物制剂2g四份，分别加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，分别加入10％氢氧化钠溶液5ml摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤0、1、2、3次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1-4。
取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
供试品溶液1正丁醇萃取液不用水洗涤，色谱中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点受其他杂质干扰；供试品溶液2正丁醇萃取液水洗涤1次，色谱中参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点前后干扰较供试品溶液1改善；供试品溶液3正丁醇萃取液水洗涤2次，色谱中参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点前后无干扰；供试品溶液4正丁醇萃取液水洗涤3次，色谱结果同供试品溶液3。
确定供试品正丁醇萃取液水洗涤3次。
1.2.3正丁醇萃取液的大孔树脂纯化：
方法1：正丁醇萃取液不使用大孔树脂纯化：
取本发明组合物制剂2g份，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加入10％氢氧化钠溶液5ml摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤0、1、2、3次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1。
方法2：正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化：
取本发明组合物制剂2g份，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加入10％氢氧化钠溶液5ml摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤0、1、2、3次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液2。
取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
供试品溶液1不使用大孔树脂纯化：色谱中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点受其他杂质干扰；供试品溶液2正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化，色谱中参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点前后无干扰。
确定供试品正丁醇萃取液使用大孔树脂纯化。
1.2.4大孔树脂洗脱乙醇浓度的确定：
取本发明组合物制剂2g三份，分别加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，三份样品分别通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，三份样品分别用30、70、95％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1-3。
实验结果如下：
供试品溶液1使用30％乙醇洗脱，色谱中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点受其他杂质干扰；供试品溶液2使用70％乙醇洗脱，色谱中参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点前后无干扰。供试品溶液3使用95％乙醇洗脱，色谱中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1斑点受其他杂质干扰；
确定供试品使用70％乙醇将皂苷类成分从大孔树脂柱上洗脱。
2、供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液点样量的确定：
分别吸取供试品溶液、对照药材、对照品溶液2、5、10ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验结果如下：
对照药材及对照品溶液点样量为2μl时，斑点强度较低，不宜观察；点样量为5μl时，四季红对照药材溶液薄层上荧光斑点清晰，大小适中；点样量为10μl时，斑点太大，拖尾。
确定对照药材及对照品溶液的最佳点样量为5μl。
供试品溶液点样量为2μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点强度较低，不宜观察；点样量为5μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上斑点明显，斑点大小适中，前后无干扰；点样量为10μl时，在对照药材及对照品溶液相对应的位置上荧光斑点较大，明显拖尾，与前后荧光斑点相连。
确定供试品的最佳点样量为5μl。
3、展开剂条件的优
取缺三七的三七阴性制剂按供试品制备方法制备缺三七阴性对照溶液。
精密吸取供试品溶液、缺三七阴性对照溶液、对照药材及对照品溶液5μl点于于同一硅胶G薄层板上，反复点于五块薄层板上。分别用以下展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
试验结果如下：
方法1：展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(10∶1∶5)的上层溶液，展开剂极性较小，供试品色谱中在与人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品溶液相对应的斑点与前后斑点未分开。
方法2：展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液，极性适宜，供试品色谱中在与人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品溶液相对应的斑点，分离良好，前后无干扰；
方法3：展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(1∶1∶5)的上层溶液，极性偏高，供试品色谱中在与人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品溶液相对应的斑点与前后斑点未分开；
确定分离本发明组合物制剂中三七皂苷成分的最优薄层展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(1∶1∶5)的上层溶液。
最后确定本发明组合物制剂中三七的薄层色谱鉴别条件为：
取本制剂组合物2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实验例5：金钱草含量测定方法
本发明制剂组合物处方中金钱草的有效成份为以槲皮素、山奈素为母核的黄酮类成分。本发明中通过测定本发明组合物中槲皮素、山奈素的含量有助于控制本中成药制剂的质量，确保临床用药的安全、有效。
1、色谱柱考察：
为了保证色谱条件的广泛适用性，考察不同品牌色谱柱对槲皮素、山奈素的分离，试验结果表明：Diamonsil C18(5μm，250mm×4.6mm)、Agilent ZORBAX Extend-C18(5μm，250mm×4.6mm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB(5μm，250mm×4.6mm)均对槲皮素、山奈素有良好的分离。
2、本发明组合物片中槲皮素、山奈素提取条件的考察：
为了确保测定结果真实、准确，本发明通过一系列考察，确保制备供试品溶液时将本发明组合物片中的槲皮素、山奈素提取完全。
选择正交试验设计优选影响制剂中成分提取率的3个因素：提取溶剂中盐酸浓度、提取溶剂量、回流提取时间，每个因素设置3个水平。试验设计如下：
按正交表L9(34)安排实验。实验方法如下：
按表格中条件分别提取9份供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
对实验测定结果进行统计分析，获得本发明组合物片中槲皮素、山奈素的最优提取条件：
取本发明组合物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通过实验确定本发明组合物颗粒剂中槲皮素、山奈素含量测定的色谱条件及对照品和供试品制备方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(48∶52)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素15μg，山奈素20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本发明组合物，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验例6：金钱草含量测定方法学验证
检测仪器(室温检测)：Agilent1100型高效液相色谱仪
色谱柱：Agilent Zorbax C184.6×150mm，5μm
流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(48∶52)
检测波长：360nm
对照品来源：槲皮素和山奈素(购于中国药品生物制品检定所)
供试品批号：02120401、02120502、02120603
供试品制备：取本发明组合物，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素15μg，山奈素20μg的溶液，即得。
1.含量测定方法考察：
1.1线性关系考察：
分别精密吸取槲皮素、山奈素对照品溶液2、6、10、14、18μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积积分值A为纵坐标，以槲皮素和山奈素的含量(μg)为横坐标，计算其回归方程。
槲皮素回归方程：
Area＝3.6027×104Amt+6.3193×103(r＝0.9999)，线性范围：30-270μg。
山奈素回归方程：
Area＝3.8393×104Amt+2.7966×104(r＝0.9999)，线性范围：40-360μg。
1.2稳定性试验：
对照品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定。结果表明槲皮素、山奈素在24小时内基本稳定，RSD(％)分别为0.8、1.3。
1.3精密度试验：
精密吸取供试品溶液(批号：02120603)10μl，重复进样5次，求得相对标准偏差，槲皮素、山奈素RSD(％)分别为0.5、0.8，均＜3％。
1.4重现性试验：
取同一批号(批号：02120603)样品五份，对每份进行测定，求得相对标准偏差。槲皮素、山奈素RSD(％)分别为1.5、1.2，均＜3％。
1.5回收率试验：
精密称取已知含量的同一批号(批号：02120603)的样品2.5g，分别精密加入一定量槲皮素、山奈素对照品，测定其含量，计算其回收率。槲皮素回收率为101.0％，RSD(％)＝1.8；槲皮素回收率为100.1％，RSD(％)＝0.8。
2.本制剂组合物测定结果见下表：
根据以上数据，将含量限度定为：本发明组合物制剂每1g含金钱草以槲皮素(C15H11O7)和山奈素(C15H10O6)的总量计，不得少于0.20mg。
具体实施方式
实施例1
金钱草 420g 绵萆薢 420g 瞿麦 210g
黄柏 250g 三七 42g 川楝子 250g
桃仁 210g 乌药 210g 牛膝 250g
以上九味，三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
【鉴别】
(1)取本品5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。另取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μl、对照药材及对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取本品2g，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。
(3)取本品2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用。先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【含量测定】
照高效液相色谱法：色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(48∶52)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素15μg，山奈素20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每1g含金钱草以槲皮素(C15H11O7)和山奈素(C15H10O6)的总量计，不得少于0.20mg。
【功能与主治】清热利湿，活血通淋。用于慢性非特异性前列腺炎属湿热下注，瘀血阻滞证者，症见尿频，尿急、尿道灼热涩痛，尿浊，尿道口滴白、舌黯或红或有瘀点瘀斑，苔薄黄或黄腻等。
【用法与用量】开水冲服。一次1袋，一日3次。疗程4周。
【规格】每袋装8g
实施例2
金钱草 360g 绵萆薢 460g 瞿麦 210g
黄柏 250g 三七 62g 川楝子 280g
桃仁 230g 乌药 180g 牛膝 250g
以上九味，三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
实施例3
金钱草 420g 绵萆薢 420g 瞿麦 210g
黄柏 250g 三七 42g 川楝子 250g
桃仁 210g 乌药 210g 牛膝 250g
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，装胶囊，即得。
Claims (6)
1.一种清热利湿，活血通淋的中药组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
金钱草300-500重量份、绵萆薢300-500重量份、瞿麦150-300重量份、黄柏150-350重量份、三七30-60重量份、川楝子150-350重量份、桃仁150-300重量份、乌药150-300重量份、牛膝150-350重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：
金钱草420重量份、绵萆薢420重量份、瞿麦210重量份、黄柏250重量份、三七42重量份、川楝子250重量份、桃仁210重量份、乌药210重量份、牛膝250重量份。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加50-90％乙醇回流提取1-5次，每次0.5-3.0小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮1-5次，每次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.30(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达50-90％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂或口服液体制剂。
4.如权利要求3所述的药物组合物颗粒剂的制备方法，其特征在于该方法为：
三七粉碎成细粉。金钱草、绵萆薢和黄柏加70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，放置过夜，滤过，滤液备用。其余瞿麦等五味，加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)，放冷，加乙醇使含醇量达70％，冷藏过夜，滤过，滤液与上述金钱草等醇提液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，加入上述三七细粉及糊精适量，甜菊素15g，混匀，用乙醇适量制成颗粒，干燥即得。
5.如权利要求1或2所述的药物组合物制剂的质量检测方法，该方法包括如下步骤：
A、鉴别：取本发明组合物制剂2-10g，加乙醇10-30ml，置水浴上回流15-60分钟，取上清液2-15ml，加盐酸0.5-2ml，加热回流0.5-2小时后浓缩至约1-10ml，加水5-20ml，用环己烷5-30ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取绵萆薢对照药材1-5g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含1-10mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材及对照品溶液各2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以14-5∶2比例的环己烷-乙酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B鉴别：取本发明组合物制剂2-4g，加甲醇10-30ml，超声处理5-45分钟，滤过，滤液浓缩至1-4ml，作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.05-1g，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.1-1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以20-5∶4-8∶1∶1比例的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点；
C鉴别：取本发明组合物制剂0.5-5g，加甲醇5-50ml，超声处理5-60分钟，静置，取上清液5-20ml，蒸干，残渣加水10-50ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液1-10ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取1-3次，每次10-50ml，合并正丁醇液，加水洗涤1-3次，每次20-50ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水1-5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用；先用水20-100ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇10-50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材0.1-2g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.1-2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各1-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10-1∶1∶4-7比例的正丁醇-乙酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
D含量测定：色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30-60∶40-70比例的甲醇-0.4％磷酸溶液混合溶剂为流动相；检测波长为330-380nm；对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素5-25μg，山奈素10-30μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取本发明组合物制剂约1-10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液25-75ml，密塞，称定重量，加热回流0.5-2小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明组合物制剂每1g含金钱草以槲皮素和山奈素的总量计，不得少于0.20mg。
6.如权利要求5所述的药物组合物制剂的质量检测方法，该方法包括如下步骤：
绵萆薢薄层鉴别：取本发明组合物制剂5g，加乙醇20ml，置水浴上回流40分钟，取上清液10ml，加盐酸1ml，加热回流1小时后浓缩至约5ml，加水10ml，用环己烷20ml振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绵萆薢对照药材2g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液5μl、对照药材及对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8∶2的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
黄柏薄层鉴别：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取黄柏对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10∶6∶1∶1的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点；
三七薄层鉴别：取本发明组合物制剂2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液10ml，蒸干，残渣加水25ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液5ml，摇匀，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加水洗涤2次，每次40ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，40～60目，湿法装柱，内径1cm，长25cm，小玻璃柱内，待树脂沉淀，覆以脱脂棉少许，再添加棉花少许轻压，用水冲洗并用水浸没备用；先用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4∶1∶5正丁醇-乙酸乙酯-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以48∶52的甲醇-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为360nm；对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品及山奈素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含槲皮素15μg，山奈素20μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取本发明组合物制剂约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
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