CN102579734A - 骨愈灵中药组合物及其制备方法和检测方法 - Google Patents

骨愈灵中药组合物及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种骨愈灵中药组合物及其制备方法和检测方法，该中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg，其品质更加稳定、疗效更加确切。该检测方法包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量和/或羟基红花黄素A的含量，该方法更加简便、稳定，精密度高、重现性好，能够全面、有效地表征骨愈灵中药组合物的有效成分含量，有利用于监控产品的质量。

Description

骨愈灵中药组合物及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明属于中药学领域，涉及一种用于治疗骨折及骨质疏松的中药组合物及其制备方法和检测方法，具体为骨愈灵中药组合物及其制备方法和检测方法。
背景技术
骨愈灵中药组合物的处方来源于陕西渭北骨科名医李殿生的家传骨病及骨折秘方。该药物是根据现代药理学理论，历经数年艰苦研究和临床试验而研制成功的，具有活血化瘀、消肿止痛、强筋壮骨的功效，是一种专用于治疗骨折及骨质疏松的良药。
骨愈灵中药组合物的标准来源为WS-10015(ZD-0015)-2002。其中规定，胶囊内容物为淡棕色至棕红色粉末，气微香，味微苦。骨愈灵胶囊的1000粒处方如下：三七60g；血竭60g；红花30g；乳香(制)20g；大黄20g；当归20g；川芎20g；没药(制)20g；白芍20g；熟地黄20g；赤芍20g；骨碎补20g；续断20g；自然铜(煅)20g；五加皮20g以及硼砂20g。
骨愈灵胶囊的制备方法如下：将三七、血竭分别粉碎成细粉；乳香、没药研成细粉，与上述二味配研；自然铜、硼砂分别粉成细粉，二者配研后再与上述混合粉末配研；其余红花等十味粉碎成细粉，混匀，再与上述细粉配研，混匀，装入胶囊，即得。
目前，一般通过薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VIB)分别定性检测该胶囊内容物中的血竭、大黄及大黄素、三七及三七皂苷R1、柚皮苷，而含量测定也只是通过薄层色谱法检测人参皂苷Rg1，对产品质量控制标准是每粒胶囊含三七以人参皂苷Rg1计不低于0.28mg。但是薄层色谱法检测的准确性和灵敏度都不高，而且仅检测一种有效成分的含量也不能准确、全面反映药物的有效成分含量及药效，这样导致制得的骨愈灵中药组合物有效成分的种类和含量不稳定，影响临床上的应用。因此，还有必要进一步明确骨愈灵中药组合物中能够保证疗效的有效成分的种类及其含量，并且提高骨愈灵中药组合物中这些有效成分的检测方法的准确性和灵敏度。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种骨愈灵中药组合物及其制备方法，该骨愈灵中药组合物的有效成分种类及其含量被进一步优化，质量更稳定且疗效更确切，其制备工艺也得到简化。
本发明的另一个目的是提供一种该骨愈灵中药组合物的检测方法，从而能够更加全面、有效地表征骨愈灵中药组合物的有效成分种类及其含量，更有利用于监控产品的质量。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供了一种中药组合物，该中药组合物由以下重量份的原料制成：三七60份，血竭60份，红花30份，乳香(制)20份，大黄20份，当归20份，川芎20份，没药(制)20份，白芍20份，熟地黄20份，赤芍20份，骨碎补20份，续断20份，自然铜(煅)20份，五加皮20份以及硼砂20份，而且制成的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg；优选地，制成的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg且以三七皂苷R1的含量计不少于0.2mg、以人参皂苷Rg1的含量计不少于0.9mg以及以人参皂苷Rb1的含量计不少于0.7mg，和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg。
上述中药组合物的剂型可以为固体口服制剂，例如丸剂、片剂或胶囊，优选为胶囊。
本发明提供了一种上述中药组合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：所述原料混合粉碎成细粉，干燥，混合均匀，任选地加赋形剂制成制剂，即得。
优选地，上述制备方法包括以下步骤：所述原料混合粉碎成细粉，干燥，混合均匀，装入胶囊，即得。
本发明还提供了一种上述中药组合物的检测方法，所述检测方法包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量。
具体地，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量的高效液相色谱条件包括：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为乙腈和水，按以下梯度进行洗脱，其中乙腈与水的比例为体积百分比：
优选地，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量的高效液相色谱条件还包括：
流动相流速为1.0mL/min；柱温为35℃；紫外检测波长为203nm；理论塔板数按三七皂苷R1峰计算不低于2000。
优选地，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量还包括制备供试品溶液，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测中药组合物2g，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。更优选地，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测骨愈灵胶囊内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再加80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
优选地，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量还包括制备对照品溶液，所述制备对照品溶液包括以下步骤：分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.6mg、人参皂苷Rb10.5mg、三七皂苷R10.2mg的混合溶液，即得。
更优选地，上述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量。
具体地，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量的高效液相色谱条件包括：
色谱柱为C18色谱分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相为体积比为62∶2∶72的甲醇-乙腈-0.7％(体积比)磷酸水溶液。
优选地，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量的高效液相色谱条件还包括：
流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为403nm；理论塔板数按羟基红花黄素A峰计算不低于1500。
优选地，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量还包括制备供试品溶液，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测中药组合物，精密称定0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，称重，超声处理40min，取出，放冷，称重补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。更优选地，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取骨愈灵胶囊内容物，精密称定0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，称重，超声处理40min，取出，放冷，称重补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
优选地，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量还包括制备对照品溶液，所述制备对照品溶液包括以下步骤：精密称取对照品适量，用25％的甲醇溶液制成含羟基红花黄素A为0.024mg/ml的溶液，即得。
优选地，所述检测方法测得的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg以及含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg；优选地，测得的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg且以三七皂苷Rl的含量计不少于0.2mg、以人参皂苷Rg1的含量计不少于0.9mg以及以人参皂苷Rb1的含量计不少于0.7mg，和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg。
进一步优选地，所述检测方法还包括一项或多项以下步骤：
(1)采用薄层色谱法检测血竭；
优选地，采用薄层色谱法检测血竭包括以下步骤：取中药组合物3g，加乙醚50ml，回流提取2次，每次30分钟，滤过，合并两次滤液，挥干溶剂，加甲醇10ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，2g，内径为1cm)上，收集流出液，浓缩至约2ml，作为供试品溶液；另取血竭对照药材0.1g，加乙醚10ml，密塞，振摇，放置10分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为95∶5的氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干(按照《中国药典》2010年版一部附录VIB薄层色谱法试验)。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
(2)采用薄层色谱法检测大黄和大黄素；
优选地，采用薄层色谱法检测大黄和大黄素包括以下步骤：取中药组合物5g，加甲醇50ml，盐酸5ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸至近干，残渣加水20ml使溶散，用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干溶剂，残渣加甲醇1ml，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0.03g，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶5∶1的石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后日光下检视(按照(《中国药典》2010年版一部附录VIB薄层色谱法试验)。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
(3)采用薄层色谱法检测柚皮苷；
优选地，采用薄层色谱法检测柚皮苷包括以下步骤：取中药组合物10g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶散，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后，在70℃加热4分钟，置365nm紫外灯下检视(按照《中国药典》2010年版一部附录VIB薄层色谱法试验)。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(4)采用薄层色谱法检测没药；
优选地，采用薄层色谱法检测没药包括以下步骤：取中药组合物2.5g，加乙醚50ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥至近干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取天然没药对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8∶2的环己烷-乙醚为展开剂，展开，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点显色清晰，置254nm紫外灯下检视(按照《中国药典》2010年版一部附录VIB薄层色谱法试验)。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
(5)采用薄层色谱法检测三七；
优选地，采用薄层色谱法检测三七包括以下步骤：取中药组合物5g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加水30ml使溶散，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液20ml，洗涤1次，弃去水层，再用水洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材0.5g，加水5滴，搅匀，加水饱和的正丁醇5ml，密塞，振摇10分钟，放置2小时，离心，取上清液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；再取三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰(按照《中国药典》2010年版一部附录VIB薄层色谱法试验)。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
为了更充分地保障骨愈灵中药组合物的疗效和品质，本发明人经过大量实验和研究，最终明确了影响骨愈灵中药组合物的疗效和品质的主要有效成分种类，即三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及羟基红花黄素A及其含量，同时还确定了其它影响疗效和品质的有效成分种类，其中包括大黄素、柚皮苷以及来源于血竭、大黄、没药和三七的其他成分。基于上述有效成分种类及其含量的研究成果获得的骨愈灵中药组合物品质更加稳定、疗效更加确切。此外，为了进一步全面、准确和有效地的监控骨愈灵中药组合物的上述有效成分，本发明还提供了行之有效的检测方法，与现有骨愈灵中药组合物的检测方法相比，其中除了以高效液相色谱法检测人参皂苷Rg1含量外，还在相同的高效液相色谱条件下实现了三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的含量检测，以相对简便的条件实现了三七的三种有效成分的同时检测。此外，本发明还确定了羟基红花黄素A含量的高效液相色谱最适检测条件，进一步反映了来自红花的有效成分的含量，以及确定了采用薄层色谱法定性检测其他有效成分的适宜条件。实验数据表明，相对于现有技术的常规检测方法而言，由于检测步骤和检测条件的优化，使得本发明提供的检测方法更加简便、稳定，其精密度高、重现性好，能够全面、有效地表征骨愈灵中药组合物的有效成分含量，更有利于监控产品的质量。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例2获得的检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量的HPLC图谱。
图2为实施例3获得的检测羟基红花黄素A的含量的HPLC图谱。
图3为实施例4获得的检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量的HPLC图谱；其中，图3A、3B和3C分别为采用方法一、方法二和方法三得到的检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量的HPLC图谱。
图4为实施例5获得的检测血竭的薄层色谱图(日光)；1为阴性对照，2、3、5分别为样品110409、110410、110411，4为血竭对照药材。
图5为实施例6获得的检测大黄和大黄素的薄层色谱图(日光)；1为阴性对照，2、3、6分别为样品110409、110410、110411，4为大黄素，5为大黄对照药材。
图6为实施例7获得的检测柚皮苷的薄层色谱图(365nm紫外)；其中，1为阴性对照，2、3、5分别为样品110409、110410、110411，4为柚皮苷。
图7为实施例8获得的检测没药的薄层色谱图(365nm紫外)；其中，1为天然没药对照药材，2、3、4分别为样品110409、110410、110411，5为阴性对照。
图8为实施例9获得的检测三七的薄层色谱图(日光)；1为阴性对照，2、3、6分别为样品110409、110410、110411，4为三七皂苷R1，5为三七对照药材。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来详细说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1骨愈灵胶囊的制备
处方和制法如下：
处方(1000粒)：三七60g；血竭60g；红花30g；乳香(制)20g；大黄20g；当归20g；川芎20g；没药(制)20g；白芍20g；熟地黄20g；赤芍20g；骨碎补20g；续断20g；自然铜(煅)20g；五加皮20g以及硼砂20g。
以上十六味，混合粉碎成细粉，干燥，混合均匀，装入胶囊，即得。
实施例2骨愈灵胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量检测
本实施例通过高效液相色谱法检测了实施例1制备的骨愈灵胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。
仪器：高效液相色谱仪，美国Alltech，型号UVIS-201，紫外检测器。
试剂：乙腈为色谱纯试剂；水为超纯水；其余试剂为分析纯。
对照品：人参皂苷Rb1(110704-200318)、人参皂苷Rg1(110703-200424)和三七皂苷R1(110745-200414)均购自中国药品生物制品检定研究院。
下文各实施例中涉及的相应仪器、试剂和对照品相同。
1、色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil 100-5c8 E52474，4.6mm×250mm，5μm)；紫外检测波长为203nm；理论板数按三七皂苷R1峰计不低于2000；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；以乙腈作为流动相A，以水作为流动相B，按以下设定进行梯度洗脱，理论塔板数按三七皂苷R1峰计算应不低于2000：
Figure BSA00000623236000091
2、对照品溶液的制备
分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.6mg、人参皂苷Rb10.51mg、三七皂苷R10.2mg的混合溶液，即得。
3、供试品溶液的制备
取骨愈灵胶囊内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
4、测定方法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
HPLC图谱见图1。将供试品图谱与对照品图谱比较，根据《中华人民共和国药典》2010版附录VD“高效液相色谱法”计算，测得每制剂单位含三七以三七皂苷R1计为0.358mg，以人参皂苷Rg1计为1.635mg以及以人参皂苷Rb1计为1.018mg。
5、方法学验证
(1)专属性
取骨愈灵胶囊内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
取三七空白样2g，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在以处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
分别精密吸取溶剂及上述各测试溶液10μl，注入液相色谱仪，结果见图3C。
(2)溶液稳定性试验
取上述供试品溶液各10μl，于0、4、8、16、24小时注入液相色谱仪，试验结果见表1。
表1溶液稳定性试验结果
  序号   R1   Rg1   Rb1
  0h   355825   1303642   851404
  4h   344828   1321996   842718
  8h   337953   1347609   859874
16h 348637 1355207 878704
24h 342138 1355654 858112
  平均峰面积   345876.2   821.821.6   858162.4
  RD   6790.63   23074.52   13314.42
  RSD   1.96％   1.73％   1.55％
(3)精密度试验
称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各5.06mg、12.22mg及10.81mg于20ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次、结果见表2。
表2精密度试验结果
(4)线性
称取三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各5.06mg、12.22mg及10.81mg于10ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
分别精密量取上述溶液2μl、4μl、5μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3。
表3线性试验结果
Figure BSA00000623236000121
Figure BSA00000623236000122
Figure BSA00000623236000123
表4方法学验证结果
Figure BSA00000623236000124
Figure BSA00000623236000131
实施例3骨愈灵胶囊中羟基红花黄素A的含量的检测
本实施例通过高效液相色谱法检测了实施例1制备的骨愈灵胶囊中羟基红花黄素A的含量。
1、色谱条件：
色谱柱：C18色谱分析柱(4.6mm×250mm，5μm)，保护柱(ODS，4.0mm×3.0mm)；流动相：甲醇-乙腈-0.7％(体积比)磷酸水溶液(体积比＝62∶2∶72)；紫外检测波长：403nm；流速：1.0ml/min；柱温：30C。
在以上色谱条件下对照品羟基红花黄素A与相邻色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数按羟基红花黄素A峰记不低于1500。
2、对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用25％的甲醇溶液制成含羟基红花黄素A为0.024mg/ml的溶液。对照品羟基红花黄素A购自中国食品药品检定研究院。
3、供试品溶液的制备
取骨愈灵胶囊内容物细粉约0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，称重，超声处理40min，取出，放冷，称重补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
4、测定法
分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
HPLC图谱见图2。将供试品图谱与对照品图谱比较，根据《中华人民共和国药典》2010版附录VD“高效液相色谱法计算”，每制剂单位含红花按羟基红花黄素A计为0.034mg。
实施例4不同检测方法的比较
本实施例比较了采用不同的供试品溶液制备方法及色谱条件对实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物中所述3种人参皂苷进行含量检测的影响。
对照品溶液的制备方法如下：分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.6mg、人参皂苷Rb10.5mg、三七皂苷R10.2mg的混合溶液，即得。
方法一：
(1)供试品溶液的制备
取骨愈灵胶囊20粒，除去包衣，取内容物，研匀，取约1.0g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流提取至无色，弃去乙醚液，残渣挥干，再加甲醇适量，加热回流提取至无色，减压回收甲醇至干，残渣加水25ml溶解，移置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次(20ml，20ml，10ml，10ml，10ml)，合并正丁醇液，加正丁醇饱和的水回洗2次，每次30ml，减压回收正丁醇至干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)色谱条件
C18色谱柱[4.6mm×250mm，5μm，江苏汉邦公司生产]；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按以下的设定进行梯度洗脱；紫外检测波长为203nm；理论板数按三七皂苷Rl峰计算为7734；其余条件同实施例1。
Figure BSA00000623236000141
分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。HPLC图谱见图3A。
方法二：
(1)供试品溶液的制备
取骨愈灵胶囊20粒，除去包衣，取内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流1小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，提取液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加在D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
(2)色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按以下的设定进行梯度洗脱；紫外检测波长为203nm；理论板数按三七皂苷R1峰计算不低于4000；其余条件同实施例1。
Figure BSA00000623236000151
分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。HPLC图谱见图3B。
方法三：
(1)供试品溶液的制备
取骨愈灵胶囊20粒，除去包衣，取内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用水10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm，湿法上样)上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
(2)色谱条件：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按以下的设定进行梯度洗脱；紫外检测波长为203nm；理论板数按三七皂苷R1峰计算不低于4000；其余条件同实施例1。
Figure BSA00000623236000161
分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。HPLC图谱见图3C。
通过比较上述三种方法的色谱图可见，方法三的分离效果明显优于方法一和方法二。
实施例5骨愈灵胶囊中血竭的检测
取实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物3g，加乙醚50ml，回流提取2次，每次30分钟，滤过，合并两次滤液，挥干溶剂，加甲醇10ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，2g，内径为1cm)上，收集流出液，浓缩至约2ml，作为供试品溶液。另取血竭对照药材0.1g，加乙醚10ml，密塞，振摇，放置10分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(95∶5)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。薄层色谱如图4所示。
实施例6骨愈灵胶囊中大黄和大黄素的检测
取实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物5g，加甲醇50ml，盐酸5ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸至近干，残渣加水20ml使溶散，用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干溶剂，残渣加甲醇1ml，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.03g，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。薄层色谱如图5所示。
实施例7骨愈灵胶囊中柚皮苷的检测
取实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物10g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后，在70℃加热4分钟，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。薄层色谱如图6所示。
实施例8骨愈灵胶囊中没药的检测
取实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物2.5g，加乙醚50ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥至近干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取天然没药对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙醚(8∶2)为展开剂，展开，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点显色清晰，置254nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。薄层色谱如图7所示。
实施例9骨愈灵胶囊中三七的检测
取实施例1制备的骨愈灵胶囊内容物5g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加水30ml使溶散，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液20ml，洗涤1次，弃去水层，再用水洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，加水5滴，搅匀，加水饱和的正丁醇5ml，密塞，振摇10分钟，放置2小时，离心，取上清液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。再取三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。薄层色谱如图8所示。
实施例10骨愈灵胶囊的药理活性研究
1.试验目的观察骨愈灵胶囊对实验性大鼠桡骨骨折的治疗作用。
2.试验材料
(1)药品与试剂：骨愈灵胶囊，规格：0.4g内容物/粒(按实施例1的处方和制法制备)。实验时，用蒸馏水将内容物配成6.25g内容物/100ml、3.12g内容物/100ml、1.56g内容物/100ml的混悬液，给药时摇匀。丹参注射液，江苏神龙药业有限公司生产，国药准字Z32020162，批号：061219-1。
(2)实验动物：SD种大鼠50只，雌雄各半，体重180～220g，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2002-005。饲料为动物提供单位供给。饲养条件：陕西中医学院中药药理学实验室(国家中医管理局中医药科研实验室分级：二级)。
3.试验方法
(1)造模、给药和处理：取SD种大鼠50只，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧位固定，手术取前臂前外侧切口，长约0.8cm，切开皮肤、深筋膜，从前臂伸肌与屈肌之间，桡动脉外侧分离暴露桡骨中段，在旋前圆肌止点下方1mm处用骨剪咬断桡骨，造成双侧标准骨折，逐层缝合后随机分为5组，每组10只，次日开始给药。骨愈灵大、中、小剂量组分别灌胃6.25g/100ml、3.13g/100ml、1.56g/100ml的骨愈灵混悬液，给药剂量分别为1.25g内容物/kg(相当于人用剂量的15倍)、0.63g内容物/kg(相当于人用剂量的7.5倍)、0.31g内容物/kg(相当于人用剂量的3.75倍)，丹参组灌胃丹参注射液1.5g生药/kg，空白对照组给予等容积常水。各组每天给药1次，给药容积2ml/100g。
每组取一半动物(3雄2雌)于给药第1天、第8天分别腹腔注射四环素50mg/kg标记，第14天脱臼处死，剪取动物前臂拍X线片，分离造模处桡骨。每组取4例桡骨标本置于4℃冷丙酮中，每隔12小时更换丙酮1次，连续6次。将桡骨标本浸于浸透剂中，抽真空后，包埋剂包埋，用JungK硬质切片机切5μm薄切片(不脱钙片)，1％甲苯胺兰染色，D.P.X.封固，于荧光显微镜下观察骨折愈合情况。剩余标本，用10％甲醛固定，14.3％EDTA脱钙，梯度酒精脱水后包埋，进行纵向切片(脱钙片)，HE染色，于光镜下观察骨折愈合情况。
每组另一半动物(2雄3雌)于给药第17天、第24天分别腹腔注射四环素50mg/kg标记，第31天按上述操作进行拍X线片，切制不脱钙片和脱钙片，观察骨折愈合情况。骨愈灵胶囊对骨组织形态计量学动态参数的影响(31天)参见表5。
表5对骨组织形态计量学动态参数的影响(31天)
Figure BSA00000623236000191
Figure BSA00000623236000192
与空白对照组比较：*P＜0.05
6.结论
X线片显示，骨折给药31天后，骨愈灵各组骨折端有大量骨痂生长，有部分髓腔再通，骨折愈合明显优于空白对照组，而给药14天作用不显著，表明骨愈灵胶囊能明显促进骨折愈合后期骨痂的生长与改建，促进髓腔提前再通。骨组织形态计量学参数表明，骨折给药31天后，骨愈灵胶囊能促进骨折骨痂生长，提高成骨细胞活性和指数，促进基质钙化。表现为骨形成率、矿化骨痂面积和均宽、成骨细胞指数、四环素标记面积、矿化沉积率均高于空白对照组，而类骨质面积和类骨质均宽却低于空白对照组。
综上所述，骨愈灵胶囊连续给药1个月，对大鼠实验性桡骨骨折具有明显的促进骨折愈合作用，能改善骨折愈合质量。

Claims (13)

1.一种中药组合物，该中药组合物由以下重量份的原料制成：三七60份，血竭60份，红花30份，乳香(制)20份，大黄20份，当归20份，川芎20份，没药(制)20份，白芍20份，熟地黄20份，赤芍20份，骨碎补20份，续断20份，自然铜(煅)20份，五加皮20份以及硼砂20份，其特征在于，制成的所述中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg；
优选地，制成的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg且以三七皂苷R1的含量计不少于0.2mg、以人参皂苷Rg1的含量计不少于0.9mg以及以人参皂苷Rb1的含量计不少于0.7mg，和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的剂型为固体口服制剂，例如丸剂、片剂或胶囊，优选为胶囊。
3.根据权利要求1或2所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：所述原料混合粉碎成细粉，干燥，混合均匀，任选地加赋形剂制成制剂，即得；
优选地，所述制备方法包括以下步骤：所述原料混合粉碎成细粉，干燥，混合均匀，装入胶囊，即得。
4.根据权利要求1或2所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量的高效液相色谱条件包括：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为乙腈和水，按以下梯度进行洗脱，其中乙腈与水的比例为体积百分比：
Figure FSA00000623235900011
Figure FSA00000623235900021
5.根据权利要求4所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量的高效液相色谱条件还包括：
流动相流速为1.0mL/min；柱温为35℃；紫外检测波长为203nm；理论塔板数按三七皂苷R1峰计算不低于2000。
6.根据权利要求4或5所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量还包括制备供试品溶液，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测中药组合物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得；
优选地，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测骨愈灵胶囊内容物，研匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿150ml，加热回流3小时，弃去氯仿液，药渣低温挥干，加甲醇150ml，加热回流3小时，滤过，药渣用10ml甲醇洗涤，合并甲醇液，在70℃水浴上蒸干，加水30ml微热使溶散，加在已处理好的D101大孔树脂柱上，吸附半小时，流出液反复吸附三次，用水50ml洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及三七皂苷R1的含量还包括制备对照品溶液，所述制备对照品溶液包括以下步骤：分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含人参皂苷Rg10.6mg、人参皂苷Rb10.5mg、三七皂苷R10.2mg的混合溶液，即得。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量的高效液相色谱条件包括：
色谱柱为C18色谱分析柱；
流动相为体积比为62∶2∶72的甲醇-乙腈-0.7％(体积比)磷酸水溶液。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量的高效液相色谱条件还包括：
流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；紫外检测波长为403nm；理论塔板数按羟基红花黄素A峰计算不低于1500。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量还包括制备供试品溶液，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取待测中药组合物，精密称定0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，称重，超声处理40min，取出，放冷，称重补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
优选地，所述制备供试品溶液包括以下步骤：取骨愈灵胶囊内容物，精密称定0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，称重，超声处理40min，取出，放冷，称重补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测中药组合物中羟基红花黄素A的含量还包括制备对照品溶液，所述制备对照品溶液包括以下步骤：精密称取对照品适量，用25％的甲醇溶液制成含羟基红花黄素A为0.024mg/ml的溶液，即得。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法测得的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg以及含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg；
优选地，测得的中药组合物每制剂单位含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总含量计不少于2.2mg且以三七皂苷R1的含量计不少于0.2mg、以人参皂苷Rg1的含量计不少于0.9mg以及以人参皂苷Rb1的含量计不少于0.7mg，和/或含红花以羟基红花黄素A的含量计不少于0.03mg。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括一项或多项以下步骤：
(1)采用薄层色谱法检测血竭；
优选地，采用薄层色谱法检测血竭包括以下步骤：取所述中药组合物3g，加乙醚50ml，回流提取2次，每次30分钟，滤过，合并两次滤液，挥干溶剂，加甲醇10ml使溶解，加在中性氧化铝柱上，收集流出液，浓缩至约2ml，作为供试溶液；另取血竭对照药材0.1g，加乙醚10ml，密塞，振摇，放置10分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为95∶5的氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干；
(2)采用薄层色谱法检测大黄和大黄素；
优选地，采用薄层色谱法检测大黄和大黄素包括以下步骤：取所述中药组合物5g，加甲醇50ml，盐酸5ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸至近干，残渣加水20ml使溶散，用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干溶剂，残渣加甲醇1ml，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0.03g，同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶5∶1的石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后日光下检视；
(3)采用薄层色谱法检测柚皮苷；
优选地，采用薄层色谱法检测柚皮苷包括以下步骤：取所述中药组合物10g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶散，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后，在70℃加热4分钟，置365nm紫外灯下检视；
(4)采用薄层色谱法检测没药；
优选地，采用薄层色谱法检测没药包括以下步骤：取所述中药组合物2.5g，加乙醚50ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥至近干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取天然没药对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8∶2的环己烷-乙醚为展开剂，展开，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点显色清晰，置254nm紫外灯下检视；
(5)采用薄层色谱法检测三七；
优选地，采用薄层色谱法检测三七包括以下步骤：取所述中药组合物5g，加甲醇100ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加水30ml使溶散，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液20ml，洗涤1次，弃去水层，再用水洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材0.5g，加水5滴，搅匀，加水饱和的正丁醇5ml，密塞，振摇10分钟，放置2小时，离心，取上清液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；再取三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶40∶22∶10的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
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