CN103926366B - 一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法 - Google Patents

一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法，包括：三七和黄芪供试品溶液的制备、三七和黄芪对照品溶液的制备、三七和黄芪的薄层鉴别，降香供试品溶液的制备、降香对照药材溶液的制备、降香薄层鉴别以及采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。试验证明，本方法具有很好的线性、重复性、重现性和稳定性，回收率高，有助于更加全面控制芪参益气滴丸的质量。

Description

一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法
技术领域：
本发明属于中药检测领域，具体涉及一种芪参益气滴丸的鉴别方法与含量测定方法。
背景技术：
芪参益气滴丸（QSYQ）是由黄芪、丹参、三七和降香油组成的中药复方制剂。于2003年经中国国家食品药品监督管理局批准用于治疗冠心病、心绞痛，具有剂量小、服用方便、溶出速度快、可直接经粘膜吸收入血、生物利用度高、疗效高及无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点。
临床前药效学试验表明，芪参益气滴丸可以使心肌梗塞犬的梗塞范围缩小，缺血性心电图改善，血清酶CK和LDH活性降低，血浆ET和TXB2水平降低，6-Keto-PGF1α活性和6-Keto-PGF1α/TXB2比值升高；可使心肌缺血再灌注损伤大鼠的梗塞范围缩小，SOD活性增加。芪参益气滴丸可使大鼠体外血栓长度缩短，重量减轻，并可使血浆及全血粘度降低；可使高脂血症家兔的TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平降低，HDL-C水平升高，使主动脉TC含量和肝脏TG及MDA含量降低；并可使花生四烯酸和胶原诱导的血小板聚集率降低；犬血流动力学试验表明，芪参益气滴丸可通过扩张冠脉血管使冠脉流量增加，使心肌耗氧指数降低；在不增加左室做功情况下，使心搏出量和心输出量增加等。
在生产过程中，需要对芪参益气滴丸的制备过程的中间体和成品进行检测，以随时控制产品的质量，现有检测方法，有些准确性差，灵敏度不高，有些使用价格昂贵的试剂和仪器，有些操作步骤繁琐，为了更好地控制芪参益气滴丸的质量，本发明研究出一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法。
发明内容：
本发明公开了一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法。
根据本发明，三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，加氨试液超声使溶解，过大孔树脂柱，依次使用水、乙醚、三氯甲烷、甲醇洗脱，收集洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液；
②三七和黄芪对照品溶液的制备：取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成混合溶液，即为三七和黄芪对照品溶液；
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液的斑点。
根据本发明，降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，加氨试液使溶解，大孔树脂处理，收集洗脱液即为降香供试品溶液；
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材，加乙醚，水浴回流，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇使溶解，即为降香对照药材溶液；
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液的斑点。
根据本发明，丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，置量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心或过滤，即得供试品溶液；
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成溶液，即得对照品溶液。
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
根据本发明实施方式之一，所述三七和黄芪供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml超声使溶解，通过大孔树脂柱；用水18-30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷3-15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇3-7ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液1-2ml，收集后2-6ml甲醇洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液。
根据本发明另一实施方式，所述三七和黄芪的鉴别方法的步骤③为：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-16%硫酸乙醇溶液，在100-140℃加热至斑点显色清晰。
考察了三七阴性样品溶液和黄芪阴性样品溶液对实验的影响，结果表明，在该实验条件下，阴性样品溶液均无干扰。
考察了不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果表明上述不同条件对鉴别试验无影响。
根据本发明再一实施方式，所述降香供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml使溶解，通过大孔树脂柱；用水18-30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚1-3ml使溶解，即为降香供试品溶液。
根据本发明再一实施方式，所述降香对照药材溶液的制备为：取降香对照药材1-5g，加乙醚10-50ml，水浴回流15-60分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5-8ml使溶解，即为降香对照药材溶液。
根据本发明再一实施方式，所述降香的鉴别方法的步骤③为：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%-5%香草醛硫酸溶液或1%香草醛硫酸-乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
考察了三降香阴性样品溶液对实验的影响，结果表明，在该实验条件下，阴性样品溶液均无干扰。
考察了不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果表明上述不同条件对鉴别试验无影响。
根据本发明再一实施方式，所述丹参素的含量测定方法的步骤①供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.3-1.5g，置10-25ml量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
根据本发明再一实施方式，所述丹参素的含量测定方法的步骤③丹参素的含量测定所用超高效液相色谱法的色谱条件为：反相色谱柱；流动相A相为磷酸-乙腈溶液，流动相B相为磷酸溶液，梯度洗脱；柱温：20-40℃；检测波长：270-320nm。
优选的，所述流动相A相为含0.02%磷酸的80%乙腈，所述流动相B相为0.02%的磷酸水溶液，所述梯度洗脱的梯度为：
0-1.6分钟，9%→22%A相；
1.6-1.8分钟，22%→26%A相；
1.8-8.0分钟，26%→39%A相；
8.0-8.4分钟，39%→9%A相；
8.4-10.0分钟，9%A相。
优选的，所述柱温为30℃。
优选的，所述检测波长为280nm。
根据本发明，丹参素的含量测定方法中，所述色谱条件的丹参素理论板数不低于8000。
试验证明，本方法具有很好的线性、重复性、重现性和稳定性，回收率高，有助于更加全面控制芪参益气滴丸的质量。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1 芪参益气滴丸鉴别
1.1 三七和黄芪的薄层鉴别
1.1.1 三七和黄芪供试品溶液的制备
取本品1.0g，加氨试液5ml超声使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚10ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇4ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液1ml，收集后3ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
1.1.2 三七和黄芪对照品溶液的制备
三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 1mg、黄芪甲苷1mg及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
1.1.3 三七阴性样品溶液的制备
按芪参益气滴丸的处方配比，取除三七的其他各味，按工艺制得的样品，再按三七和黄芪供试品溶液制备方法制得三七阴性样品溶液。
1.1.4 黄芪阴性样品溶液的制备
按芪参益气滴丸的处方配比，取除黄芪的其他各味，按工艺制得的样品，再按三七和黄芪供试品溶液制备方法制得黄芪阴性样品溶液。
1.1.5 薄层条件及结果
照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述四种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
三七和黄芪供试品色谱中，在与三七和黄芪对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
阴性样品溶液无干扰。结果见图1。
在上述试验基础上，对本方法进行了耐用性试验。试验包括不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果见图2～4，考察结果表明上述不同条件对试验均无影响。
1.2降香的薄层鉴别
1.2.1 降香供试品溶液的制备
取本品1.0g，加氨试液5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚10ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚1ml使溶解，作为降香供试品溶液。
1.2.2 降香对照药材溶液的制备
取降香对照药材2g，加乙醚20ml，水浴回流30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为降香对照药材溶液。
1.2.3 阴性样品溶液的制备
按芪参益气滴丸的处方配比，取除降香的其他各味，按工艺制得的样品，再按降香供试品溶液制备方法制得降香阴性样品溶液。
1.2.4．薄层条件及结果
照薄层色谱法（中国药典2010年版一部 附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
降香供试品色谱中，在与降香对照药材色谱相应的位置上，至少显两个相同颜色的斑点。
阴性样品溶液无干扰。结果见图5。
在上述试验基础上，对本方法进行了耐用性试验。试验包括不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果见图6～8，考察结果表明上述不同条件对本试验无影响。
2.丹参素含量测定
2.1仪器与试药
仪器：Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；
色谱柱：Waters Acquity UPLCTMHSS T3 (100mm×2.1mm，1.8μm)；ThermoHypersil GOLD aQ(100mm×2.1mm，1.9μm)；Agilent SB- C18 RRHD(100mm×2.1mm，1.8μm)
试剂：甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），磷酸（分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），水为去离子水。
对照品：丹参素钠（中国药品生物制品检定所购置，批号：110855-200809，供含量测定用）；样品：（天津天士力制药股份有限公司，批号： 120206、120207、120208）
2.2色谱条件
色谱柱：Waters Acquity UPLCTMHSS T3 (柱长为100mm，内径为2.1mm，1.8μm)；
流动相：以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A,以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；检测波长：280nm。理论板数按丹参素峰计算为19364。
2.3提取方法的确定与考察
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号： 120206）样品0.3g，精密称定，分别置10ml、25ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。按前述色谱条件分析，测定样品中丹参素含量。结果见表（1）。
结果在取样量一致前提下，溶剂用量不同，10ml与25ml测定结果基本一致，RAD为0.60%，为节省溶剂，提取溶剂用量优选10ml。
表（1）提取溶剂量的考察
2.4溶液的制备
2. 4.1对照品溶液的制备
取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1ml含0.1408mg的溶液（相当于每1ml含丹参素0.1267mg）即得。色谱图见图9。
2.4.2供试品溶液的制备
取芪参益气滴丸0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。色谱图见图10。
2.4.3阴性样品溶液的制备
按芪参益气滴丸处方配比，取除丹参外其他药材，按工艺制成滴丸剂，再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。色谱图见图11。
2.5标准曲线的制备
取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1ml含丹参素为0.6336mg的溶液；
精密量取0.6336mg/ml的对照品溶液5ml，置10ml量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.3168mg/ml的对照品溶液；
精密量取0.6336mg/ml的对照品溶液5ml，置25ml量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.1267mg/ml的对照品溶液；
精密量取0.3168mg/ml的对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.06336mg/ml的对照品溶液；
精密量取0.06336mg/ml的对照品溶液2ml，置5ml量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.02534mg/ml的对照品溶液；
精密量取0.06336mg/ml的对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.01267mg/ml的对照品溶液；
分别精密吸取上述对照品溶液各2μl，注入液相色谱仪进行分析，分别测定各自峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：
Y=1.952×106X－5998r=0.9999。结果表明丹参素进样量在0.02534～1.2672μg范围内线性良好，结果见表（2）。
表（2） 丹参素标准曲线
2.6进样精密度试验
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号：120206）样品0.3g，精密称定，取1份，按供试品溶液的制备方法操作，然后进行分析，精密吸取供试品溶液2μl，连续进样6次，样品中丹参素峰面积值的RSD为0.22%，进样精密度试验符合要求，结果见表（3）。
表（3） 丹参素进样精密度试验
2.7重复性试验
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号：120206）样品0.3g，精密称定，按照供试品溶液制备操作，然后进行测定，样品中丹参素含量平均值为4.1769mg/g，RSD为0.53%，符合要求，结果见表（4）。
表（4） 重复性试验
2.8稳定性试验
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号：120206）样品0.3g，精密称定，按照供试品溶液制备操作，然后进行测定，分别精密吸取供试品溶液2μl，分别于0、2、4、8、10、12、24小时进样，测定丹参素的峰面积平均值为494546，RSD为0.52%，结果表明，供试品溶液在24小时内测定稳定，结果见表（5）。
表（5） 稳定性试验
2.9回收率试验
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号：120206）样品0.15g，精密称定，取6份，精密称定，精密加入每1ml含丹参素对照品0.6336mg的75%甲醇溶液1ml，按照供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，然后进行测定，计算回收率，结果丹参素平均回收率为99.38%，RSD为0.88%。结果见表（6）。
表（6） 丹参素回收率试验
2.10耐用性试验
取同一批号（天津天士力制药股份有限公司，批号：120207）样品2份，按供试品溶液制备操作，色谱柱分别为Waters Acquity UPLCTMHSS T3 (柱长为100mm，内径为2.1mm，1.8μm)；Thermo Hypersil GOLD aQ(柱长为100mm，内径为2.1mm，1.9μm)；Agilent SB- C18 RRHD(柱长为100mm，内径为2.1mm，1.8μm)，然后进行测定，计算样品中丹参素含量。结果平均含量为4.1987mg/g，RSD%为0.51%。结果见表（7）。结果使用不同色谱柱对含量测定无影响。结果见图12～13。
表（7） 不同色谱柱对含量测定的影响
2.11丹参素理论板数的确定
参照表（7）丹参素最低的理论板数，将本品含量测定中丹参素理论板数定为8000。
附图说明：
图1：阴性样品溶液对照结果；从左至右：样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208），三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品混合溶液（中检所），三七阴性样品溶液，黄芪阴性样品溶液，硅胶板为MERCK硅胶G板，T=25℃，RH=39%。
图2：三七和黄芪的鉴别方法耐用性试验结果1；从左至右：样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208），三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品混合溶液（中检所），硅胶板为MERCK硅胶G板，T=8℃，RH=25%。
图3：三七和黄芪的鉴别方法耐用性试验结果2；从左至右：样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208），三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品混合溶液（中检所），硅胶板为MERCK硅胶G板，T=25℃，RH=75%。
图4：三七和黄芪的鉴别方法耐用性试验结果3；从左至右：样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208），三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品混合溶液（中检所），硅胶板为烟台硅胶G板，T=25℃，RH=39%。
图5：阴性样品溶液对照结果；从左至右：阴性样品溶液，样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208）；所用硅胶板：烟台高效硅胶G板，T=26℃，RH=33%。
图6：降香的鉴别方法耐用性试验结果1；从左至右：阴性样品溶液，样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208）；所用硅胶板：烟台高效硅胶G板，T=8℃，RH=25%。
图7：降香的鉴别方法耐用性试验结果2；从左至右：阴性样品溶液，样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208）；所用硅胶板：烟台高效硅胶G板，T=26℃，RH=75%。
图8：降香的鉴别方法耐用性试验结果2；从左至右：阴性样品溶液，样品（批号120206），样品（批号120207），样品（批号120208）；所用硅胶板：MERCK硅胶G板，T=26℃，RH=33%。
图9：丹参素的含量测定方法对照品色谱图(Waters Acquity UPLCTMHSS T3）。
图10：丹参素的含量测定方法供试品色谱图(Waters Acquity UPLCTMHSS T3)。
图11：丹参素的含量测定方法中耐用性试验的阴性样品色谱图(Waters AcquityUPLCTMHSS T3)。
图12：丹参素的含量测定方法中耐用性试验不同色谱柱的供试品色谱图1（ThermoHypersil GOLD aQ）。
图13：丹参素的含量测定方法中耐用性试验不同色谱柱的供试品色谱图2（Agilent SB- C18 RRHD）。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
（1）三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸1.0g，加氨试液5ml超声使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚10ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇4ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液1ml，收集后3ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
②三七和黄芪对照品溶液的制备：三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 1mg、黄芪甲苷1mg及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
（2）降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸1.0g，加氨试液5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚10ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚1ml使溶解，作为供试品溶液。
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材2g，加乙醚20ml，水浴回流30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
（3）丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1ml含0.1408mg的溶液（相当于每1ml含丹参素0.1267mg）即得。
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
色谱条件：仪器：Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；色谱柱：Waters AcquityUPLCTMHSS T3 (100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相：以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A,以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；检测波长：280nm。理论板数按丹参素峰计算为19364。
按上述色谱条件测定芪参益气滴丸（批号120206），丹参素含量4.1769mg/g。
实施例2
（1）三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸0.5g，加氨试液3ml超声使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径0.8cm，柱长7cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水18ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷3ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇4ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液2ml，收集后2ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
②三七和黄芪对照品溶液的制备：三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 1mg、黄芪甲苷1mg及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液各15µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在120℃加热至斑点显色清晰。
（2）降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸0.5g，加氨试液3ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径0.8cm，柱长7cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水18ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液。
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材1.5g，加乙醚10ml，水浴回流15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液各15µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液-乙醇（1:9）的混合溶液，加热至斑点显色清晰。
（3）丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸0.5g，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加65%甲醇制成每1ml含0.1379mg的溶液（相当于每1ml含丹参素0.1241mg）即得。
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
色谱条件：仪器：Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；色谱柱Thermo HypersilGOLD aQ(柱长为100mm，内径为2.1mm，1.9μm)；；流动相：以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A，以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；检测波长：270nm。理论板数按丹参素峰计算为15724。
按上述色谱条件测定芪参益气滴丸（批号120207），丹参素含量4.2208mg/g。
实施例3
（1）三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸2g，加氨试液10ml超声使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.2cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水25ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚15ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷10ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液2ml，收集后3ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
②三七和黄芪对照品溶液的制备：三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 1mg、黄芪甲苷1mg及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在140℃加热至斑点显色清晰。
（2）降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸2g，加氨试液10ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.2cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水25ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚15ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚3ml使溶解，作为供试品溶液。
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材4g，加乙醚40ml，水浴回流60分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇4ml使溶解，作为对照药材溶液。
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液-乙醇（5:5）的混合溶液，加热至斑点显色清晰。
（3）丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸0.8g，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加85%甲醇制成每1ml含0.1512mg的溶液（相当于每1ml含丹参素0.1361mg）即得。
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
色谱条件：仪器：Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent SB-C18 RRHD(柱长为100mm，内径为2.1mm，1.8μm)；流动相：以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A，以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：35℃；检测波长：300nm。理论板数按丹参素峰计算为15786。
按上述色谱条件测定芪参益气滴丸（批号120208），丹参素含量4.4518mg/g。
实施例4
（1）三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸5g，加氨试液25ml超声使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.2cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚20ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇7ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液1ml，收集后6ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
②三七和黄芪对照品溶液的制备：三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 1mg、黄芪甲苷1mg及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（60：30：10）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以15%硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。
（2）降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸5g，加氨试液25ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.2cm，柱长5cm，流速0.5~0.7ml/分）；用水30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚20ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚5ml使溶解，作为供试品溶液。
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材1g，加乙醚10ml，水浴回流15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液8ml以及所述降香对照药材溶液20µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
（3）丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加40%甲醇制成每1ml含0.1218mg的溶液（相当于每1ml含丹参素0.1096mg）即得。
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
色谱条件：仪器：Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；色谱柱：Waters AcquityUPLCTMHSS T3 (柱长为100mm，内径为2.1mm，1.8μm)；流动相：以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A，以0.02%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.4ml/min；柱温：20℃；检测波长：320nm。理论板数按丹参素峰计算为19021。
按上述色谱条件测定芪参益气滴丸（批号120309），丹参素含量4.2901mg/g。

Claims (10)

1.一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法，其特征在于：
(1)三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤：
①三七和黄芪供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，加氨试液超声使溶解，过大孔树脂柱，依次使用水、乙醚、三氯甲烷、甲醇洗脱，收集洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液；
②三七和黄芪对照品溶液的制备：取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成混合溶液，即为三七和黄芪对照品溶液；
③三七和黄芪的薄层鉴别：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液的斑点；
(2)降香的鉴别方法，包括如下步骤：
①降香供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，加氨试液使溶解，大孔树脂处理，收集洗脱液即为降香供试品溶液；
②降香对照药材溶液的制备：取降香对照药材，加乙醚，水浴回流，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇使溶解，即为降香对照药材溶液；
③降香薄层鉴别：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂，其中，正己烷、丙酮、乙酸乙酯的比例为8：1：1，展开，取出，晾干，显色，比较所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液的斑点；
(3)丹参素的含量测定方法，包括如下步骤：
①供试品溶液的制备：取芪参益气滴丸，置量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心或过滤，即得供试品溶液；
②对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成溶液，即得对照品溶液；
③丹参素的含量测定：采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述三七和黄芪供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml超声使溶解，通过大孔树脂柱；用水18-30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷3-15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇3-7ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液1-2ml，收集后2-6ml甲醇洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液。
3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述三七和黄芪的鉴别方法的步骤③为：取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，其中，三氯甲烷、甲醇、水的比例为60：30：10，展开，取出，晾干，喷以5-16％硫酸乙醇溶液，在100-140℃加热至斑点显色清晰。
4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml使溶解，通过大孔树脂柱；用水18-30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚1-3ml使溶解，即为降香供试品溶液。
5.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香对照药材溶液的制备为：取降香对照药材1-5g，加乙醚10-50ml，水浴回流15-60分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5-8ml使溶解，即为降香对照药材溶液。
6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香的鉴别方法的步骤③为：取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂，其中，正己烷、丙酮、乙酸乙酯的比例为8：1：1，展开，取出，晾干，喷以1％-5％香草醛硫酸溶液或1％香草醛-硫酸-乙醇，加热至斑点显色清晰。
7.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述丹参素的含量测定方法的步骤①供试品溶液的制备为：取芪参益气滴丸0.3-1.5g，置10-25ml量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述丹参素的含量测定方法的步骤③丹参素的含量测定所用超高效液相色谱法的色谱条件为：反相色谱柱；流动相A相为磷酸-乙腈溶液，流动相B相为磷酸溶液，梯度洗脱；柱温：20-40℃；检测波长：270-320nm。
9.根据权利要求8的检测方法，其特征在于，所述流动相A相为含0.02％磷酸的80％乙腈，所述流动相B相为0.02％的磷酸水溶液，所述梯度洗脱的梯度为：
0-1.6分钟，9％→22％A相；
1.6-1.8分钟，22％→26％A相；
1.8-8.0分钟，26％→39％A相；
8.0-8.4分钟，39％→9％A相；
8.4-10.0分钟，9％A相。
10.根据权利要求8或9的检测方法，其特征在于，所述色谱条件的丹参素理论板数不低于8000。
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