CN111514128A - 羟基红花黄色素a在制备治疗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用。本发明试实验证明了羟基红花黄色素A对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的成骨分化有影响；同时验证了经不同浓度羟基红花黄色素A干预后的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的Runx2、ALP等成骨相关基因蛋白表达提高，其分子机制涉及Wnt/β‑cantenin信号通路；本发明证明羟基红花黄色素A具有促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的生物学特性；动物实验证明羟基红花黄色素A具有防止骨量过度丢失的作用。

Description

羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病。据报道，全世界有2亿人患骨质疏松症，而有900万因骨质疏松而发生骨折。因为骨质疏松性骨折而引起的疼痛、致残、昂贵医疗费用成本已成为世界各国普遍关注的焦点，骨质疏松也成为骨科疾病中的一大研究热点。

骨质疏松症是一种骨平衡失调性疾病，人体骨平衡的协调主要是由成骨细胞和破骨细胞协调完成，有研究表明破骨细胞主要负责老化骨吸收，而成骨细胞主要负责新骨形成，成骨细胞可以通过几种途径影响破骨细胞的形成、分化或凋亡，例如OPG/RANKL/RANK，LGR4/RANKL/RANK，Ephrin2/ephB4和Fas/FasL途径。相反，破骨细胞也通过液泡(H+)ATP酶(v-ATP酶)V0结构域(Atp6v0d2)，补体成分3a，semaphorin 4D或microRNA的d2同种型影响成骨细胞形成骨。这些途径中的一种或多种障碍，将导致骨稳态失调。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是来源于中胚层具有自我更新的非造血干细胞，也是至今研究最为广泛的间充质干细胞群，在体内外兼具有高度自我更新及多潜能分化能力，可分化为成骨细胞，Rodriguez JP等通过研究表明骨质疏松症患者骨髓间充质细胞分化功能降低。骨髓间充质干细胞分化为成功能性成骨细胞是一个复杂的过程，涉及许多转录因子和信号通路。研究表明，Runxx相关转录因子2(Runx2)是成骨细胞表型的中心调控基因，骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化相关，Wnt/β-cantenin信号通路在调控间充质干细胞成骨分化中的作用已得到深入研究，该通路可以通过β-catenin增强wnt信号通路的靶基因碱性磷酸ALP的转录来促进成骨分化。对于骨质疏松症的致病机理及治疗药物的研究还需更多样化。

红花(Carthamus tinctorius L)又称草红花，为菊科植物干燥的花，具有活血化瘀、祛瘀止痛的功效，是传统的活血化瘀类中药。羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellow A,HSYA)是一种来源于红花中的单查尔酮苷类化合物。Meselhy等1993年首次分离得到羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)。HSYA是红花黄色素的主要成分，中国药典2005年版一部规定以HSYA为红花中的代表性活性成分进行含量测定。鉴于HSYA的药用价值，国内外对其研究都很重视。

发明内容

为此，本发明提供羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供的应用为羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

具体的，羟基红花黄色素A在如下(a)和/或(b)/(c)中的应用：

(a)制备治疗骨质疏松的药物；

(b)制备促进人骨髓间充质干细胞的Runx2、ALP成骨相关基因蛋白表达的药物；

(c)制备促进促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的药物。

本发明还提供治疗骨质疏松的药物，其活性成分为羟基红花黄色素A。

优选地，所述药物的作用为如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)治疗骨质疏松；

(2)促进人骨髓间充质干细胞的Runx2、ALP成骨相关基因蛋白表达；

(3)促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

优选地，所述药物的作用上调β-cantenin蛋白的表达。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

本发明中，羟基红花黄色素A为羟基红花黄色素B的同分异构体。分子式为C₂₇H₃₂O₁₆，分子量为612.53，所述羟基红花黄色素A的纯度为98％。化学结构如下：

本发明中，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的优点：

本发明实验证明了羟基红花黄色素A对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的成骨分化有影响；同时验证了经不同浓度羟基红花黄色素A干预后的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的Runx2、ALP等成骨相关基因蛋白表达提高，其分子机制涉及Wnt/β-cantenin信号通路；本发明证明羟基红花黄色素A具有促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的生物学特性；动物实验证明羟基红花黄色素A具有防止骨量过度丢失的作用。本发明通过研究HSYA对骨质疏松症的治病机理，提出了羟基红花黄色素A可作为治疗骨质疏松症药物中的有效组分，并结合药学上可接受的载体，形成一种用于治疗骨质疏松的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的不同浓度的羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞增殖的影响图，其中，A：MTT测定不同浓度羟基红花黄色素A作用后骨髓间充质干细胞(BMSCs)的细胞毒性，结果表明，1、10、20、40μM的浓度使用羟基红花黄色素A不会显著影响细胞活力；B：不同浓度羟基红花黄色素A干预骨髓间充质干细胞7天、14天后促成骨能力检测，ALP染色证明羟基红花黄色素A可增加hBMSC的ALP活性，10μM组细胞的碱性磷酸酶活性最强；C：茜素红染色实验证明羟基红花黄色素A可增加hBMSC的晚期成骨分化能力，10μM组细胞所产生的钙结节数量最多；

图2为本发明实施例提供的不同浓度的羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化相关基因、蛋白Runx2、ALP表达的影响，其中，A：蛋白质免疫印迹(Westernblot)条带显示不同浓度羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)Runx2蛋白表达的影响；B：实时荧光定量(QPCR)显示不同浓度羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)ALP基因表达的影响；

图3为本发明实施提供的蛋白质免疫印迹条带显示羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)β-cantenin水平的影响图；

图4为本发明实施提供的2.5mg/kg羟基红花黄色素A在体内实验中所具有的的防止骨量过度丢失的作用，其中，A-B：通过对各组大鼠胫骨平台及其附近区域进行Micro-CT分析结果表明去卵巢大鼠对照组骨量相较于假手术组骨量丢失明显，而予2.5mg/kg羟基红花黄色素A药物干预组可明显防止大鼠骨量过度丢失现象；C：通过对骨组织进行定量分析表明，去卵巢大鼠对照组骨密度(BMD)、骨表面积和骨体积的比值百分比(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)均低于其他各组。其BMD、Tb.N显著低于假手术组(p<0.05)，其BV/TV显著低于假手术组、2.5mg/kg羟基红花黄色素A药物干预组(p<0.01；p<0.05)；骨小梁厚度(Tb.Th)各药物组均显著去卵巢大鼠对照组、假手术组(p<0.01)；骨小梁间隙(Tb.Sp)去卵巢大鼠对照组明显高于假手术组、2.5mg/kg羟基红花黄色素A药物干预组(p<0.05)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

细胞培养基：DMEM(Hyclone公司产品)、胎牛血清(Thermo公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Thermo公司产品)、噻唑蓝(索莱宝公司产品)、结晶紫(罗莱宝公司产品)、超净工作台、酶标仪、倒置显微镜、台式离心机、流式细胞仪，凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、羟基红花黄色素A(中检所)、96孔板(Corning公司)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)购于中科院上海细胞所。

实施例1、羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖的影响

(1)羟基红花黄色素A的配置

由四川维克奇生物公司购得羟基红花黄色素B(纯度98％)，称取100mg后用1mL细胞培养级二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成终浓度为100mg/mL的羟基红花黄色素A母液，再用培养基稀释至不同浓度的应用液。

(2)羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖的影响

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种在96孔板中，细胞密度为5000个/孔，加入不同浓度的羟基红花黄色素A应用液进行刺激，终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm作用24h后每孔加入20mL浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)母液，孵育4h后，吸出孔中上清，每孔加入100μL DMSO溶解孔内结晶，用微孔震荡器混匀10min后，置于酶标仪在570nm处测定吸光值。如表1所示，羟基红花黄色素A对细胞活力的影响

表1

如图1所示，结果显示，1-20μm羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖无影响，40μm羟基红花黄色素A开始出现抑制作用。

实施例2、不同浓度羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响

(1)羟基红花黄色素A的配置及稀释同实施例1。

(2)western blot实验验证羟基红花黄色素A促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用

将骨髓间充质干细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm的羟基红花黄色素A作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，2000rpm离心5min去除上清，每个样品加入60μL RIPA裂解液，冰水浴裂解30min后，6000rpm离心10min后，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调蛋白上样量为40μg，加入loading buffer后将样品煮沸10min，至此制备好western blot样品，接着进行western blot。

如图2中A所示，1-20μm的羟基红花黄色素A作用后能够使骨髓间充质干细胞(BMSCs)Runx2蛋白表达明显增加。

(3)实时荧光定量PCR实验验证羟基红花黄色素A促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用

将骨髓间充质干细胞接种在12孔板中，调整细胞密度为50000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm的羟基红花黄色素A作用7天，3天换液一次，后用PBS洗涤细胞一次，加入1ml的Trizol裂解离心，吸取上清水相，加入500μL异丙醇，离心取沉淀，自然干燥后加入20μl DEPC水溶解RNA，确定浓度和纯度。在酶的催化下特异反转录为cDNA。-20℃冻存备用。

应用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(Perfect Real-Time,Ta Ka Ra,Japan)进行实时荧光定量PCR检测。按以下体系加入反应物(25μL)：cDNA0.5μL，上、下游引物各0.5μL，Taq酶：12.5μL，ROX参比荧光0.4μL，去离子水10.6μL。反应条件：预变性95℃30s，变性95℃5s，退火、延伸60℃30s，共40个循环。每个样本设置3个复孔。

如图2中B所示，1-20μm的羟基红花黄色素A作用后能够使骨髓间充质干细胞(BMSCs)ALP等成骨相关基因表达明显增加。羟基红花黄色素A通过激活Wnt/β-cantenin信号通路促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用，蛋白质免疫印迹(Western blot)条带显示羟基红花黄色素A对骨髓间充质干细胞(BMSCs)β-cantenin水平的影响。

(4)碱性磷酸酶及茜素红染色实验验证羟基红花黄色素A促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用

茜素红染色：将骨髓间充质干细胞接种在12孔板中，调整细胞密度为50000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm的羟基红花黄色素A作用14天，3天换液一次，后用PBS洗涤细胞一次，75％酒精固定10分钟，吸去固定液后PBS再清洗2遍，滴加茜素红S染色液，覆盖样本，染色1-5分钟，吸去染色液PBS再清洗2遍，镜下观察：钙结节阳性细胞呈现桔红色。

碱性磷酸酶染色：将骨髓间充质干细胞接种在12孔板中，调整细胞密度为50000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm的羟基红花黄色素A作用7天，3天换液一次，后用PBS洗涤细胞一次，75％酒精固定10分钟，PBS洗涤3-5次，每次3-5分钟。按照比例依次加入试剂盒各工作溶液，混匀后即配制成染色工作液，最后一次洗涤完毕后，加入染色工作液，确保能充分覆盖样品。室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅，去除染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。镜下观察：阳性细胞呈现蓝黑色。

如图4所示，碱性磷酸酶及茜素红染色验证1-20μm的羟基红花黄色素A作用后能够使骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力增强。A-B：通过对各组大鼠胫骨平台及其附近区域进行Micro-CT分析结果表明去卵巢大鼠对照组骨量相较于假手术组骨量丢失明显，而予2.5mg/kg HSYA药物干预组可明显防止大鼠骨量过度丢失现象；C：通过对骨组织进行定量分析表明，去卵巢大鼠对照组骨密度(BMD)、骨表面积和骨体积的比值百分比(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)均低于其他各组。其BMD、Tb.N显著低于假手术组(SHAM)(p<0.05)，其BV/TV显著低于假手术组、2.5mg/kg羟基红花黄色素A药物干预组(p<0.01；p<0.05)；骨小梁厚度(Tb.Th)各药物组均显著去卵巢大鼠对照组、假手术组(p<0.01)；骨小梁间隙(Tb.Sp)去卵巢大鼠对照组明显高于假手术组、2.5mg/kg HSYA药物干预组(p<0.05)。

实施例3、羟基红花黄色素A通过激活Wnt/β-cantenin信号通路促进骨髓间充质细胞成骨相关基因表达

(1)羟基红花黄色素A的配置及稀释同实施例1。

(2)羟基红花黄色素A对β-cantenin表达的影响

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μm，1μm，10μm，20μm，40μm的羟基红花黄色素A作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，800rpm离心5min去除上清，每个样品加入60μL RIPA裂解液，冰水浴裂解30min后，6000rpm离心10min后，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调蛋白上样量为40μg，加入loading buffer后将样品煮沸10min，至此制备好western blot样品，接着进行western blot。

如图3所示，显示1-20μm的羟基红花黄色素A作用后能够使骨髓间充质干细胞(BMSCs)β-cantenin蛋白表达明显增加。

通过上述实施例1-3研究，本发明通过研究首次证明了羟基红花黄色素A能够有效影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化，通过Wnt/β-cantenin信号通路，其分子机制涉及β-cantenin表达。证明了羟基红花黄色素A促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞增殖的生物学特性，因此本发明具有重要的临床意义。

本虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.羟基红花黄色素A在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

2.羟基红花黄色素A在如下(a)和/或(b)/(c)中的应用：

(a)制备治疗骨质疏松的药物；

(b)制备促进人骨髓间充质干细胞的Runx2、ALP成骨相关基因蛋白表达的药物；

(c)制备促进促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的药物。

3.治疗骨质疏松的药物，其活性成分为羟基红花黄色素A。

4.如权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的作用为如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)治疗骨质疏松；

(2)促进人骨髓间充质干细胞的Runx2、ALP成骨相关基因蛋白表达；

(3)促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

5.如权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的作用上调β-cantenin蛋白的表达。

6.如权利要求3所述的药物，其特征在于，

所述药物还包括药学上可接受的载体。

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