CN101391070B - 一种具有抗癌作用的中药组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及具有抗癌作用的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法，属于中药技术领域。该组合物由斑蝥、人参、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、败酱草、蜂胶组成，该组合物进行成分鉴别、含量测定的质量控制方法，具体包括对人参、刺五加、三棱、半枝莲四种成份的鉴别和斑蝥素、马钱苷、人参皂苷、野黄芩苷、齐墩果酸成份的含量测定。本发明药物组合物有很好的破血消瘦，攻毒蚀疮作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及具有抗癌作用的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法，属于中药技术领域。
背景技术
肿瘤是人类三大主要死亡原因之一，严重影响患者的寿命及生活质量。放、化疗是治疗肿瘤细胞，减缓肿瘤生长速度，防止肿瘤扩散和转移，延长生命等方面均起一定作用。但其对人体又有一定的毒副作用，如骨髓抑制、肝肾功能损伤、免疫能力下降等。甚至使原本体质虚弱的患者雪上加霜，以致由于治疗的原因危及病人生命。而中医学的整体观念、辨证论治在综合调理人体机能，提高自身免疫力，防止组织损伤，缓解症状，减轻痛苦，提高生存质量等方面，都取得了令人瞩目的进展，中医中药在治疗恶性肿瘤方面的优势，已为世人所公认。中医认为，脾胃为“后天之本”，“气血生化之源”；肾为“先天之本”，“水火之宅”，内藏阴精与命门之真火，所谓“五脏之阴，非此不能滋，五脏之阳，非此不能发”。人的正常生理机能有赖于五脏六腑的功能协调，其中又以脾胃肾最为重要。而后天脾胃可以颐养先天肾之精气，所以调理脾胃，化生气血，补肾养精，充实先天是治疗“诸虚百损”的基本法则。肿瘤患者经放、化疗后出现的诸多症状，如食欲减退，卷怠乏力，面色少华等，多属于脾肾受损、气血两亏之“虚损”证。故治疗当以健脾补肾、益气养血、扶正培本、解毒消症为原则。
虽然现在已有了一些治疗癌症的中药组合物，但由于质量得不到很好的控制，疗效一直不明显，现发明一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法和质量控制方法，为满足广大患者需求。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新的具有抗癌作用的中药组合物；
本发明的另一个目的在于公开制备一种新的具有抗癌作用中药组合物的方法；
本发明目的还在于公开一种新的中药组合物的质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现：
本发明药物组合物的原料药组成为：
斑蝥2-10重量份 人参15-35重量份 黄芪95-130重量份
刺五加95-130重量份 三棱30-50重量份 半枝莲90-130重量份
莪术30-50重量份 山茱萸25-45重量份 女贞子25-45重量份
败酱草15-35重量份 蜂胶15-35重量份。
本发明药物组合物的原料药组成还可以为：
斑蝥2-10重量份 人参15-35重量份 黄芪95-130重量份
刺五加95-130重量份 三棱30-50重量份 半枝莲90-130重量份
莪术30-50重量份 山茱萸25-45重量份 女贞子25-45重量份
熊胆粉0.5-1.0重量份 甘草15-35重量份
本发明药物组合物的原料药组成优选为：
斑蝥2-6重量份 人参21-35重量份 黄芪111-130重量份
刺五加110-130重量份 三棱36-50重量份 半枝莲90-109重量份
莪术36-50重量份 山茱萸25-34重量份 女贞子25-34重量份
熊胆粉0.2-0.5重量份 甘草21-35重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为：
斑蝥 5重量份 人参 35重量份 黄芪 120重量份
刺五加120重量份 三棱 45重量份 半枝莲100重量份
莪术 45重量份 山茱萸30重量份 女贞子30重量份
熊胆粉0.4重量份 甘草35重量份。
本发明药物组合物的原料药组成还可以为：
斑蝥7-10重量份 人参15-20重量份 黄芪95-110重量份
刺五加95-110重量份 三棱30-35重量份 半枝莲110-130重量份
莪术30-35重量份 山茱萸35-45重量份 女贞子35-45重量份
熊胆粉0.6-1.0重量份 甘草15-20重量份
本发明药物组合物的原料药组成优选为：
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子39.7重量份
熊胆粉0.8重量份 甘草 19.8重量份
该药物组合物还可以加入赋性剂制成片剂、口服液体制剂、胶囊剂、颗粒剂。
该药物组合物的制备方法：以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛，得细粉；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32体积份，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.1-1.3(80℃)的浓缩液；熊胆粉加75-85℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，加入常规辅料，经常规方法制成临床接受的口服制剂。如片剂、口服液体制剂、胶囊剂、颗粒剂。本发明药物可加入常规的药物赋性剂例如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
本发明胶囊制剂的制备方法：以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32体积份，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉，装人胶囊，即得。
所述体积份/重量份与ml/g相对应。
本组合物制成药剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定和/或检查。
鉴别方法包括下列方法中的一种和/或几种：
(1)取本发明药物组合物制剂相当于原药材3-4重量份，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取3-5小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5 体积份使溶解，转至分液漏斗中，再用5体积份水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10、5、5、5体积份)，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次5体积份，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8体积份水分三次溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用30体积份氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25体积份洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(13-18∶37-42∶20-25∶8-12)于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
(2)取本发明药物制剂相当于原药材15-16重量份，加75％乙醇100体积份超声提取20-60min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15体积份溶解，转至分液漏斗中，用石油醚(30-60℃)提取2次，每次15体积份，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10体积份，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2体积份溶解，作为供试品溶液；取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液；另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液；在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，吸取上述四种溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(15-20∶0.5-1.5)为展开剂展开，取出，晾干，至紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
(3)取本发明药物相当于原药材10-11重量份，研细，加醋酸乙酯30体积份，加热回流10-30min，放冷，滤过，滤液浓缩至约1体积份，作为供试品溶液；取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺三棱的药材同法制成阴性对照液。吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(5-10∶2-4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约5min，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
(4)取本发明药物制剂相当于原药材2-3重量份，加甲醇20体积份回流提取0.5-2h，滤过，将滤液挥至约10体积份，作为供试品溶液；另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4-6∶2-4∶0.5-2∶0.5-2)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点；阴性对照无干扰。
本发明药物组合物质量控制方法优选如下鉴别方法中的一种或几种：
(1)取本发明药物组合物制剂相当于原药材3.6g，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5体积份使溶解，转至分液漏斗中，再用5体积份水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10、5、5、5体积份)，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5体积份，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8体积份水分三次溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～ 200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用30体积份氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25体积份洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
(2)取本发明药物制剂相当于原药材15.4g，加75％乙醇100体积份超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15体积份溶解，转至分液漏斗中，用石油醚(30-60℃)提取2次，每次15体积份，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10体积份，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2体积份溶解，作为供试品溶液。取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液；另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液；在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液；照薄层色谱法，吸取上述四种溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(19∶1)为展开剂展开，取出，晾干，至紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
(3)取本发明药物制剂相当于原药材10.25g，研细，加醋酸乙酯30体积份，加热回流20min，放冷，滤过，滤液浓缩至约1体积份，作为供试品溶液；取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺三棱的药材同法制成阴性对照液；吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约5min，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
(4)取本发明药物制剂相当于原药材2.05g，加甲醇20体积份回流提取1h，滤过，将滤液挥至约10体积份，作为供试品溶液；另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点；阴性对照无干扰。
含量测定方法包括下列方法中的一种和/或几种：
(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定
色谱条件与系统适用性试验 以苯基(50％)甲基硅酮(OV-17)为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物相当于原药材10-11重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿50-70体积份，加热回流0.5-1.5小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15-20体积份分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2体积份，定量转移至5体积份量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得；
本品含斑蝥以斑蝥素(C10H12O4)计不得少于0.03‰；
(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(10-20∶80-90)为流动相；检测波长为240nm；理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂相当于原药材0.5-1.0重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20-30体积份，密塞，称定重量，加热回流0.5-1.5小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含山茱萸以马钱苷(C17H26O10)计不得少于0.03％；
(3)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行剃度洗脱；检测波长为205nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000；
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-35 35-55 55-70 70-100 | 15-25 15-25→25-35 25-35 25-35→35-45 | 75-85 75-85→65-75 65-75 65-75→55-65 |
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂相当于原药材1-2重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷25-35体积份，加热回流2-4小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50体积份，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)20-40分钟，精密量取续滤液25体积份至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10体积份量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.03％；
(4)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-4％醋酸溶液(30-35∶65-70)为流动相；检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂相当于原药材2-3重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)50体积份，加热回流1-3小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100体积份，密塞，称定重量，加热回流1-2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含半枝莲以野黄芩苷(C21H18O12)计不得少于0.10％；
(5)取本发明药物制剂相当于原药材5-6重量份，精密称定，加乙醇加热回流2-4次，每次40-60体积份，每次25-35分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10体积份量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙脂(4-6∶1-3∶0.5-1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B薄层色谱扫描法)进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得；
本品含女贞子以齐墩果酸(C30H48O3)计不得少于0.10％。
含量测定方法优选下列方法中的一种和/或几种：
(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定；
色谱条件与系统适用性试验 以苯基(50％)甲基硅酮(OV-17)为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物相当于原药材10.25重量份，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60体积份，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15体积份分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2体积份，定量转移至5体积份量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得；
本品含斑蝥以斑蝥素(C10H12O4)计不得少于0.03‰；
(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15∶85)为流动相；检测波长为240nm；理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂的相当于原药材0.512重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25体积份，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含山茱萸以马钱苷(C17H26010)计不得少于0.03％。
(3)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行剃度洗脱；检测波长为205nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000；
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-35 | 20 | 80 |
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂的相当于原药材1.025重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30体积份，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50体积份，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，精密量取续滤液25体积份至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10体积份量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.03％；
(4)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-4％醋酸溶液(32∶68)为流动相；检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本发明药物制剂的相当于原药材2.05重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)50体积份，加热回流2小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100体积份，密塞，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含半枝莲以野黄芩苷(C21H18O12)计不得少于0.10％；
(5)取本发明药物制剂的相当于原药材5.125重量份，精密称定，加乙醇加热回流3次，每次50体积份，每次30分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙脂(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B薄层色谱扫描法)进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得；
本品含女贞子以齐墩果酸(C30H48O3)计不得少于0.10％。
本发明组合物在治疗破血消瘦，攻毒蚀疮上有很好的作用，该组合物毒性甚小，临床应用安全可靠。
本发明组合物制剂具有较强的破血消瘦，攻毒蚀疮作用，且可通过对小鼠肉瘤(S180)、艾氏腹水癌(ECA)、NK细胞有抑制与杀灭作用，并可抑制消除肿瘤细胞RNA和DNA的合成，对急性或慢性辐射损伤具有保护作用。
本发明组合物制剂生产工艺先进，质量控制方法可对产品的质量进行有效而稳定的控制。
附图说明
图1为马钱苷及山茱萸高效液相色谱图；
图2为对照品溶液色谱图；
图3为供试品溶液色谱图；
图4为本发明药物组阴性对照；
图5为野黄芩苷对照品；
图6为本发明药物组供试品；
图7为样品待测斑点、对照品斑点光谱扫描图；
图8为齐墩果酸对照品标准曲线图；
图9为样品供试液通道扫描图；
图10为齐墩果酸对照品通道扫描图；
图11为阴性样品通道扫描图。
下面实验例用于进一步说明本发明。
药物组I：
斑蝥 10重量份 人参 15重量份 黄芪 110重量份
刺五加 110重量份 三棱 35重量份 半枝莲 110重量份
莪术 35重量份 山茱萸 35重量份 女贞子 35重量份
熊胆粉 0.6重量份 甘草 15重量份。
药物组II：
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加 99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲 119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸 39.7重量份 女贞子 39.7重量份
熊胆粉 0.8重量份 甘草 19.8重量份。
阳性对照组：扶正消症胶囊：
实验例1祛邪的研究
(1)治疗性给药对移植性实体瘤的影响
采用昆明种小鼠100只，随机分为S180组和Lewis组，各组再随机分为药物组I、药物组II、扶正消症胶囊组。在S180组中每只小鼠右后腿腹侧皮下注射S180悬液0.2ml；Lewis组中每只小鼠右后腿腹侧皮下注射Lewis肺癌悬液0.2ml；6天后每只小鼠注射部位均长出瘤块。分别给药：药物组I、药物组II、扶正消症胶囊组按10g/kg量溶于生理盐水灌胃，每日1次。10天后处死存活小鼠，完整剥离瘤块并称重，结果见表1。
表1治疗性给药对移植性实体瘤的影响
| 组别 | S180(n) | Lewis(n) |
| 药物组I | 1.361±0.067(8)** | 1.529±0.352(9)** |
| 药物组II | 1.628±0.096(9)* | 1.750±0.786(8)* |
| 扶正消症胶囊组 | 2.057±0.301(9) | 2.322±0.116(8) |
药物组I与扶正消症胶囊组比较**P＜0.01，药物组I与药物II组比较*P＜0.05。
从上表可见，S180瘤重各组间有极显著差异(P＜0.01)；扶正消症胶囊组瘤重大于药物组I、II，差异均有极显著意义(P＜0.01)。Lewis瘤重扶正消症胶囊组与药物组I有极显著差异(P＜0.01)。上述结果表明药物组对抑制已发的两种实体瘤生长的作用明显优于扶正消症胶 囊。
(2)预防性给药对实体瘤生长的影响
将昆明种小鼠随机分为对照组和治疗组，阴性对照组以生理盐水0.5ml每日灌胃1次，药物I、II按400mg/kg量溶于0.5ml生理盐水，扶正消症胶囊组以药物I相同的剂量和方法给药，每日灌胃1次，3天后在扶正消症胶囊组、药物组及阴性对照组的相同部位同时注射Lewis肺癌悬液0.2ml，继续灌注10天后处死存活小鼠，完整剥离肿块并称重，结果见表2
表2各组动物肿瘤重量及抑制率
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数 | 肿瘤重量 | 肿瘤抑制率 | P值 |
| 药物组I | 400 | 24 | 0.59±0.22 | 60.2 | ＜0.01 |
| 药物组II | 400 | 24 | 0.52±0.32 | 58.0 | ＜0.01 |
| 扶正消症胶囊组 | 400 | 24 | 1.53±0.83 | 45.6 | |
| 阴性对照组 | 0 | 24 | 2.81±0.77 |
从上表可见，瘤重及肿瘤抑制率各组间有极显著差异(P＜0.01)；阴性对照组和扶正消症胶囊组瘤重大于药物组I、II，差异均有极显著意义(P＜0.01)。上述结果表明本发明药物对减少瘤重及抑制肿瘤生长率明显优于扶正消症胶囊。
实验例2、扶正的研究
NK细胞活性：每组取8只动物，用酶释放试验检测NK细胞活性以YAC-1(小鼠淋巴瘤细胞)为靶细胞，小鼠脾淋巴细胞为效应细胞，按50∶1的效靶比例浓度等量混合，37℃作用2小时，再离心取其上清液与等量的乳酸脱氢酶反应液混和，在酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂生产，DG3022A型)测OD值，计算出NK细胞杀伤率。见表3：
表3各组动物自然杀伤(NK)细胞活性
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | NK细胞自然杀伤率(％) | P值 |
| 药物组I | 400 | 8 | 70.6±7.96 | ＜0.01 |
| 药物组II | 400 | 8 | 68.6±8.42 | ＜0.01 |
| 扶正消症胶囊组 | 400 | 8 | 52.8±16.3 | ＜0.05 |
| 阴性对照组 | 0 | 8 | 38.3±4.08 |
药物组I、II及扶正消症胶囊组均能明显提高NK细胞杀伤率，药物组I、II对NK细胞自然杀伤力明显优于扶正消症胶囊。
实验例3、增效作用的研究
与化疗药物联合应用抗肿瘤作用的研究：用S180悬液接种昆明种小鼠，次日随机分组，每组10只。灌胃给药(本发明药物I及扶正消症胶囊组)，连续给药9天。同时腹腔注射丝裂霉素(MMc)9天或环磷酰胺(CTX)3天，于停药次日处死动物，剖取瘤块，计算瘤重及抑瘤率；阴性对照组给生理盐水0.5ml灌胃，连续9天，其结果见表4。
表4与化疗药物联用对S180小鼠治疗效果
| 组别及剂量/kg.d×d | 体重变化(g) | 瘤重(g) | 抑瘤率 | P值 |
| 阴性对照组0.5ml×9 | +2.56 | 2.78±0.28 | ||
| 本发明药物组I 200mg×9 | +1.90 | 1.16±0.27 | 39.20 | ＜0.01 |
| 阳性对照组200mg×9 | +2.17 | 1.44±0.19 | 35.56 | ＜0.01 |
| CTX75mg×3 | -0.924 | 0.95±0.13 | 47.71 | ＜0.01 |
| 本发明药物组I 200mg×9 +CTX75mg×3 | +0.81 | 0.10±0.02 | 66.98 | ＜0.01 |
| 阳性对照组200mg×9 +CTX75mg×3 | +0.56 | 0.63±0.15 | 51.52 | ＜0.01 |
| MMc1.0mg×9 | -0.78 | 1.35±0.25 | 31.01 | ＜0.01 |
| 本发明药物组I 200mg×9 +MMc1.0mg×9 | +1.09 | 0.69±0.16 | 52.68 | ＜0.01 |
| 阳性对照组200mg×9 +MMc1.0mg×9 | +0.97 | 1.19±0.29 | 45.58 | ＜0.01 |
从上表可以看出，本发明药物组与CTX联用，对S180的抑瘤率为66.98％，较单用CTX提高19.27％，与阳性对照药和CTX联用相比提高15.46％，本发明药物组与阳性对照组相比，对瘤重的抑制具有显著性差异；本发明药物组与MMC联用，对S180的抑瘤率为52.68％，较单用MMC提高21.67％，较阳性对照组与MMC联用提高7.1％，本发明药物组与阳性对照组相比，对瘤重的抑制具有显著性差异。此外，本发明药物组不仅能明显降低CTX及MMC导致小鼠体重下降的毒性，且联合用药组小鼠的皮毛色泽、活泼程度及每日进食水量，均较阳性对照组为好。
实验例4、毒性试验
选用昆明种小鼠随机分组，每组10只，每只每天灌胃本发明药物组I 12g/kg(按体表面积折算成相当于成人用量的30倍)，连续灌胃4周，无1只动物死亡，亦未见任何毒性反应。外周血象及肝肾功能检查，以及剖取心肝脾肺肾光学显徽镜病理形态学检查，均未见异常。
通过以上实验发现，本发明药物能对小鼠肉瘤(S180)、艾氏腹水癌(ECA)、NK细胞有抑制与杀灭作用，并可抑制消除肿瘤细胞RNA和DNA的合成，对急性或慢性辐射损伤具有保护作用。
实验例5鉴别筛选试验
以下试验筛选实验均选择实施例3的药物。
(1)人参、黄芪
方法1.取本药物组合物相当于3.6g生药量，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚500μm)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
方法2.取本药物组合物相当于3.6g生药量，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5ml使溶解，转至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用1％氢氧化钠液洗涤3次，每次15ml，弃去氢氧化钠液，再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水液，正丁醇 液置水浴上蒸于，残渣加水5ml使溶解，加至D-101大孔吸附树脂柱(内径1cm，柱高12cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，用30％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml，作为供试品溶液。另取黄芪甲甙对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚500μm)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
方法3.取本药物组合物相当于3.6g生药量，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5ml使溶解，转至分液漏斗中，再用5ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10、5、5、5ml)，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8ml水分三次溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用30ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
结论：方法1-3，均可以可靠的鉴别出相应药材，但方法3将人参与黄芪一起鉴别，方法简单，效果明显，故采用方法3作为本药物组合物的质量控制方法之一。
(2)刺五加
方法1.取本药物组合物相当于15g生药量，研细，加75％乙醇100ml超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml溶解，转至分液漏斗中，用石油醚(30-60℃)提取2次，每次15ml，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液。另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，吸取上述四种溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(19∶1)为展开剂展开，取出，晾干，至紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
方法2.取本药物组合物相当于15g生药量，研细，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取刺五加对照药材5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。再取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各5μl、对照品溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主 斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
方法3.取本药物组合物相当于15g生药量，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次5ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取刺五加对照药材5g，同法制成对照药材溶液。再取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点。
| 方法1 | 方法2 | 方法3 |
| 供试品色谱 中，在于对照药 材、对照品色谱 相应位置上，显 相同颜色的荧光 斑点。 | 供试品色谱中，在与对照药材色 谱相应的位置上，显相同颜色的 荧光主斑点，但药材斑点分离效 果不好且颜色较浅；在与对照品 色谱相应的位置上，显相同颜色 的荧光斑点。 | 供试品色谱中，在与 对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的斑点； 在与对照品色谱相应的位 置上，显相同的蓝色斑点， 但对照品斑点颜色较浅。 |
从上表可知，方法1较方法2、3分离效果好，斑点显色清晰，故优选方法1为本药物组合物的质量控制方法之一。
(3)三棱
方法1.取本药物组合物相当于10g生药量，研细，加醋酸乙酯30ml，加热回流20min，放冷，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺三棱的药材同法制成阴性对照液。吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约5min，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。
方法2取本药物组合物相当于10g生药量，加乙醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三棱对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层上，以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
| 方法1 | 方法2 |
| 供试品色谱中，在于对照药材、对照品色 谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。 | 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置 上，显相同颜色的荧光主斑点，但药材斑点分 离效果不好且颜色较浅。 |
从上表可知，方法1较方法2分离效果好，斑点显色清晰，故优选方法1为本药物组合物的质量控制方法之一。
(4)半枝莲
方法1.取本药物组合物相当于3g生药量，加甲醇20mL回流提取1h，滤过，将滤液挥至约10mL，作为供试品溶液。另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品 溶液、阴性对照溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点。而阴性样品无此斑点。
方法2.取本药物组合物相当于3g生药量，研细，加乙醚20ml，回流30分钟，滤过，弃乙醚液，药渣挥发去乙醚，加甲醇30ml，加热回流30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水5ml使其溶解，将其置已处理好的D-101净品型大孔吸附树脂柱上，用40ml水先脱，弃去洗脱液，再用20％甲醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取标准半枝莲对照药材1g，按上述方法制成对照药材溶液；再取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg野黄芩苷的溶液，作为对照品溶液；按照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5～10ul，分别点于同一含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水，其重量份比例为5∶3∶1∶1，为展开剂，预平衡20分钟，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，当供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，并且在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗绿色斑点。
结果：方法2中鉴别过程繁琐，费时，故优选方法1为本药物组合物的质量控制方法之一。
实验例6斑蝥素含量测定筛选试验
1色谱条件与系统适应性试验色谱柱3.5％SE-30不锈钢柱(内径0.4mm，长1.5m)；载气N2(99.9％)，流量40ml/min，柱温170℃，进样口(气化室)温度200℃，检测器温度200℃；理论塔板数按斑蝥素计算应不低于3000。
2对照品溶液的制备精密称取斑蝥素对照品适量，加氯仿制成每1ml含0.54mg的溶液，作为对照品溶液。
对照品溶液的稀释液：将上述对照品溶液稀释成每1ml含0.11mg的溶液。
3供试品溶液的制备取本发明药物组相当于原药材10.25g，精密称定，置500ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿，置水浴中回流2h，放冷，滤过，残渣加50ml氯仿继续热回流2h，放冷，滤过，合并滤液，置水浴上挥干，残渣用氯仿溶解，定量转移至2ml量瓶中，定容，作为供试品溶液。
4阴性对照品溶液的制备按处方比例称取除斑蝥外的其他药材，依法制备阴性对照溶液。
5干扰试验照上述色谱条件、吸取供试品溶液，对照品溶液，阴性对照溶液各2μl，分别依次注入气相色谱仪。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照色谱在此保留时间无干扰。表明处方中其它组份对测定无干扰。
6线性关系考察精密吸取0.2、0.6、1.0、2.0、4.0μl对照品溶液稀释液，1.0、1.2、1.4μl对照品溶液，依次注入气相色谱仪，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，斑蝥素量(X)为横坐标，得到一曲线，其回归方程为Y＝85075.65X+4332.19。r＝0.9995，表明斑蝥素在0.02μg～0.76μg范围内线性关系良好。
7精密度试验精密吸取对照品溶液1.0μl，重复进样6次，测定峰面积，计算得RSD＝3.21％。
8稳定性试验精密吸取对照品溶液1.4μl，供试品溶液2.0μl，按上述含量测定方法，每隔24h测定一次峰面积，共6次，结果对照品的RSD＝1.88％(n＝6)，供试品中斑蝥素的RSD＝2.38％(n＝6)。
9回收率试验精密称取同一已知含量的供试品5份，分别加入斑蝥素对照品溶液适量，按3 项下操作，依法制备，进样，测定峰面积，计算回收率。结果见表5。
表5回收率试验结果
10重现性试验取同一样品共5份，按上述方法制备供试品溶液，进行含量测定。结果：RSD＝0.41％
11样品测定分别精密吸取对照品溶液0.2μl及1.0μl，供试品溶液2.0μl，依次注入气相色谱仪、计算峰面积，外标法计算斑蝥素的含量，见表6。
表6本发明药物组中斑蝥素的含量测定
| 批号 | n | 斑蝥素的含量(μg/粒) | 含量百分比(‰) | RSD(％) |
| 1 | 3 | 15.47 | 0.066 | 1.92 |
| 2 | 5 | 16.02 | 0.069 | 0.41 |
| 3 | 2 | 12.80 | 0.055 | 3.31 |
实验例7 马钱苷含量测定筛选试验
1 色谱分析条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15∶85)为流动相；检测波长为240nm。理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000。
2 供试品溶液对照品溶液的制备取本发明药物组相当于原药材0.512g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3 对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。按以上色谱条件得到对照品、山茱萸药材色谱分离图见图1。
5 实验条件的选择提取溶媒的选择95％乙醇、甲醇、80％、60％、40％、20％甲醇各25ml，作为提取溶媒进行比较，提取方法及含量测定方法同正文，结果见表7。
表7 不同溶媒提取结果
| 提取溶媒 | 提取效率(以马钱苷含量计，％) |
| 95％乙醇 | 0.6238 |
| 甲醇 | 0.8815 |
| 80％甲醇 | 0.9486 |
| 60％甲醇 | 0.9378 |
| 40％甲醇 | 0.9290 |
| 20％甲醇 | 0.9284 |
注：80％甲醇提取效率较高，故选用80％甲醇作为提取溶媒。
提取方法的选择 以80％甲醇为溶剂，提取方法分别采用超声提取30min，超声提取1h，加热回流提取1h，测定方法同正文，结果见表8。
表8 不同提取方法提取结果
| 提取方法 | 提取效率(以马钱苷含量计，％) |
| 超声提取30min | 0.9252 |
| 超声提取1h | 0.9548 |
| 加热回流提取1h | 0.9581 |
注：不同提取方法对提取效率无显著影响，超声提取噪声较高，故选用加热回流提取。
6 样品溶液稳定性试验取待测样品溶液，定时0、1、2、3、4、24h进样测定，峰面积积分值依次为602.01868、615.35468、593.90991、610.93689、620.69263、617.60474，平均值为610.08625，RSD为1.68％。测定结果表明，样品溶液在24h内基本稳定。
7 精密度试验精密吸取马钱苷对照品溶液(40.3μg·ml-1)10μl，重复进样5次，测量峰面积，峰面积积分值依次为：592.39557、599.80743、607.00330、593.15698、603.26697，平均值为599.12605，RSD为1.06％。
8 线性关系的考察精密吸取对照品溶液(80.6μg·ml-1)0.5、1、2.5、5、10、15μl，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，依次为65.36401、126.22728、293.15439、589.26709、1151.49036、1720.63135，以峰面积积分值为纵坐标，马钱苷进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
Y＝1415.15046X+11.342692，r＝0.9999
结果表明马钱苷进样量在0.0403～1.209μg范围内呈良好的线性关系。
9 样品测定方法的重复性试验取本发明药物组，粉碎成粉末，提取方法等同，按前述高效液相色谱法重复测定样品6次，马钱苷的含量分别为：0.9478％、0.9746％、0.9669％、0.9968％、0.9632％、1.0234％；平均含量为0.9788％；RSD为2.64％(n＝6)，结果表明此法重复性良好。
10 加样回收率试验精密称取已知马钱苷含量为0.9788％的山茱萸药材粉末0.05g，精密加入马钱苷对照品溶液(0.556mg·ml-1)1ml，按样品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率，测定结果见表9。
表9 山茱萸中马钱苷加样回收率试验结果
11 流动相的选择 曾选用甲醇-水，乙腈-水等系统，结果本法最终选定的流动相系统可在短时间内使马钱苷达到基线分离。
12 检测波长的选择马钱苷紫外最大吸收UVλmax(Etoh)＝235nm，曾选用235、240nm为检测波长，在本法选用的流动相系统中，240nm下检测马钱苷峰响应值较高，因此选用240nm为检测波长。
实验例8人参皂苷含量测定筛选试验
1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行剃 度洗脱；检测波长为205nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000。
色谱图见图2、图3。
2供试品溶液的制备取本发明药物组相当于原药材约1.025g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30ml，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，精密量取续滤液25ml至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得。
4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5线性关系考察精密吸取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品溶液1、2、3、4、5mL，分别置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。分别精密吸取上述混合溶液10μL，注入高效液相色谱仪，以质量(m)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程：人参皂苷Rg1：A＝365654m+1568.2，r＝0.9997；人参皂苷Re为：A＝309187m+1919，r＝0.9997。上述结果表明，人参皂苷Rg1在0.4052～2.0260μg范围内、 人参皂苷Re在0.4232～2.1160μg范围内线性关系良好。
5精密度试验分别精密吸取同一供试品溶液，连续重复进样5次，根据峰面积计算含量，其RSD值分别是人参皂苷Rg1为2.98％、人参皂苷Re为2.17％。
6稳定性试验分别精密吸取同一供试品溶液，在相同色谱条件下，每隔3h测定1次，计算平均峰面积，结果表明供试品溶液在48h内稳定性良好，其峰面积的RSD值分别是人参皂苷Rg1为2.15％、人参皂苷Re为1.97％。
7重复性试验取同一样品5份，按“2”项操作，分别制备供试品溶液，测定，计算两种皂苷的含量，RSD值分别是人参皂苷Rg1为3.16％、人参皂苷Re为1.98％，结果表明本方法重复性良好。
8 回收率试验采用加样回收法，分别取已知人参皂苷含量的样品溶液5.0mL6份，分别加入人参皂苷Rg1、Re混合对照品溶液适量，按“2”项供试品溶液的制备方法制备，测定，计算回收率，结果见表10、11。
表10 人参皂苷Rg1回收率的测定
| m样品中的量/mg | m加入量/mg | m实测量/mg | 回收率/％ |
| 0.6710 | 0.6015 | 1.2857 | 101.04 |
| 0.6710 | 0.6015 | 1.3275 | 103.23 |
| 0.6710 | 0.7519 | 1.4427 | 101.39 |
| 0.6710 | 0.7519 | 1.4427 | 101.39 |
| 0.6710 | 0.9023 | 1.5428 | 96.79 |
| 0.6710 | 0.9023 | 1.5430 | 96.80 |
平均回收率＝100.11％，RSD＝2.21％
表11人参皂苷Re回收率的测定
| m样品中的量/mg | m加入量/mg | m实测量/mg | 回收率/％ |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.2872 | 101.17 |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.3151 | 104.19 |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.2917 | 101.15 |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.2917 | 102.16 |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.2637 | 99.19 |
| 0.7450 | 0.5290 | 1.2754 | 100.11 |
平均回收率＝101.33％，RSD＝1.73％
实验例9野黄芩苷含量测定筛选试验
1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-4％醋酸溶液(32∶68)为流动相；检测波长为335nm。理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500。
2供试品溶液的制备取本发明药物组相当于原药材约2.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)50ml，加热回流2小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3阴性溶液的制备：取缺半枝莲外的其他处方量药材，按制备工艺方法制备缺半枝莲的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺半枝莲的阴性溶液，即得。
4对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg 的溶液，即得。
5阴性干扰试验分别精密吸取对照品溶液，阴性溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。结果表明：阴性对照溶液在野黄芩苷出峰处无色谱峰出现，对照品、供试品及阴性溶液色谱图。(见图4～图6)
6线性关系考察精密称取野黄芩苷对照品适量，用70％甲醇制成162.7μg·ml-1的溶液，再分别制成含野黄芩苷13.014μg·ml-1，19.524μg·ml-1，26.032μg·ml-1，32.545μg·ml-1，39.048μg·ml-1的溶液，注入20μl，测定峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：A＝0.933X+1.92，r＝0.9997，野黄芩苷进样量在0.2603μg～0.7810μg之间，进样量与峰面积线性关系良好。
7精密度试验精密吸同一份供试品溶液20μl，重复进样5次，测定其峰面积积分值，其结果RSD＝0.13％(n＝5)，本法精密度好。
8稳定性试验分别精密吸取同一份供试品溶液20μl，于0、1、6、20、24h进样，测定其峰面积积分值，其结果RSD＝0.45％(n＝5)，供试品溶液在24h内峰面积值基本稳定。
9重复性试验取同一样品5份，按上述条件进行测定，结果RSD＝0.44％(n＝5)，本方法重复性好。
10 回收率试验精密量取已知含量的供试品溶液5m15份，置50ml容量瓶中，分别加甲醇至刻度，滤过，再分别精密量取滤液5ml，分别精密加入含野黄芩苷32.545μg·ml-1的甲醇溶液3.5，4，5ml，加甲醇至10ml，摇匀，按上述含量测定项下方法测定含量，结果平均回收率(见表12)。本法加样回收率较好(样品进样量为0.5182μg～0.6208μg，均在线性范围内)。
表12野黄芩苷回收率测定结果表 (n＝3)
11 样品的含量测定精密量取3批样品各5ml，按含量测定方法测定含量，结果(见表13)，RSD＝3.2％。
表13 样品的含量测定结果表(n＝3)
| 批号 | 野黄芩苷含量(％) |
| 1 | 0.1001 |
| 2 | 0.1000 |
| 3 | 0.1002 |
12野黄芩苷对照品用甲醇作溶剂，峰型不佳，分离度不好，70％甲醇和甲醇作溶剂效果好，理论板数在2000以上，但70％甲醇作溶剂稳定性不好，故选用甲醇作溶剂。阴性溶液均无干扰。
实验例10齐墩果酸含量测定筛选试验
1层析相关条件的选择
1.1 薄层板的确定选择硅胶G板，并比较了手铺板、市售青岛海洋板与德国Merk板，结果以Merk板效果最好但价格昂贵，而手铺板不能达到分离度的要求，因此选用市售硅胶G薄层板。
1.2展开条件的确定 比较了四种不同的展开系统，以待测斑点与相邻斑点的分离度作评价指标，选定环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂，并以预吸附15min后再展开为佳。
1.3温度与相对湿度的确定 比较了10℃以下与20℃的展开环境温度，结果表明展开应在10℃以下；还比较了不同的展开相对湿度(RH)32％、58％、65％、88％，以相对湿度58％左右为佳。
1.4显色剂及显色方式的确定经实验表明，25％磷钼酸乙醇溶液显色背景较深，而5％与10％的硫酸乙醇液显色效果相差不大，因此参考中国药典女贞子药材中测定齐墩果酸的方法，选取10％硫酸乙醇液为显色剂；而采用喷雾显色可能造成显色不均匀，因此采取浸板的方式；显色温度在90℃、100℃、105℃时差别不大，但显色时间有所不同，故选取100℃烘至斑 点显色清晰。
2测定波长的选择取齐墩果酸对照品溶液(0.5mg/ml)1μl以及样品液各0.5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干；浸于10％硫酸乙醇溶液中，取出，晾干，在100℃加热至斑点清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法于波长530nm处进行扫描；选定样品色谱中与对照品相对应的斑点，分别进行光谱扫描，结果二者在530nm处均有最大吸收，在700nm处吸收最小。因此确定扫描波长为：λS＝530nm，λ R＝700nm。
3样品干扰性试验
3.1对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品适量，加无水乙醇制成0.5mg/ml溶液，作为对照品溶液。
3.2样品供试品溶液的制备取本发明药物组相当于原药材约3.075g，精密称定，加乙醇50ml，加热回流20min，放冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流一次，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
3.3缺女贞子阴性供试品溶液的制备 按照处方量及工艺条件同法制成缺女贞子阴性样品，取其样品相当于原药材3.075g，精密称定，同供试品溶液制备项下制备，为缺女贞子阴性供试品溶液。在选定的条件下，同时取对照品溶液、样品供试品溶液、阴性供试品溶液进行薄层层析。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性则无干扰。
4线性范围的考察精密吸取齐墩果酸对照品溶液(0.5mg/ml)0.5μl、1μl、2μl、5μl、6μl点于同一薄层板上，层析，显色，扫描。记录色谱图，测定其吸光度积分值，并以吸光度积分值(A)对点样量(μg)进行回归，得标准曲线方程为：y＝2175.7x+2077.3，r＝0.9970。以吸光度积分值(A)对点样量(μg)作图，得一直线，结果表明点样量在0.25、0.5、1.0、2.5和3.0μg范围内，齐墩果酸点样量的吸光度积分值分别为2313.5、3359.9、4431.7、7520.3和8534.9，显示线性关系良好。见图8。
5供试品溶液制备方法的研究女贞子为收载于《中国药典》2005年版一部31页的品种，参照药典进行实验，并根据此复方具体情况作调整。试验结果表明，供试品溶液色谱图中，齐墩果酸与相邻峰分离度大于1，峰形基本对称，与齐墩果酸对照品斑点Rf值一致，且阴性无干扰。见图9～11。
5.1 回流提取法取本品约相当于原药材3.075g，精密称定，加乙醇50ml，加热回流30min，放冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流1次，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
5.2超声提取法取样品约相当于原药材3.075g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50ml，超声处理2次，每次30min，其它同回流提取法操作。以选定的条件进行TLC法分析，试验结果表明，选用回流法制备的样品色谱中，齐墩果酸斑点明显深于(大于)超声法，因此选用回流提取法。
5.3提取次数的确定取本品约相当于原药材3.075g，共3份，精密称定，加乙醇50ml，加热回流30min，分别提取1、2、3次，放冷，滤过，依次合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，分别转移至10ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取 续滤液作为供试品溶液。结果表明，提取2次和3次，齐墩果酸斑点大小和颜色相差不大，而均强于提取1次的，故确定本品提取2次。
5.4提取时间的确定取样品3份，每份约相当于原药材3.075g，精密称定，加乙醇50ml，加热回流，依次分别提取10、20、30min，放冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流一次，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。试验结果表明，提取10、20、30min，齐墩果酸斑点大小和颜色相差不大，从成分被提取完全和节约能源综合考虑，确定提取时间为20min。
6精密度试验
6.1 重复性实验精密吸取同一供试品溶液0.5μl，平行点6份于同一薄层板上，层析，显色，扫描，结果齐墩果酸吸光度积分值分别为2548.9、2768.0、2658.6、2658.8、2609.8和2689.3，相对标准差(RSD)＜5％，表明方法重复性良好。
6.2异板精密度实验精密吸取同一供试品溶液0.5μl，平行点6份于同一薄层板上，层析，显色，扫描；用另一薄层板重复操作，结果测得齐墩果酸吸光度积分值(n＝12)的相对标准差(RSD)＜5％，表明方法精密度良好。见表14。
表14 异板精密度试验结果
7稳定性试验精密吸取同一供试品溶液0.5μl，平行点6份于同一薄层板上，薄层层析，显色后，同样大小的玻璃板覆盖，周围用胶布固定，遮光保存，并分别于0、0.5、1、2、3、4h扫描，测得样品中齐墩果酸吸光度积分平均值分别为2394.60、2382.24、2597.26、2619.28、2600.86、2618.14，相对标准差(RSD)＜5％，表明样品供试液层析显色后，遮光保存在4h内稳定。
8加样回收率试验 已知含量的样品9份，精密称定，加入齐墩果酸对照品，加乙醇50ml，加热回流20min，放冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流1次，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至2ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.5μl及对照品溶液0.5μl和3μl，点于同一薄层板上，按下式计算回收率，结果见表15。
表15 加样回收率试验结果
| 实验编 号 | 样品重 (g) | 样品中齐墩果酸的 量(mg) | 加入齐墩果酸的 量(mg) | 测得齐墩果酸总 量(mg) | 回收率 (％) |
| 1 | 0.0934 | 0.7694 | 0.8 | 1.56 | 98.83 |
| 2 | 0.1114 | 0.9176 | 0.8 | 1.68 | 95.30 |
| 3 | 0.1037 | 0.8542 | 0.8 | 1.69 | 104.48 |
| 4 | 0.0988 | 0.8138 | 1.0 | 1.85 | 103.62 |
| 5 | 0.0851 | 0.7010 | 1.0 | 1.72 | 101.90 |
| 6 | 0.1016 | 0.8369 | 1.0 | 1.82 | 98.31 |
| 7 | 0.0969 | 0.7982 | 1.25 | 2.08 | 102.55 |
| 8 | 0.1810 | 1.4909 | 1.25 | 2.69 | 95.93 |
| 9 | 0.2212 | 1.8220 | 1.25 | 3.01 | 95.03 |
回收率试验结果表明，9次试验的加样回收率均在95％～105％之间，平均值为99.55％，RSD小于5％，说明该方法的回收率良好。
9样品含量测定取三批中试样品(批号1、2、3)，照拟定的方法，制备样品供试液。精密吸取供试品溶液0.5μl，对照品液1μl和3μl，交叉点于同一硅胶G薄层板上，层析、显色、扫描，测得吸光度积分值，计算含量，结果分别为8.61、8.95和9.77mg/g。
10药材含量测定 照《中国药典》2005年版一部31页女贞子(含量测定)项下方法，取药材三批样品约相当于原药材1.025g，精密称定，加乙醇50ml，加热回流20min，放冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流一次，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。以拟定的条件进行层析、显色、扫描，测得吸光度积分值，计算含量，结果其三批样品测定结果分别为15.40、16.52和14.69mg/g。
11 实验发现，采用10％硫酸乙醇溶液作为显色剂时，喷雾务必均匀，使薄层板均匀湿润，否则对结果影响较大；若采用浸板的方法可使显色均匀而测定结果稳定。
下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子39.7重量份
熊胆粉0.8重量份 甘草 19.8重量份。
以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉，装人胶囊，制成1000粒，即得。
实施例2
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子39.7重量份
熊胆粉0.8重量份甘草 19.8重量份。
以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小 时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉。取细粉，加入0.5-1.5倍量的食用植物油，研磨，经常规工艺压制成软胶囊1000粒，即得组合物的软胶囊。
实施例3
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加 99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲 119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸 39.7重量份 女贞子 39.7重量份
熊胆粉 0.8重量份 甘草 19.8重量份。
以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉。取细粉与微晶纤维素混匀，制粒，干燥，过20-24目筛，压片，即得。
实施例4
斑蝥 10重量份 人参 15重量份 黄芪 110重量份
刺五加110重量份 三棱 35重量份 半枝莲110重量份
莪术 35重量份 山茱萸35重量份 女贞子35重量份
熊胆粉0.6重量份 甘草 15重量份。
以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉，装人胶囊，制成1000粒，即得。
实施例5
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子39.7重量份
败酱草21.8重量份 蜂胶 17.9重量份。
以上十一味，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；将蜂胶加热使之溶化，在搅拌下加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉，装人胶囊，制成1000粒，即得。
实施例6本组合物胶囊质量控制方法：
【鉴别】(1)取本品内容物3.5g，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5ml使溶解，转至分液漏斗 中，再用5ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10、5、5、5ml)，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8ml水分三次溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用30ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品内容物15g，加75％乙醇100ml超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml溶解，转至分液漏斗中，用石油醚(30-60℃)提取2次，每次15ml，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液。另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，吸取上述四种溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(19∶1)为展开剂展开，取出，晾干，至紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。
(3)取样品10g，研细，加醋酸乙酯30ml，加热回流20min，放冷，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺三棱的药材同法制成阴性对照液。吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约5min，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。
(4)取本品粉末2g，加甲醇20mL回流提取1h，滤过，将滤液挥至约10mL，作为供试品溶液。另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点。而阴性样品无此斑点。
【含量测定】(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以苯基(50％)甲基硅酮(OV-17)为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15m1分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得。
本品每粒含斑蝥以斑蝥素(C10H12O4)计，不得少于0.03‰。
(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15∶85)为流动相；检测波长为240nm。理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％
甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含山茱萸以马钱苷(C17H26010)计不得少于0.03％。
(3)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行剃度洗脱；检测波长为205nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30ml，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，精密量取续滤液25ml至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.03％。
(4)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-4％醋酸溶液(32∶68)为流动相；检测波长为335nm。理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取细粉约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)50ml，加热回流2小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含半枝莲以野黄芩苷(C21H18O12)计不得少于0.10％。
(5)取细粉约5克，精密称定，加乙醇加热回流3次，每次50ml，每次30分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙脂(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B薄层色谱扫描法)进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得。
本品含女贞子以齐墩果酸(C30H48O3)计不得少于0.10％。
实施例7
斑蝥 7.9重量份 人参 19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加99.2重量份 三棱 31.7重量份 半枝莲119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子39.7重量份
熊胆粉0.8重量份 甘草 19.8重量份。
以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛备用；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次32ml，浸泡60-80小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.20(80℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在80℃以下烘干，粉碎成细粉，装人胶囊，制成1000粒，即得。
【鉴别】(1)取本品内容物3.5g，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5ml使溶解，转至分液漏斗中，再用5ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10、5、5、5ml)，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8ml水分三次溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用30ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品内容物15g，加75％乙醇100ml超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml溶解，转至分液漏斗中，用石油醚(30-60℃)提取2次，每次15ml，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液。另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法 制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，吸取上述四种溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(19∶1)为展开剂展开，取出，晾干，至紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。
(3)取样品10g，研细，加醋酸乙酯30ml，加热回流20min，放冷，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺三棱的药材同法制成阴性对照液。吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约5min，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。
(4)取本品粉末2g，加甲醇20mL回流提取1h，滤过，将滤液挥至约10mL，作为供试品溶液。另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点。而阴性样品无此斑点。
【含量测定】(1)照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以苯基(50％)甲基硅酮(OV-17)为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15ml分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得。
本品每粒含斑蝥以斑蝥素(C10H12O4)计，不得少于0.03‰。
(2)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15∶85)为流动相；检测波长为240nm。理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％
甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含山茱萸以马钱苷(C17H26O10)计不得少于0.03％。
(3)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行剃度洗脱；检测波长为205nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算 应不低于5000。
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30ml，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，精密量取续滤液25ml至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.03％。
(4)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-4％醋酸溶液(32∶68)为流动相；检测波长为335nm。理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取细粉约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)50ml，加热回流2小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含半枝莲以野黄芩苷(C21H18O12)计不得少于0.10％。
(5)取细粉约5克，精密称定，加乙醇加热回流3次，每次50ml，每次30分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙脂(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2005年版附录VI B薄层色谱扫描法)进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得。
本品含女贞子以齐墩果酸(C30H48O3)计不得少于0.10％。
Claims (4)
1.一种治疗癌症的药物组合物的检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和含量测定方法：
该药物组合物的原料药组成为：
斑蝥7-10重量份 人参15-20重量份 黄芪95-110重量份
刺五加95-110重量份 三棱30-35重量份 半枝莲110-130重量份
莪术30-35重量份 山茱萸35-45重量份 女贞子35-45重量份
熊胆粉0.6-1.0重量份 甘草15-20重量份；
鉴别方法包括下述方法：
鉴别1：取该药物组合物相当于原药材3-4重量份，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取3-5小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5体积份使溶解，转至分液漏斗中，再用5体积份水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，分别为10、5、5、5体积份，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次5体积份，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8体积份水分三次溶解，转移至氧化铝柱上，其为中性氧化铝100～200目、2g、干法装柱、直径1cm、长25cm，先用30体积份氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25体积份洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法附录VI B试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以13-18∶37-42∶20-25∶8-12的氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别2：取该药物组合物相当于原药材15-16重量份，加75％乙醇100体积份超声提取20-60min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15体积份溶解，转至分液漏斗中，用石油醚30-60℃提取2次，每次15体积份，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10体积份，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2体积份溶解，作为供试品溶液；取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液；另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液；在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液；照薄层色谱法，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以15-20∶0.5-1.5的氯仿-甲醇为展开剂展开，取出，晾干，至254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
鉴别3：取该药物组合物相当于原药材10-11重量份，研细，加醋酸乙酯30体积份，加热回流10-30min，放冷，滤过，滤液浓缩至1体积份，作为供试品溶液；取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液；取缺三棱的药材同法制成阴性对照液；吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5-10∶2-4的环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘5min，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
鉴别4：取该药物组合物相当于原药材2-3重量份，加甲醇20体积份回流提取0.5-2h，滤过，将滤液挥至10体积份，作为供试品溶液；另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4-6∶2-4∶0.5-2∶0.5-2的醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点；阴性对照无干扰；
含量测定方法包括下述方法：
含量测定1：照中国药典2005年版一部附录VI E气相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验，以苯基50％甲基硅酮OV-17为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取该药物组合物相当于原药材10-11重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿50-70体积份，加热回流0.5-1.5小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15-20体积份分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至2体积份，定量转移至5体积份量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得；
本品含斑蝥以斑蝥素C10H12O4计不得少于0.03‰；
含量测定2：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10-20∶80-90的乙腈-水为流动相；检测波长为240nm；理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取该药物组合物相当于原药材0.5-1.0重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20-30体积份，密塞，称定重量，加热回流0.5-1.5小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含山茱萸以马钱苷C17H26O10计不得少于0.03％；
含量测定3：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为205nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备取该药物组合物相当于原药材1-2重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷25-35体积份，加热回流2-4小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50体积份，密塞，放置过夜，超声处理，功率250W、频率50kHz，20-40分钟，精密量取续滤液25体积份至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10体积份量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含人参以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量不得少于0.03％；
含量测定4：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30-35∶65-70的甲醇-4％醋酸溶液为流动相；检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取该药物组合物相当于原药材2-3重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚60-90℃50体积份，加热回流1-3小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100体积份，密塞，称定重量，加热回流1-2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含半枝莲以野黄芩苷计不得少于0.10％；
含量测定5：取该药物组合物相当于原药材5-6重量份，精密称定，加乙醇加热回流2-4次，每次40-60体积份，每次25-35分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10体积份量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版附录VI B薄层色谱法试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以4-6∶1-3∶0.5-1.5的环己烷-丙酮-乙酸乙脂为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照中国药典2005年版附录VIB薄层色谱扫描法进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得；本品含女贞子以齐墩果酸计不得少于0.10％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该检测方法包括如下鉴别和含量测定方法：
鉴别1：取该药物组合物相当于原药材3.6g，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至于，残渣加5％氢氧化钠溶液5体积份使溶解，转至分液漏斗中，再用5体积份水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次为：10、5、5、5体积份，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5体积份，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8体积份水分三次溶解，转移至氧化铝柱上，其为中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm；先用30体积份氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25体积份洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙Rg1对照品及黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8μl；对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以15∶40∶22∶10的氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水于5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘5～10分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别2：取该药物组合物相当于原药材15.4g，加75％乙醇100体积份超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15体积份溶解，转至分液漏斗中，用石油醚30-60℃提取2次，每次15体积份，弃去石油醚提取液，溶解液用氯仿提取2次，每次10体积份，合并氯仿液蒸干，残渣加甲醇2体积份溶解，作为供试品溶液；取刺五加对照药材2.5g同法制成对照药材溶液；另取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液；在按处方比例称取除刺五加外的其他药材依法制成阴性对照溶液；照薄层色谱法，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以19∶1的氯仿-甲醇为展开剂展开，取出，晾干，至254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在于对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
鉴别3：取该药物组合物相当于原药材10.25g，研细，加醋酸乙酯30体积份，加热回流20min，放冷，滤过，滤液浓缩至1体积份，作为供试品溶液；取三棱对照药材1g，同法制成对照药材溶液；取缺三棱的药材同法制成阴性对照液；吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7∶3的环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘5min，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；
鉴别4：取该药物组合物相当于原药材2.05g，加甲醇20体积份回流提取1h，滤过，将滤液挥至10体积份，作为供试品溶液；另取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；取缺半枝莲的阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶3∶1∶1的醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开10cm，取出，晾干，喷以1％FeCl3乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的灰绿色斑点；阴性对照无干扰；
含量测定1：照中国药典2005年版一部附录VI E气相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以苯基50％甲基硅酮OV-17为固定液，涂布浓度为4％；柱温为170℃±10℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取斑蝥素对照品适量，精密称定，加氯仿制成每1ml含0.028mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取该药物组合物相当于原药材10.25重量份，精密称定，混匀，取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60体积份，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15体积份分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至2体积份，定量转移至5体积份量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，计算，即得；
本品含斑蝥以斑蝥素计不得少于0.03‰；
含量测定2：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以15∶85乙腈-水为流动相；检测波长为240nm；理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品适量，加80％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取该药物组合物相当于原药材0.512重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25体积份，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含山茱萸以马钱苷计不得少于0.03％；
含量测定3：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为205nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备取该药物组合物的相当于原药材1.025重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30体积份，加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50体积份，密塞，放置过夜，超声处理，功率250W、频率50kHz，30分钟，精密量取续滤液25体积份至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10体积份量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含人参以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量不得少于0.03％；
含量测定4：照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以32∶68的甲醇-4％醋酸溶液为流动相；检测波长为335nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：精密称取野黄芩苷对照品适量，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取该药物组合物相当于原药材2.05重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚60-90℃50体积份，加热回流2小时，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，连同滤纸放回锥形瓶中，精密加入甲醇100体积份，密塞，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品含半枝莲以野黄芩苷计不得少于0.10％；
含量测定5：取该药物组合物相当于原药材5.125重量份，精密称定，加乙醇加热回流3次，每次50体积份，每次30分钟，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版附录VIB薄层色谱法试验，精密吸取供试品溶液2μl对照品溶液4μl与8μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以5∶2∶1的环己烷-丙酮-乙酸乙脂为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照中国药典2005年版附录VIB薄层色谱扫描法进行扫描，波长：λS＝530，λR＝700nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得；本品含女贞子以齐墩果酸计不得少于0.10％。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于药物组合物的原料药组成为：
斑蝥 7.9重量份 人参19.8重量份 黄芪 99.2重量份
刺五加 99.2重量份 三棱31.7重量份 半枝莲 119重量份
莪术 31.7重量份 山茱萸39.7重量份 女贞子 39.7重量份
熊胆粉 0.8重量份 甘草19.8重量份。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于药物组合物的制备方法为：以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛，得细粉；斑蝥用氯仿浸泡提取2-4次，每次95.2体积份，浸泡72小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩得稠膏；其余黄芪等五味加水煎煮三次，第一次2-4小时，第2次1-2小时，第三次0.5-1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至80℃时相对密度为1.1-1.3的浓缩液；熊胆粉加75-85℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及细粉，搅匀，在80℃以下烘干，加入常规辅料，经常规方法制成临床接受的口服固体制剂。
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2007
- 2007-09-19 CN CN2007101219603A patent/CN101391070B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1785402A (zh) * | 2005-11-12 | 2006-06-14 | 郭凌云 | 复方斑蝥制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 冰华等.中药抗癌药.《国外医药.植物药分册》.1991,第6卷(第5期), * |
| 卫生部.复方斑蝥胶囊.《卫生部颁药品标准 中药成方制剂第十七册》.1998, * |
| 国家药典委员会编.刺五加，人参，三棱，半边莲.《中华人民共和国药典2005年版一部》.化学工业出版社出版,2005, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101391070A (zh) | 2009-03-25 |
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