CN105806964A - 刺五加甘草制剂的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种刺五加甘草制剂的检测方法，所述刺五加甘草制剂包括刺五加和甘草，其特征在于，所述方法包括通过薄层色谱法分别鉴定刺五加和甘草来对刺五加甘草制剂进行定性检测，并且通过高效液相色谱法分别测定紫丁香苷和甘草酸的含量来对刺五加甘草制剂进行定量检测。本发明还涉及该检测方法的应用。

Description

刺五加甘草制剂的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种制剂的检测方法，尤其涉及一种药物制剂的检测方法。本发明还涉及该检测方法的应用。

背景技术

近年来，在我国中草药制剂已广泛应用于动物养殖中，在加速生长、提高生产性能和增强机体免疫力、抗病毒、抗应激等方面达到了较好的综合效应，而且具有无抗药性、无残留、副作用小、效果显著等特点。

刺五加和甘草是重要的中药原料。

其中，刺五加(拉丁名称为Acanthopanaxsenticosus)为五加科五加属，落叶灌木，其根部和根状茎可入药。其中含有多种活性化学成分，目前分离出的重要成分为苷类化合物。刺五加总苷能改变机体应激反应警戒期的病理过程，防止在此过程中的肾上腺增生、胆甾醇含量降低，胸腺缩小及胃出血情况。多糖和紫丁香苷具有抗疲劳、增强免疫力、护肝和释放乙酰胆碱，增加胰岛素分泌等作用。

甘草(拉丁名称为GlycyrrhizauralensisFisch)为豆科甘草属，多年生草本植物，根与根状茎可入药。多年临床应用与病毒性呼吸系统疾病、肝炎、呼吸系统感染、口腔溃疡等多种细菌或病毒性疾病，提示甘草可能具有良好的抗菌和抗病毒作用。甘草酸是甘草的一种活性成分。

以刺五加和甘草为主要成分的刺五加甘草制剂中，刺五加成分和甘草成分能够协同作用，从而有效提高机体免疫力，提高抵抗热应激功能，有效治疗鸡的肾型传染性支气管炎，具有非常良好的医学应用前景。

然而，目前还没有针对刺五加甘草制剂的检测方法，不利于控制其质量，为保证临床使用安全、有效、稳定。尤其是，刺五加甘草制剂中紫丁香苷等物质难以提取，也对检测工作造成了不小的困难。因此，本领域需要建立一个有效的、并且能够定性、定量检测刺五加甘草制剂的方法。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案。

本发明的一个目的在于，提供一种刺五加甘草制剂的检测方法，所述刺五加甘草制剂包括刺五加和甘草，其特征在于，所述方法通过薄层色谱法分别鉴定刺五加和甘草来对刺五加甘草制剂进行定性检测，通过高效液相色谱法分别测定紫丁香苷和甘草酸的含量来对刺五加甘草制剂进行定量检测。

其中，紫丁香苷是刺五加发挥药效作用的基础，紫丁香苷可通过有效清除自由基，增强T淋巴细胞和自然杀伤细胞活性等途径增强机体免疫力的作用，还可以减低神志清楚的动物的交感紧张和促进神经生长。；甘草酸作为甘草的重要活性成分，具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗变态反应、抗肿瘤及免疫调节等作用。因此本发明所述的方法中以紫丁香苷和甘草酸为主要控制指标进行定量检测，能够有效控制成品质量，更好地发挥制得产品的药效。以刺五加和甘草为主要成分的刺五加甘草制剂中，刺五加成分和甘草成分能够协同作用，从而有效提高机体免疫力，提高抵抗热应激功能，有效治疗鸡的肾型传染性支气管炎，具有非常良好的医学应用前景。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述薄层色谱法中以异嗪皮啶为对照。异嗪皮啶是刺五加的特征成分，且在薄层色谱中具有显著斑点，因此本发明采用异嗪皮啶作为刺五加的薄层鉴别的对照品。以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂来鉴定刺五加甘草制剂中的刺五加，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比比例为(18-20):(0.8-1.2):(0.08-0.12)，优选为19:1:0.1。采用三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，尤其是该比例范围内的三氯甲烷-甲醇-水为展开剂能够更加有效地分离刺五加中的异嗪皮啶与其他成分，检测方法有效且专属性良好。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述薄层色谱法中以甘草为对照，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂来鉴定刺五加甘草制剂中的甘草，所述乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比比例为(12-18):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(1.8-2.3)，优选为15:1:1:2。采用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水，尤其是所述比例范围内的乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂能够更加有效地分离甘草中的主要成分，检测方法有效且专属性良好。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述薄层色谱法包括如下步骤来对刺五加甘草制剂中的刺五加进行定性检测：

1)向1-5g、优选1.5-3g、更优选2.5g刺五加甘草制剂中加甲醇10-100ml，优选为50ml，加热回流并滤过，蒸干滤液，残渣加水10ml使溶解，用三氯甲烷提取1-5次，每次3-25ml，优选用三氯甲烷提取2次，每次10ml，然后合并三氯甲烷液，蒸干，向残渣加甲醇0.5-3.0ml，优选1ml使溶解，作为供试品；

2)取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品；

3)取供试品和对照品各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂展开，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比比例为(18-20):(0.8-1.2):(0.08-0.12)，优选为19:1:0.1，然后取出，晾干，置于365nm紫外波长下检视。若供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显蓝色荧光斑点，则该刺五加甘草制剂中含有刺五加。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述薄层色谱法包括如下步骤来对刺五加甘草制剂中的甘草进行定性检测：

1)向0.5-5g、优选1-3g、更优选1.6g刺五加甘草制剂中加水10-100ml、优选40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品；

2)取甘草对照药材，加乙醚40ml，加热回流并滤过，弃去醚液，向药渣加甲醇30ml，加热回流并滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照品；3)取供试品和对照品各2μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂展开，所述乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比比例为(12-18):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(1.8-2.3)，优选为15:1:1:2，然后取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置于365nm紫外波长下检视。若供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，则该刺五加甘草制剂中含有甘草。

在本发明的一个具体的实施方式中，采取如下方式对其进行定性鉴定：

i)取刺五加甘草制剂2.5g，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品。另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品。照薄层色谱法试验，吸取供试品和对照品各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为19:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

ii)取刺五加甘草制剂1.6g，加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml(必要时离心)，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品。另取甘草对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，照供试品制备方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品和对照品各2μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比为15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

优选的，该具体的实施方式针对由刺五加500g和甘草500g制得的刺五加甘草粉。

在本发明的一个优选的实施方式中，通过所述高效液相色谱法来测定紫丁香苷的含量是以乙腈为流动相A，以水为流动相B，并且按表1中的规定进行梯度洗脱：

表1

优选下表2中的规定进行梯度洗脱：

表2

并且检测波长为265nm；优选的，理论板数按紫丁香苷峰计算不低于5000；优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

在本发明的一个优选的实施方式中，通过所述高效液相色谱法来测定甘草酸的含量是以体积比比例为(65～70):(30～35):(0.5～1.5)的甲醇-醋酸铵溶液-冰醋酸为流动相，其中所述醋酸铵溶液中醋酸铵的浓度为0.2mol/L，优选体积比比例为(67:33:1)的甲醇-醋酸铵溶液-冰醋酸为流动相，并且检测波长为250nm；优选的，理论板数按甘草酸峰计算不低于2000；优选以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

在本发明的一个优选的实施方式中，通过所述高效液相色谱法来测定紫丁香苷的含量包括如下步骤：

1)制备对照品：取紫丁香苷对照品并加入甲醇制成每1ml含36～44μg紫丁香苷的溶液，制得对照品；

2)制备供试品：取刺五加甘草制剂0.45～0.55g，用50％甲醇20ml溶解，超声处理30min，冷却后加50％甲醇定容至25ml体积，摇匀，过滤，取续滤液，制得供试品，其中所述超声处理的功率为200W～300W，优选为250W，频率为40～60KHz，优选为50kHz；

3)分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

在本发明的一个优选的实施方式中，刺五加甘草制剂中所含的刺五加以紫丁香苷(C₁₂H₂₄O₉)计，每1g不得少于1.5mg为佳。以1.5mg/g为限控制成品质量，可有效控制成品中紫丁香苷的含量，控制生产工艺中刺五加的提取率，从而保证本品良好的临床效果。

在本发明的一个优选的实施方式中，通过所述高效液相色谱法来测定甘草酸的含量包括如下步骤：

1)制备对照品：取甘草酸铵对照品9～11mg，加流动相40～45ml，超声处理使溶解，冷却后，加流动相定容至50ml体积，摇匀，制得对照品。

2)制备供试品：取刺五加甘草制剂0.36～0.44g，加流动相，超声处理30分钟，取出，放冷，加流动相稀释至50ml体积，摇匀，即供试品，其中所述超声处理的功率优选为200W～300W，优选为250W，频率为40～60KHz，优选为50kHz。

3)分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

在本发明的一个优选的实施方式中，刺五加甘草制剂中所含的甘草以甘草酸(C₄₂H₆₂O₁₆)计，每1g不得少于21.0mg为佳。以21.0mg/g为限控制成品质量，可有效控制成品中甘草酸的含量，控制生产工艺中甘草的提取率，从而保证本品良好的临床效果。

在本发明的一个具体的实施方式中，甘草酸由高效液相色谱法测定，具体为：

i)制备对照品：取甘草酸铵对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相45ml，超声处理使溶解，取出，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含甘草酸铵0.2mg，折合甘草酸为0.1959mg)。

ii)准备供试品：取本品约0.4g，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相适量，超声处理(功率200W，频率50kHz)30分钟，取出，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

iii)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

在本发明的一个优选的实施方式中，刺五加甘草制剂中刺五加的含量为每g刺五加甘草制剂中不少于2.1mg刺五加，甘草的含量为每g刺五加甘草制剂中不少于30mg甘草。在本发明的一个优选的实施方式中，所述刺五加甘草制剂的剂型可以是但不仅限于是粉剂、丸剂、喷雾剂、颗粒剂、软膏剂、液剂和吸入剂中任意一种或多种形式。

若无特殊说明，本发明所述的方法中制备供试品的步骤和制备对照品的步骤可以以任意顺序进行，即可以制备供试品再制备对照品，也可以先准备对照品再制备供试品，还可以一边制备供试品一边制备对照品，或者两者交替进行，等等。

本发明的又一个目的在于，根据上述检测方法在制备刺五加甘草制剂过程中进行的质量控制中的应用。

本发明所述的刺五加甘草粉能够补中益气，健脾，能够用于提高机体免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果，抵抗热应激功能，治疗鸡的肾型传染性支气管炎。

本发明所述方法中的具体实验操作，若无特殊说明，使用本领域常规的方法进行。

本发明的有益效果在于：通过本发明的检测方法，能够快速、有效、简单方便地检测刺五加甘草制剂，并且能够既定性又定量地检测其中的刺五加成分和甘草成分。本发明的检测方法具有良好的专属性、重复性和准确性。通过本发明的检测方法，能够有效监控刺五加甘草制剂的制备过程，有利于质量控制，可以增强制备的刺五加甘草制剂的有效性、质量可控性和稳定性，保证其临床使用安全、有效、稳定。

附图说明

图1为刺五加鉴定的薄层色谱图。其中，1：缺刺五加阴性对照；2：异嗪皮啶；3～5：刺五加甘草制剂三批样品。

图2为甘草鉴定的薄层色谱图。其中，1：甘草对照品；2～4.刺五加甘草制剂供试品；5：缺甘草阴性对照样品。

图3为紫丁香苷的色谱图。其中，A：紫丁香苷对照品色谱图；B：供试品色谱图；C：阴性对照色谱图。

图4为紫丁香苷含量测定标准曲线。

图5为甘草酸铵的色谱图。其中，A：甘草酸铵对照品色谱图；B：供试品色谱图；C：阴性对照色谱图。

图6为甘草酸铵含量测定标准曲线。

具体实施方式

以下通过非限制性的实验例来进一步说明本发明的具体实施方式。本领域技术人员应理解的是，以下所有实施例均为阐释性的，而并不构成对本发明所要求保护的范围进行任何限定。

实施例1制备刺五加甘草制剂

将刺五加和甘草两味中药饮片(均购自于洛阳康鑫中药饮片有限公司，刺五加批号为20120315，甘草批号为20120428)，加8倍量水浸泡1.5小时，80℃减压回流提取2h，滤过，滤渣再加8倍量水提取1次，合并滤液，趁热离心，上清液减压浓缩至相对密度约1.1(≤70℃)，喷雾干燥，得成品250g。

实施例2刺五加甘草制剂的鉴别方法的专属性研究

(1)试剂与样品

阳性对照品：异嗪皮啶，来源：中国药品生物制品检定所，含量：99.8％，批号：110837-200304。

样品：刺五加甘草粉，按照实施例1制备。

阴性对照品：按照实施例1方法制备各鉴别项阴性对照品。

(2)刺五加的鉴定

取实施例1制备的样品2.5g，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。按处方比例称取甘草药材，按刺五加甘草粉小试工艺制备缺刺五加阴性样品，称取阴性样品适量(相当于甘草原药材5g)，按上述供试品溶液的制备方法制备缺刺五加阴性对照溶液；另取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(19：1)(I)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图1所示。

结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，且阴性无干扰。表明方法专属性良好。

(3)甘草的鉴别

取本品1.0g，加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml(必要时离心)，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；按处方比例称取刺五加药材，按刺五加甘草粉小试工艺制备缺甘草阴性样品，称取阴性样品适量(相当于刺五加原药材2g)，按上述供试品溶液的制备方法制备缺甘草阴性对照溶液；另取甘草对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，照供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。结果如图2所示。

结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，且阴性样品无干扰。

实施例3紫丁香苷含量测定方法的研究

(1)仪器：

高效液相色谱仪，e2695型，美国沃特世公司

紫外检测器，2489型，美国沃特世公司

电子分析天平，AB135-S型，梅特勒托利多公司

试剂：

乙腈成都市科龙化工试剂厂，色谱纯，20130221

纯化水自制

对照品：

紫丁香苷，来源：中国药品生物制品检定所，含量：100％，批号：111574-200502。

样品：

按实施例1制备。

(2)色谱条件

色谱柱为AgilentEclipseXDBC18柱(250×4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相A；以水为流动相B，按下表3中的规定进行梯度洗脱；检测波长为265nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。

表3

(3)溶液的制备

对照品溶液的制备取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品约0.5g，精密称定，置小烧杯中，用50％甲醇20ml，分次溶解，转移至25ml量瓶中，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min，取出，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：按照实施例1的制备方法制备缺刺五加的阴性对照样品，取阴性对照样品，再按照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，即得。

(4)专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行试验，记录色谱图，见图3。结果表明：供试品色谱中紫丁香苷的保留时间与对照品一致，而阴性对照在对照品、供试品色谱峰相应的位置上无干扰，方法专属性良好。

(5)线性范围考察

取专属性考察项下对照品溶液，按上述色谱条件分别精密量取3、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y＝3E+06x-13800，r＝0.9999，结果表明，在0.1218μg～0.8120μg范围内，紫丁香苷峰面积对数与进样量对数有良好的线性关系，数据见表4。

表4线性关系试验结果

(6)重复性试验

取实施例1制备的同一批样品，按照(3)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，精密吸取6份供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算含量，见表5。结果测得紫丁香苷含量RSD＝0.8％<3.0％，重复性良好。

表5重复性试验结果

(7)稳定性试验

取实施例1制的样品，按照(3)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时测定。测定峰面积并计算RSD，见表6。结果测得24小时内供试品中紫丁香苷的峰面积RSD＝0.7％<3.0％，在24小时内稳定性良好。

表6稳定性试验结果

(8)回收率试验

取实施例1制的样品6份，每份约0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，各精密加入214.20μg/mL的紫丁香苷对照品溶液3mL，按拟定的含量测定方法，制备供试品溶液，测定峰面积并计算含量，计算回收率，见表7。结果表明回收率在98.99％～100.86之间，平均回收率99.7％，RSD＝0.7％<3.0％，加样回收率符合规定。

表7回收率试验结果

(9)三批样品含量测定

取按照实施例1制备的3批刺五加甘草粉(批号分别为：20130201、20130202、20130203)，按照本发明建立的含量测定方法测定紫丁香苷的含量，其结果分别为2.2mg/g，2.1mg/g，2.0mg/g。

实施例4甘草酸含量测定方法研究

(1)仪器：

高效液相色谱仪，e2695型，美国沃特世公司

紫外检测器，2489型，美国沃特世公司

电子分析天平，AB135-S型，梅特勒托利多公司

试剂：

甲醇成都市科龙化工试剂厂，色谱纯，20130423

醋酸铵成都市科龙化工试剂厂，分析纯，20110328

冰醋酸成都市科龙化工试剂厂，分析纯，20100419

纯化水自制

对照品：

甘草酸铵，来源：中国食品药品检定研究院，含量：93.1％，批号：110731-201116。

样品：

按实施例1制备。

(2)色谱条件

色谱柱为AgilentEclipseXDBC18柱(250×4.6mm,5μm)；以甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(67:33:1)为流动相；检测波长为250nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。

(3)溶液的制备

对照品溶液的制备取甘草酸铵对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相45ml，超声处理使溶解，取出，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含甘草酸铵0.2mg，折合甘草酸为0.1959mg)。

供试品溶液的制备取本品约0.4g，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相适量，超声处理(功率200W，频率50kHz)30分钟，取出，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液的制备：按照实施例1的制备方法制备缺甘草的阴性对照样品，取阴性对照样品，再按照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，即得。

(4)专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行试验，记录色谱图，见图5。结果表明：供试品色谱中甘草酸的保留时间与对照品一致，而阴性对照在对照品、供试品色谱峰相应的位置上无干扰，方法专属性良好。

(5)线性范围考察

取专属性考察项下对照品溶液，按上述色谱条件分别精密量取3、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y＝820823x-47774，r＝0.9999，结果表明。结果表明，在0.5357μg～3.5711μg范围内，甘草酸铵峰面积对数与进样量对数有良好的线性关系，数据见表8。

表8甘草酸线性关系试验结果

(6)重复性试验

取实施例1制备的同一批样品，按照(3)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，精密吸取6份供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算含量，结果测得甘草酸含量RSD％为0.3，表明方法精密度良好，数据见表9。

表9重复性试验结果

(7)稳定性试验

取实施例1制备的同一批样品，按照(3)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时测定，结果表明24小时内供试品中甘草酸含量RSD为1.1％，表明方法稳定性良好，数据见表10。

表10稳定性试验结果

(8)回收率试验

取实施例1制备的同一批样品6份，每份约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，各精密加入1.00mg/mL的甘草酸对照品溶液5mL，按拟定的含量测定方法，制备供试品溶液，测定峰面积并计算含量，计算回收率，见表11。结果表明回收率在99.52％～100.32％之间，平均回收率为100.0％，RSD＝0.3％<3.0％，加样回收率符合规定。

表11回收率试验结果

(9)三批样品含量测定

取按照实施例1制备的3批刺五加甘草粉(批号分别为：20130201、20130202、20130203)，按照本发明建立的含量测定方法测定甘草酸的含量，其结果分别为22.0mg/g，22.2mg/g，22.2mg/g。

Claims (11)

1.一种刺五加甘草制剂的检测方法，所述刺五加甘草制剂包括刺五加和甘草，其特征在于，所述方法通过薄层色谱法分别鉴定刺五加和甘草来对刺五加甘草制剂进行定性检测，通过高效液相色谱法分别测定紫丁香苷和甘草酸的含量来对刺五加甘草制剂进行定量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法中以异嗪皮啶为对照，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂来鉴定刺五加甘草制剂中的刺五加，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比比例为(18-20):(0.8-1.2):(0.08-0.12)，优选为19:1:0.1。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法中以甘草为对照，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂来鉴定刺五加甘草制剂中的甘草，所述乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比比例为(12-18):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(1.8-2.3)，优选为15:1:1:2。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法包括如下步骤来对刺五加甘草制剂中的刺五加进行定性检测：

1)向1-5g、优选1.5-3g、更优选2.5g刺五加甘草制剂中加甲醇10-100ml，优选为50ml，加热回流并滤过，蒸干滤液，残渣加水10ml使溶解，用三氯甲烷提取1-5次，每次3-25ml，优选用三氯甲烷提取2次，每次10ml，然后合并三氯甲烷液，蒸干，向残渣加甲醇0.5-3.0ml，优选1ml使溶解，作为供试品；

2)取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品；

3)取供试品和对照品各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂展开，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比比例为(18-20):(0.8-1.2):(0.08-0.12)，优选为19:1:0.1，然后取出，晾干，置于365nm紫外波长下检视。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法包括如下步骤来对刺五加甘草制剂中的甘草进行定性检测：

1)向0.5-5g、优选1-3g、更优选1.6g刺五加甘草制剂中加水10-100ml、优选40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品；

2)取甘草对照药材，加乙醚40ml，加热回流并滤过，弃去醚液，向药渣加甲醇30ml，加热回流并滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照品；

3)取供试品和对照品各2μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂展开，所述乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比比例为(12-18):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(1.8-2.3)，优选为15:1:1:2，然后取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置于365nm紫外波长下检视。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，通过所述高效液相色谱法来测定紫丁香苷的含量是以乙腈为流动相A，以水为流动相B，并且按如下规定进行梯度洗脱：

当时间为0～7分钟时，流动相A的体积百分比为8-12％，流动相B的体积百分比为92～88％，

当时间为8～13分钟时，流动相A的体积百分比为35-45％，流动相B的体积百分比为65-55％，

当时间为14～20分钟时，流动相A的体积百分比为8-12％，流动相B的体积百分比为92～88％，

优选按如下规定进行梯度洗脱，

当时间为0～7分钟时，流动相A的体积百分比为11％，流动相B的体积百分比为89％，

当时间为8～13分钟时，流动相A的体积百分比为40％，流动相B的体积百分比为60％，

当时间为14～20分钟时，流动相A的体积百分比为11％，流动相B的体积百分比为89％，

并且检测波长为265nm；优选的，理论板数按紫丁香苷峰计算不低于5000；优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，通过所述高效液相色谱法来测定甘草酸的含量是以体积比比例为(65～70):(30～35):(0.5～1.5)的甲醇-醋酸铵溶液-冰醋酸为流动相，其中所述醋酸铵溶液中醋酸铵的浓度为0.2mol/L，优选体积比比例为(67:33:1)的甲醇-醋酸铵溶液-冰醋酸为流动相，并且检测波长为250nm；优选的，理论板数按甘草酸峰计算不低于2000；优选以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，通过所述高效液相色谱法来测定紫丁香苷的含量包括如下步骤：

1)制备对照品：取紫丁香苷对照品并加入甲醇制成每1ml含36～44μg紫丁香苷的溶液，制得对照品；

2)制备供试品：取刺五加甘草制剂0.45～0.55g，用50％甲醇20ml溶解，超声处理30min，冷却后加50％甲醇定容至25ml体积，摇匀，过滤，取续滤液，制得供试品，其中所述超声处理的功率为200W～300W，优选为250W，频率为40～60KHz，优选为50kHz；

3)分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，通过所述高效液相色谱法来测定甘草酸的含量包括如下步骤：

1)制备对照品：取甘草酸铵对照品9～11mg，加流动相40～45ml，超声处理使溶解，冷却后，加流动相定容至50ml体积，摇匀，制得对照品。

2)制备供试品：取刺五加甘草制剂0.36～0.44g，加流动相，超声处理30分钟，取出，放冷，加流动相稀释至50ml体积，摇匀，即供试品，其中所述超声处理的功率优选为200W～300W，优选为250W，频率为40～60KHz，优选为50kHz。

3)分别精确吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的检测方法，其特征在于，刺五加甘草制剂中刺五加的含量为每g刺五加甘草制剂中不少于2.1mg刺五加，甘草的含量为每g刺五加甘草制剂中不少于30mg甘草，所述刺五加甘草制剂优选为粉剂、丸剂、喷雾剂、颗粒剂、软膏剂、液剂和吸入剂中任意一种或多种形式。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的检测方法在制备刺五加甘草制剂过程中进行的质量控制中的应用。