CN102353735B - 通脉糖眼明胶囊的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，包括如下各项：性状：本品为硬胶囊剂，内容物为棕黄色粉末，气微、味微苦；鉴别：包括三七粉末的显微观察；黄芪、丹参和三七的薄层鉴别；检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；浸出物测定：取通脉糖眼明胶囊内容物，用正丁醇微沸提取，过滤，蒸发滤液后干燥，称定重量；含量测定：以丹酚酸B为对照品，用50%甲醇提取，采用液相色谱法测定丹酚酸B的含量。与现有技术相比，本发明是专用于通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，经试验证明，以该方法为标准检测通脉糖眼明胶囊，可以很好的保证制剂的稳定性，从而保证其疗效。

Description

通脉糖眼明胶囊的质量检测方法

技术领域

本发明涉及药品的质量检测技术领域，特别是涉及通脉糖眼明胶囊的质量检测方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高、营养摄入的增多甚至过剩，我国糖尿病（消渴症）的发病率不断攀升，目前约有糖尿病患者4000余万人，糖尿病及其并发症正在严重危害着我国人民的身体健康及生命安全。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的严重并发症，经研究发现，DR发生率随着糖尿病病程进展逐渐升高，糖尿病发病5年后视网膜病变发生率约为25%，10年后增至60%，15年后可高达75%～80%。DR存在典型的视网膜微血管损害，其临床表现为微血管瘤、出血、硬性渗出、棉絮斑（软性渗出）、视网膜内微血管异常、静脉串珠样改变、新生血管及纤维组织增生等，是糖尿病患者致盲的主要原因之一。因此，DR的高发病率、高致盲性严重威胁着人类的健康，是当今医学领域急需解决的重大攻关课题。

中医认为：消渴症、视瞻昏渺(糖尿病并视网膜病变)是因肾阴亏虚，肝失所养，精血不能上荣于目，气阴两虚致血行涩滞，淤血阻闭目络，目失所养，邪阻目窍而致目无所见。本病以气阴两虚为本，淤血阻络为标，气阴两虚夹淤为主要病机，贯穿于本病全过程。因此，益气养阴，活血通络可作为DR的治疗大法。目前DR的药物治疗包括西药和中药治疗。

通脉糖眼明胶囊是治疗糖尿病视网膜病变的一种中药制剂，具有很好的疗效，其配方和制备方法如下：

处方：黄芪196g、丹参245g、三七195g、生地196g、决明子245g、淡竹叶147g、茺蔚子196g、青葙子245g，制成1000粒。

制法：以上8味（三七除外）药材，浸泡5h，第一次加12.5倍量水，第二、三次均加10倍量水，煎煮三次，每次1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.21-1.25（60℃）的稠浸膏，待冷却后加入三七粉（过100目），混匀，80℃减压干燥，粉碎，过60目筛，装入胶囊，制成1000粒，即得。

通脉糖眼明胶囊是由8味中药原料制备而成，目前没有适用的质量检测方法，为了保证制剂的稳定性和疗效，发明人对该胶囊剂的质量检测进行了研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，以保证该胶囊制剂的稳定性和疗效。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

    本发明的通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，包括如下各项：

性状：本品为硬胶囊剂，内容物为棕黄色粉末，气微、味微苦；

鉴别：包括三七粉末的显微观察；黄芪、丹参和三七的薄层鉴别；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

浸出物测定：取通脉糖眼明胶囊内容物，用正丁醇微沸提取，过滤，蒸发滤液后干燥，称定重量；

含量测定：以丹酚酸B为对照品，用50%甲醇提取，采用液相色谱法测定丹酚酸B的含量。

具体的，上述通脉糖眼明胶囊的质量检测方法中的鉴别项包括三七粉末的显微观察和黄芪、丹参、三七的薄层鉴别：

（1）三七粉末的显微观察

淀粉粒的鉴别：本品粉末棕黄色；取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加稀甘油2～3滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，淀粉粒众多，单粒或复粒，单粒呈球形、半圆形、多角形或不规则形，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10分粒组成；

导管的鉴别：取取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加水合氯醛溶液2～3滴，透化后滴加稀甘油1滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，梯纹导管散在；

（2）黄芪的薄层鉴别：取胶囊内容物加甲醇超声溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用乙酸乙酯提取，提取后的乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；同供试品溶液制备方法将黄芪对照药材制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，以体积比为10:1:1的三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯液为展开剂，展开晾干后置氨蒸汽中熏蒸，置254nm紫外灯下观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的两个蓝色荧光斑点；

（3）丹参的薄层鉴别：同黄芪薄层鉴别时供试品溶液的制备方法制备供试品溶液；另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液；另取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，以体积比为2:3:4:0.5:2的甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸液为展开剂，展开晾干后置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（4）三七的薄层鉴别：取胶囊内容物加水溶解，离心滤过，残渣用水洗涤，滤过，残渣干燥，取残渣用甲醇超声溶解，滤过，滤液蒸干后加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材，加甲醇超声溶解，滤过，滤液蒸干后加甲醇溶解制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，以体积比为4:1的三氯甲烷-甲醇液为展开剂，展开晾干后喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

最佳的，前述鉴别方法如下：

（1）三七粉末的显微观察

淀粉粒的鉴别：本品粉末棕黄色；取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加33%稀甘油（体积）2～3滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，淀粉粒众多，单粒或复粒，单粒呈球形、半圆形、多角形或不规则形，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10分粒组成；

导管的鉴别：取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加水合氯醛溶液2～3滴，透化后滴加33%稀甘油（体积）1滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，梯纹导管散在；

（2）黄芪的薄层鉴别：取胶囊内容物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20ml水使溶解，用20ml乙酸乙酯振摇提取，分取乙酸乙酯液，加适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；同供试品溶液制备方法将黄芪对照药材1g制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:1:1的三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏蒸5ml，置254nm紫外灯下观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的两个蓝色荧光斑点；

（3）丹参的薄层鉴别：同黄芪薄层鉴别时供试品溶液的制备方法制备供试品溶液；另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液；另取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以体积比为2:3:4:0.5:2的甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（4）三七的薄层鉴别：取胶囊内容物10g，加50ml水溶解，离心，弃去上清液，残渣同法加水离心滤过，60℃干燥至干，取残渣1g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干后加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材1g，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1的三氯甲烷-甲醇液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

上述鉴别时所用的水合氯醛溶液是取水合氯醛50g，加蒸馏水15ml、甘油10 ml，使溶解，即得。

前述通脉糖眼明胶囊的质量检测方法还包括浸出物的测定：取胶囊内容物10g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇100ml，密塞，称定重量，连接回流冷凝管，直火加热至沸腾，并保持微沸1小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用正丁醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液50ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量。

前述的浸出物测定：胶囊内容物含正丁醇浸出物不低于2.41%。

前述通脉糖眼明胶囊的质量检测方法中所述的含量测定具体为：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1.67%（体积）甲酸水溶液：甲醇：乙腈的体积比为61:32:7的溶液为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为286nm；理论塔板数按丹酚酸B峰计，应不低于2000；

对照品溶液的制备  取丹酚酸B对照品用75%甲醇制成每1mL含丹酚酸B 0.1896mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取胶囊内容物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

前述的含量测定，每粒胶囊含丹以参以丹酚酸B计，不少于3.74mg。

    一、处方中各原料药的研究

通脉糖眼明胶囊处方由黄芪、丹参、三七等八味中药组成，不含毒性药材，无十八反及十九畏配伍禁忌，各药材的主要化学成分及质量标准如下：

（1）黄芪：豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。黄芪的化学成分主要有黄酮类、皂苷类和多糖等 ，其中黄酮类化合物有黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷四大类，皂苷类化合物有黄芪皂苷及其大豆皂苷。另外尚含单糖、氨基酸、蛋白质、核黄素、叶酸、尼克酸、维生素D、驱油酸、亚麻酸、微量元素、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、对羟苯基丙烯酸、咖啡酸、绿原酸、棕榈酸、B．谷甾醇、胡萝卜苷、羽扇豆醇，正十六醇等成分。本品应符合《中国药典》2010年版一部283页黄芪项规定。

（2）丹参：唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参的化学成分主要有脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。    脂溶性成分：属醌、酮型结构的有：丹参酮，隐丹参酮，异丹参酮，异隐丹参酮，羟基丹参酮，丹参酸甲酯，亚甲基丹参醌，二氢丹参酮，丹参新醌A、B、C、D，二氢异丹参酮，新隐丹参酮，去羟新睡丹参酮，代号为Ro一O9O6OO的2-异丙基-8-甲基菲-3,4-二酮，去甲丹参酮，丹参二醇A、B、C，丹参新酮，1-氢丹参新酮，1-氢丹参酮，1-氧代异隐丹参酮，3α-羟基丹参酮-A，1,2-二氢丹参醌，醛基丹参酮，亚甲二氢丹参酮，7β-羟基-8,l3-松香二烯-11,12-二酮，1,2，5，6-四氢丹参酮，4-亚甲丹参新酮，丹参酚醌，鼠尾草呋萘嵌苯酮，丹参内酯，二氢丹参内酯，丹参螺缩酮内酯等。水溶性成分：酚性酸化合物有：丹参酸A、B、C，丹参酸A又称丹参素，其结构为D(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，丹参酸B是由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸浓缩形成的；丹参酸C是2分子丹参素的缩合物；丹参酚酸A、B、C、D、E、G；迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，紫草酸草酸单甲脂，紫草酸二甲酯，紫草酸乙酯，紫草酸B，原儿茶醛，咖啡酸，异阿魏酸等。还含黄芩甙，异欧前胡内酯，熊果酸，β-谷甾醇，胡萝卜甙，5-(3-羟丙基)-7-甲氧墓-2-(3’甲氧基-4’-羟苯墓)-3-苯并[b]呋喃甲醛，替告皂甙元，豆甾醇等。本品应符合《中国药典》2010年版一部70页丹参项规定。

（3）三七：五加科植物三七Panax notoinseng (Burk.) F.H.Chen的干燥根及根茎。三七主要含皂苷类成分（如三七皂苷、人参皂苷等）和非皂苷类成分（如三七多糖，氨基酸，黄酮类，甾醇类等）。三七中皂苷成分是三七的主要有效成分之一，迄今为止，已从三七的不同部位分离得到6O余种单体皂苷成分，这些单体皂苷成分大多数为达玛烷 的2O(s)-原人参二醇型[20(S)-protopanaxadio1]和2O一(s)原人参三醇型[20(S)-peotopanaxatrio1]，但未发现含有齐墩果酸型皂苷。本品应符合《中国药典》2010年版一部11页三七项规定。

（4）生地：玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。生地的主要成分为苷类、糖类及氨基酸，并以苷类为主。地黄在苷类中又以环烯醚萜苷为主，主要为梓醇，多糖类，氨基酸，微量元素等。目前已从地黄中分离出32种环烯醚萜苷类化合物，其中以梓醇含量最高。地黄中的糖类主要含有水苏糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊花糖、半乳糖及地黄多糖a、地黄多糖b等糖类成分。本品应符合《中国药典》2010年版一部115页地黄项规定。

（5）决明子：豆科植物决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子。决明子主要含大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚等蒽醌类成分，尚含VA，糖类，蛋白质，和人体必需的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu等。本品应符合中国药典2010年版一部135页决明子项规定。

（6）淡竹叶：禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶。淡竹叶中含有大量的黄酮和多糖类成分、内酯、叶绿素、氨基酸、维生素、微量元素等成分，都具有很高的生物活性作用。本品应符合中国药典2010年版一部308页淡竹叶项规定。

（7）茺蔚子：唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的干燥成熟果实。主要含益草宁碱、水苏碱及脂肪油，另含维生素A。本品应符合中国药典2010年版一部225页茺蔚子项规定。

（8）青葙子：菊科植物青葙Celosia argentea L.的干燥成熟种子。本品应符合中国药典2010年版一部184页青葙子项规定。

二、通脉糖眼明胶囊质量检测方法研究

1性状：中试三批样品内容物均为棕黄色，气微，味微苦。

2鉴别：本品由八味中药材组成，经提取、精制而成，成分较复杂。我们对各味中药材的成分进行了鉴别方法的试验研究，建立了黄芪、丹参、三七的薄层鉴别方法以及三七的粉末鉴别方法。

2.1三七的粉末鉴别  本品粉末棕黄色。

淀粉粒的鉴别：取本品粉末适量置载玻片上，滴加稀甘油2-3滴，盖上盖玻片置显微镜下观察。淀粉粒众多，单粒或复粒，单粒呈球形、半圆形、多角形或不规则形，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10分粒组成。（见图1）

导管的鉴别：取本品粉末适量置载玻片上，滴加水合氯醛溶液2～3滴，透化2-3次后，滴加稀甘油1滴，盖上盖玻片置显微镜下观察。梯纹导管散在。（见图2）

2.2黄芪的鉴别  取本品内容物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20ml水使溶解，加乙酸乙酯20ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，加适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（10:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏约5分钟，取出，置紫外灯（254nm）下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的两个蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰（见图3）。

2.3丹参的鉴别  供试品溶液制备同(2.2)项下供试品制备方法。取缺丹参的阴性模拟制剂3g，同法制备阴性对照液。另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:3:4:0.5:2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰（见图4）。

2.4三七的鉴别  取本品内容物10g，加水50ml使溶解，离心滤过，残渣用水洗涤2次，每次50ml，离心滤过，残渣60℃干燥。取残渣1g，加甲醇10ml，超声处理20min，滤过，滤液水浴蒸干后，加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取缺三七的阴性模拟制剂3g，加甲醇10ml，超声处理20min，滤过，滤液水浴蒸干后，加甲醇1ml使溶解，作为阴性对照液。另取三七对照药材1g，按照阴性对照液制备项下同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰（见图5）。

3检查：按照胶囊剂项下的有关规定（《中国药典》2010年版一部附录ⅠL）进行检查，分别检查水分、装量差异、崩解时限、微生物限度：

3.1水分：按《中国药典》2010年版一部水分测定法（附录Ⅸ H）中“烘干法”测定。

3.2装量差异：按《中国药典》2010年版一部附录制剂通则中胶囊剂（附录ⅠL）项下的规定检查。

3.3崩解时限：按《中国药典》2010年版一部附录ⅫA胶囊剂项下规定检查。

3.4微生物限度：按《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢ C “微生物限度法”检查。

各项检查结果表明，本品符合《中国药典》2010年版一部附录胶囊剂项下的有关规定。见表1

表1    通脉糖眼明胶囊检查结果（n=2）

4、浸出物测定

通脉糖眼明胶囊的主药为黄芪和三七，其有效成分为皂苷类（黄芪皂苷、三七皂苷、人参皂苷等），在正丁醇中有很好的溶解性，故选用正丁醇作为溶剂,由于正丁醇的沸程为117～118℃，水浴无法使其沸腾，需选用直火加热使其沸腾。

4.1．通脉糖眼明胶囊的正丁醇浸出物的测定

取通脉糖眼明胶囊内容物10g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇100ml，密塞，称定重量，连接回流冷凝管，直火加热至沸腾，并保持微沸1小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用正丁醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液50ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量。本品含正丁醇浸出物不低于2.41%。

通过对通脉糖眼明胶囊12个批次的的样品进行正丁醇浸出物测定，结果表明：其正丁醇浸出物平均含量为3.01%。以正丁醇浸出物平均含量下浮20%为低限，暂定通脉糖眼明胶囊的正丁醇浸出物的含量不低于2.41%。

5、含量测定

丹酚酸B：照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定。

5.1仪器与试药

仪器：Angilent1100高效液相色谱仪；HB-10250型超声清洗器（250W,40kHz），江苏汉邦科技有限公司；梅特勒-托利多AE电子分析天平（METTLER  TOLEDO十万分之一）。

试剂：甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水（娃哈哈饮用纯净水）。

丹酚酸B对照品：购自中国药品生物制品检定所（供含量测定用），批号为：111562-200908。

样品：通脉糖眼明胶囊（批号：20100901、20100902、20100903）

5.2对照品溶液制备 

取丹酚酸B对照品适量加75%甲醇制成每1mL含丹酚酸B 0.1896mg的溶液，即得。

5.3色谱条件的选择：

在进行丹酚酸B色谱条件选择时，我们参考了《中国药典》2010年版一部丹参项下丹酚酸B的含量测定色谱条件，进行了色谱波长的的筛选。根据实验确定丹酚酸B的色谱条件为：Hypersil ODS C₁₈ 5μm（250 mm×4.6mm）；以甲酸水(1:59)-甲醇-乙腈（61:32:7）为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为286nm。选择条件见表2。

表2  黄芩苷色谱条件选择表

5.4系统适应性试验

阴性对照试验及理论板数的确定：

阴性溶液的制备：取缺丹酸的阴性样品内容物约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

空白溶液的制备：精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：精密吸取对照品溶液5μl，阴性溶液、空白溶液及供试品溶液各5μl，按上述色谱条件注入色谱仪。从色谱图可知，在此色谱条件下，丹酚酸B峰与其它组分峰完全分离，在与丹酚酸B峰相同的保留时间内，阴性对照无干扰。样品理论塔板数以丹酚酸B计应不得低于2000。

5.5供试品溶液制备方法的选择

5.5.1 提取溶剂的选择

精密称取干膏样品0.4g置25ml容量瓶中，共5份，每份平行做2个样，分别加入水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、80%甲醇、甲醇约25ml， 超声处理30min，放冷，用以上不同的溶剂分别定容至刻度，摇匀，滤过，即得。结果见表3，方差分析见表4。

表3  供试品溶液提取溶剂的选择

表4 供试品溶液提取溶剂的选择方差分析

结论：P <0.01，用不同溶剂提取样品有显著性差别。但用水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、80%甲醇无显著性差别，选用50%甲醇。

5.5.2 料液比选择：精密称取0.4g的干膏样品分别置5、10、25、50、100ml容量瓶中，每份平行做2个样，加入50%甲醇约至刻度， 超声处理30min，放冷，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。结果见表5，方差分析见表6，HPLC图见图2。

表5 料液比选择

表6料液比选择方差分析

结论：P <0.01，用不同液料比提取样品，丹酚酸B的含量有显著性差异。但用液料比0.4:10，0.4:25，0.4:50，0.4:100提取样品，丹酚酸B的含量没有显著性差异，但0.4:10的峰面积过高，不利于操作，误差较大，故选用液料比0.4:50，即0.2g的样品用25ml 50%甲醇提取。

根据实验确定供试品制备方法为：

取装量差异项下的本品内容物约0. 2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.6线性关系的考察

标准曲线的绘制：精密称取丹酚酸B对照品19.4mg，置25ml容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含丹酚酸B 0.7779mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取丹酚酸B对照品溶液0.2，0.4，0.8，2.0，3.9，7.1ml置10ml容量瓶中，用50%甲醇依次稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定丹酚酸B的峰面积，。以峰面积为纵坐标(Y)，含量(μg)为横坐标(x)进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表7。

表7 线性关系考察结果表

得回归方程:Y=6184.770282X-1.5354877，r=0.99999，

丹酚酸B在0.076—3.890μg范围内线性关系良好。

5.7  精密度试验

5.7.1仪器精密度试验：精密吸取同一对照品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，同法测定峰面积。结果见表8。

表8 精密度考察实验结果表

结果表明：相对标准偏差RSD（%）为0.25%（n=6），表明重复性良好。

7.2重复性：取同一批号本品的内容物，按照低、中、高浓度取样，低浓度取样量约为0.16g，中浓度取样量约为0.2g，高浓度取样量约为0.24g，每个浓度分别按供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，按上述色谱条件下进行含量测定，用9个测定结果进行重复性评价。结果见表9。

表9  重复性实验结果表

结果：该样品的平均含量为8.9782mg/g，RSD为1.06%(n=6)，表明重复性良好。

5.7.3重现性试验：以与重复性实验相同的样品，在不同实验室、不同日期、不同的分析人员、不同仪器上检测。结果见表10，方差分析见表11。

表10  重现性实验结果表

表11重复性与中间精密度实验方差分析

结果：P〉0.05，重复性实验结果与中间精密度实验无显著性差别。

5.8准确度试验：取已知含量的同一批号本品内容物约0.10g，共9份，分别置25ml的量瓶中，分别精密加入样品含量的80%、100%、120%的丹酚酸B溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，用同一50%甲醇补足重量，摇匀，过滤，即得。按上述色谱条件下进行含量测定，结果表明，丹酚酸B的平均回收率，方法可行。结果见表12。

回收率=（C-A）/B×100%

A: 样品中丹酚酸B的量（mg）

  B：丹酚酸B苷对照品加入量（mg）

C：测得量（mg）

表12 准确度考察

结果：平均回收率为98.92%，RSD（%）为3.57%（n=9），表明丹酚酸B的回收率良好。

5.9稳定性试验

取同一批号本品的内容物，按供试品溶液制备方法操作，按上述色谱条件,每隔1小时测定一次丹酚酸B的峰面积，结果表明样品中丹酚酸B在8h内稳定性良好。结果见表13。

表13  稳定性实验结果表

结果：取供试品溶液，在设定的时间内注入色谱仪，测得平均峰面积为：460.83911，RSD（%）为0.40%(n=9)，表明本供试品溶液在8h内稳定。

5.10 样品测定

取3个批号的本品按供试品溶液制备方法，平行制备2份，按上述色谱条件测定峰面积，计算出各样品中丹酚酸B含量（mg/g）；结果见表14。

表14 三批样品含量测定结果表

上述3批样品测得丹酚酸B平均含量为9.37mg/g。从大批量规模生产考虑，以本品每克丹酚酸B的含量其限度以80%计算，丹酚酸B的含量为9.37×0.8×0.5=3.74mg/粒，故本品的限度定为：本品每粒含丹以参以丹酚酸B（C₃₆H₃₀O₁₆）计，不得少于3.74mg。

三、稳定性实验资料

根据医院制剂稳定性研究的技术要求和本品的质量标准，对本品在模拟市售包装（PC塑料瓶装）条件下，采用室温存放和恒温恒湿加速试验2种方式考察该品的稳定性,按一定时间对各项指标进行考察。样品批号：070706、070725、070810；规格：0.5g/粒。

1、试药：甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲苯、甲酸，均为分析纯。丹酚酸B对照品（供分析用,批号：111562-200403）、黄芪对照药材（供鉴别用，批号：120974-200609）、丹参对照药材（供鉴别用，批号：120923-200610）、三七对照药材（供鉴别用，批号：120941-200506），均购自中国药品生物制品检定所。

2、仪器：生化培养箱(LRH-250-A，广东省医疗器械厂)；METTLER AE240电子天平(梅特勒-脱利多仪器[上海]有限公司)；LB-881B六管崩解仪（无锡科达仪器厂）；CQ-400B超声波清洗机（上海跃进医学光学器械厂）；ZF-I型紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；TGL-16型台式高速离心机（上海菲恰尔分析仪器在限公司）。

3、存放条件

3.1、室温存放：PC塑料瓶装。

3.2、恒温恒湿加速试验：PC塑料瓶装，温度：40℃±1℃，相对湿度75%。

4、考察项目

【性状】按技术方案所述方法检查。

【鉴别】按技术方案所述方法检查。

【水分】按《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H第一方法检查。

【崩解时限】按《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下相应方法检测。

【微生物限度检查】按《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢ C进行检查。

5、考察结果

三批样品考察结果见表15至表20。

6、结论

6.1、室温存放：三批样品在室温存放条件考察12个月，测试结果表明，本品所测各项指标都在质量标准草案所规定的范围内，表明稳定。

6.2、恒温恒湿加速试验：三批样品，在温度为40℃±1℃，相对湿度75%的条件考察3个月，测定结果表明，本品所测各项指标都在质量标准草案所测定的范围内，表明稳定。

暂定本品有效期为1.0年。

表15  通脉糖眼明胶囊室温存放结果（生产日期：2007.7.6、 批号：070706）

表16 通脉糖眼明胶囊室温存放结果（生产日期：2007.7.25、批号：070725）

表17 通脉糖眼明胶囊室温存放结果（生产日期：2007. 8.10，批号：070810）

表18 通脉糖眼明胶囊恒温恒湿试验结果（生产日期：2007.7.6、批号：070706）

表19 通脉糖眼明胶囊恒温恒湿试验结果（生产日期：2007.7.25、批号：070725）

表20 通脉糖眼明胶囊恒温恒湿试验结果（生产日期：2007.8.10、批号：070810）

与现有技术相比，本发明是专用于通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，经试验证明，以该方法为标准检测通脉糖眼明胶囊，可以很好的保证制剂的稳定性，从而保证其疗效。

附图说明

图1是通脉糖眼明胶囊中三七粉末淀粉粒显微图；

图2是通脉糖眼明胶囊中三七粉末梯纹导管显微图；

图3是通脉糖眼明胶囊中黄芪薄层鉴别图，1是黄芪对照药材，2、3和4是供试品（批号：070706，070725，070810），5是阴性供试品（缺黄芪药材）；

图4是通脉糖眼明胶囊中丹参薄层色谱图，1是丹酚酸B对照品溶液，2是丹参对照药材，3、4和5是供试品（批号：070706，070725，070810），6是阴性供试品（缺丹参药材）；

图5是通脉糖眼明胶囊中三七薄层色谱图，1是三七对照药材，2、3和4是供试品（批号：070706，070725，070810），5是阴性供试品（缺三七药材）。

具体实施方式

【原材料的质量检测】

（1）黄芪应符合《中国药典》2010年版一部283页黄芪项规定。

（2）丹参应符合《中国药典》2010年版一部70页丹参项规定。

（3）三七应符合《中国药典》2010年版一部11页三七项规定。

（4）生地应符合《中国药典》2010年版一部115页地黄项规定。

（5）决明子应符合中国药典2010年版一部135页决明子项规定。

（6）淡竹叶应符合中国药典2010年版一部308页淡竹叶项规定。

（7）茺蔚子应符合中国药典2010年版一部225页茺蔚子项规定。

（8）青葙子应符合中国药典2010年版一部184页青葙子项规定。

【名称】通脉糖眼明胶囊

【处方】黄芪196g、丹参245g、三七195g、生地196g、决明子245g、淡竹叶147g、茺蔚子196g、青葙子245g。

【制法】以上8味（三七除外）药材，浸泡5 h，第一次加12.5倍量水，第二、三次均加10倍量水，煎煮三次，每次1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.21-1.25（60℃）的稠浸膏，待冷却后加入三七粉（过100目），混匀，80℃减压干燥，粉碎，过60目筛，装入胶囊，制成1000粒，即得。

【质量检测】

1、性状：本品为硬胶囊剂，内容物为棕黄色粉末，气微、味微苦；

2、鉴别：包括三七粉末的显微观察；黄芪、丹参和三七的薄层鉴别

2.1三七粉末的显微观察

淀粉粒的鉴别：本品粉末棕黄色；取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加稀甘油（取甘油33ml，加蒸馏水稀释至100 ml）2-3滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，淀粉粒众多，单粒或复粒，单粒呈球形、半圆形、多角形或不规则形，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10分粒组成；

导管的鉴别：取取胶囊内容物适量置载玻片上，滴加水合氯醛溶液（取水合氯醛50g，加蒸馏水15ml与甘油10 ml，使溶解）2-3滴，透化后滴加稀甘油（取甘油33ml，加蒸馏水稀释至100 ml）1滴，盖上盖玻片置显微镜下观察，梯纹导管散在；

2.2黄芪的薄层鉴别：取胶囊内容物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20ml水使溶解，用20ml乙酸乙酯振摇提取，分取乙酸乙酯液，加适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；同供试品溶液制备方法将黄芪对照药材1g制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液个5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:1:1的三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏蒸5ml，置254nm紫外灯下观察，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的两个蓝色荧光斑点；

2.3丹参的薄层鉴别：同黄芪薄层鉴别时供试品溶液的制备方法制备供试品溶液；另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液；另取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以体积比为2:3:4:0.5:2的甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

2.4三七的薄层鉴别：取胶囊内容物10g，加50ml水溶解，离心，弃去上清液，残渣同法加水离心滤过，60℃干燥至干，取残渣1g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干后加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材1g，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1的三氯甲烷-甲醇液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3、检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

4、浸出物测定：取胶囊内容物10g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇100ml，密塞，称定重量，连接回流冷凝管，直火加热至沸腾，并保持微沸1小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用正丁醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液50ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量。胶囊内容物含正丁醇浸出物不低于2.41%。

5、含量测定

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1.67%（体积）甲酸水溶液：甲醇：乙腈的体积比为61:32:7的溶液为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为286nm；理论塔板数按丹酚酸B峰计，应不低于2000；

对照品溶液的制备  取丹酚酸B对照品用75%甲醇制成每1mL含丹酚酸B 0.1896mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取胶囊内容物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

每粒胶囊含丹以参以丹酚酸B计，不少于3.74mg。

【功能与主治】益气养阴,活血通络,明目退翳。用于消渴视瞻昏渺病,气阴两虚夹淤证，症见倦怠乏力、腰酸漆软、口干多饮、目睛干涩、视物昏花、舌暗红少津、脉细数，即糖尿病并视网膜病变见前述症状者。

【用法与用量】口服，一次4～6粒，一日3次。三个月为一疗程。

【规格】每粒0.5g，每瓶36粒。

【不良反应】尚不明确

【注意】对本品过敏者禁用；青光眼患者忌用；忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。有出血倾向患者慎用；对脾虚夹湿、腹满便溏患者不宜使用。如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。

【贮藏】密封，置阴凉干燥处。

【包装】塑料瓶装。 

Claims (2)

1.通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，包括如下各项：

性状：本品为硬胶囊剂，内容物为棕黄色粉末，气微、味微苦；

鉴别：包括三七粉末的显微观察；黄芪、丹参和三七的薄层鉴别；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

浸出物测定：取胶囊内容物10g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入正丁醇100ml，密塞，称定重量，连接回流冷凝管，直火加热至沸腾，并保持微沸1小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用正丁醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液50ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量；

含量测定：以丹酚酸B为对照品，用50%甲醇提取，采用液相色谱法测定丹酚酸B的含量；

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1.67%体积甲酸水溶液：甲醇：乙腈的体积比为61:32:7的溶液为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为286nm；理论塔板数按丹酚酸B峰计，不低于2000；

对照品溶液的制备  取丹酚酸B对照品用75%甲醇制成每1mL含丹酚酸B 0.1896mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取胶囊内容物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

2.按照权利要求1所述通脉糖眼明胶囊的质量检测方法，其特征在于：胶囊内容物含正丁醇浸出物不低于2.41%。

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