CN104483315A - 中药制剂壮腰补肾丸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药制剂壮腰补肾丸的检测方法,本方法中设置显微鉴别壮腰补肾丸处方中熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪;以当归对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷、五味子甲素为对照品,薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归、人参、续断、黄芪和五味子成分;高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中川续断皂苷Ⅵ的含量,本品每1g含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mg的定量指标及检验方法,提高了壮腰补肾丸质量标准的可控性,进一步确保产品内在质量和疗效,使质量标准较为完善,提高了药品的质量控制水平。
Description
技术领域
本发明属于中成药的技术领域,涉及以中药材为原料制成的中药制剂壮腰补肾丸的检验方法。
背景技术
壮腰补肾丸收载在卫生部药品标准中药成方制剂第二册,标准编号为WS3-B-0273-90,记载处方及质量标准:
处方:
但是上述标准存在如下问题:技术标准中还存在没有反映药物内在质量的指标成分的含量测定项,鉴别项目等缺点,为提高中药的产品质量,需要完善产品质量标准。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的壮腰补肾丸标准不足之处,提供一种中药制剂壮腰补肾丸的检测方法,该方法能够定性、定量检测药物成分,进一步确保产品内在质量和疗效。
本发明的技术方案如下:
一种中药制剂壮腰补肾丸的检测方法,其中所述的药物配方由中药材处方:
组成,制法:以上二十味,粉碎成细粉,过筛,混匀,每100g粉末用炼蜜15~30g,加适量的水,制丸,干燥,即得;其特征在于该方法的步骤是:
(1)显微鉴别壮腰补肾丸处方中熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪,以当归对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷、五味子甲素为对照品,薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归、红参、续断、黄芪和五味子成分;
(2)以川续断皂苷Ⅵ为对照品,高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中续断的含量;
所述的显微镜鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪的方法为:取本品,置显微镜下观察:薄壁组织灰棕色至黑棕色,细胞多皱缩,内含棕色核状物为熟地黄;淀粉粒三角状卵形或矩圆形,直径24~40μm,脐点短缝状或人字状为山药;不规则分枝状团块无色,遇水合氯醛试液溶化,菌丝无色或淡棕色,直径4~6μm为茯苓;种皮表皮石细胞淡黄色或淡黄棕色,表面观类多角形,壁较厚,孔沟细密,胞腔含暗棕色物为五味子;花粉粒类圆形,直径24~34μm,外壁有刺,长3~5μm,具3个萌发孔为菊花;纤维成束或散离,壁厚,表面有纵裂纹,两端断裂成帚状或较平截为黄芪;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归成分的方法为:取本品15g,研碎,加乙醚60ml,超声处理20分钟,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取当归对照药材0.5g,加乙醚20ml,同法制成对照药材溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶液各2~5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯9∶1为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯365nm下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的荧光主斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有红参成分的方法为:取本品7g,研碎,置索氏提取器中,加甲醇100ml,加热回流提取3小时,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣用水30ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次20ml,正丁醇液蒸干,残渣用水30ml溶解,滤过,滤液通过D101型大孔吸附树脂柱,其内径为1.5cm,柱高为12cm,先后用水50ml、40%乙醇30ml和70%乙醇50ml洗脱,收集70%乙醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述四种溶液各2~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有续断成分的方法为:取川续断皂苷Ⅵ对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取[鉴别]“红参”项下的供试品溶液10μl、川续断皂苷Ⅵ对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水13:7:2,10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有黄芪成分的方法为:取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取[鉴别]“红参”项下的供试品溶液10μl、黄芪甲苷对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有五味子成分的方法为:取本品15g,研碎,加环己烷50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取五味子甲素对照品,加环己烷制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液20μl、五味子甲素对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚60~90℃-乙酸乙酯8:1.5为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯254nm下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
所述的以川续断皂苷Ⅵ为对照品,高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中续断的含量的方法为:
⑴色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.05%磷酸溶液30:70为流动相;检测波长为212nm;理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算应不低于4000;
⑵对照品溶液的制备:取川续断皂苷Ⅵ对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.30mg的溶液,即得;
⑶供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品,研细,取约5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100ml,密塞,称定重量,超声处理,功率500W,频率40KHz,40分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续断滤液50ml,蒸干,残渣加水50ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次30ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次30ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
⑷测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;本品每1g含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mg。
发明有益效果:质量标准中设置显微镜鉴别壮腰补肾丸处方中熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪,以当归对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷、五味子甲素为对照品,薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归、红参、续断、黄芪和五味子成分;高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中续断的含量,本品每1g含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mx。的定量指标及检验方法,提高了壮腰补肾丸质量标准的可控性,进一步确保产品内在质量和疗效,使质量标准较为完善,修订后的质量标准,提高了药品的质量控制水平。
本品处方含有二十味药材,续断在处方中占4.3%,具有补肝肾、强筋骨,调血脉,止崩漏之功效作用,为方中的君药,其主要有效成分为三萜皂苷类化合物,而川续断皂苷Ⅵ为其中代表性成分,因此测定川续断皂苷Ⅵ的含量,已成为评价续断药材及其制剂质量的重要指标。
附图说明
图1-1是熟地黄的薄壁组织鉴别图;
图1-2是山药的淀粉粒鉴别图;
图1-3是茯苓的菌丝鉴别图;
图1-4是五味子的石细胞鉴别图;
图1-5是菊花花粉粒鉴别图;
图1-6是黄芪的纤维鉴别图;
图2是当归为对照药材色谱图;
图3是人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1为对照品色谱图;
图4是川续断皂苷Ⅵ为对照品色谱图;
图5是黄芪甲苷为对照品色谱图;
图6是五味子甲素为对照品色谱图;
图7是川续断样品溶液的HPLC色谱图;
图8是川续断标准品溶液的HPLC色谱图;
图9缺续断的阴性溶液的HPLC色谱图;
图10是川续断皂苷Ⅵ线性图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明进一步说明。
实施例1改进后的壮腰补肾丸质量标准:
处方:
制法:以上二十味,粉碎成细粉,过筛,混匀,每100g粉末用炼蜜15~30g,加适量的水,制丸,干燥,即得。
性状:本品为黑色的水蜜丸;味甘、微酸。
鉴别:由图1-1~1-6可以看到。
(1)取本品,置显微镜下观察:薄壁组织灰棕色至黑棕色,细胞多皱缩,内含棕色核状物的为熟地黄,见图1-1。淀粉粒三角状卵形或矩圆形,直径24~40μm,脐点短缝状或人字状为山药,见图1-2。不规则分枝状团块无色,遇水合氯醛试液溶化;菌丝无色或淡棕色,直径4~6μm为茯苓,见图1-3。种皮表皮石细胞淡黄色或淡黄棕色,表面观类多角形,壁较厚,孔沟细密,胞腔含暗棕色物为五味子,见图1-4。花粉粒类圆形,直径24~34μm,外壁有刺,长3~5μm,具3个萌发孔为菊花,见图1-5。纤维成束或散离,壁厚,表面有纵裂纹,两端断裂成帚状或较平截为黄芪,见图1-6。
(2)检测当归,取本品15g,研碎,加乙醚60ml,超声处理20分钟,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5g,加乙醚20ml,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶液各2~5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的荧光主斑点。
(3)检测红参,取本品7g,研碎,置索氏提取器中,加甲醇100ml,加热回流提取3小时,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣用水30ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次20ml,正丁醇液蒸干,残渣用水30ml溶解,滤过,滤液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm,柱高为12cm),先后用水50ml、40%乙醇30ml和70%乙醇50ml洗脱,收集70%乙醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述四种溶液各2~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(4)检测续断,取川续断皂苷Ⅵ对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取[鉴别](3)项下的供试品溶液10μl、川续断皂苷Ⅵ对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(5)检测黄芪,取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取[鉴别](3)项下的供试品溶液10μl、黄芪甲苷对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(6)检测五味子,取本品15g,研碎,加环己烷50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml甲醇使溶解,作为供试品溶液。另取五味子甲素对照品,加环己烷制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液20μl、五味子甲素对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(8:1.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
检查:应符合丸剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录ⅠA)。
含量测定:按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.05%磷酸溶液(30:70)为流动相;检测波长为212nm。理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备取川续断皂苷Ⅵ对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.30mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品,研细,取约5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100ml,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40KHz)40分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液50ml,蒸干,残渣加水50ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次30ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次30ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。本品每1g含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mg。
功能与主治壮腰补肾,益气养血。用于心悸少寐,健忘怔忡,腰膝酸痛,肢体羸弱。
用法与用量口服。一次1袋,一日2次。
规格:每袋装5.6克;贮藏:密封。
壮腰补肾丸质量标准说明:
1、“壮腰补肾丸”是颈复康药业集团赤峰丹龙药业有限公司生产的品种,质量标准收载在卫生部药品标准中药成方制剂第二册中,为大蜜丸,国家食品药品监督管局于2013年批准该企业生产水蜜丸。本品按照《中药新药研究的技术要求》对壮腰补肾丸(水蜜丸)进行了性状、鉴别、检查及含量测定等方面进行了质量研究。本品为药材全粉入药,所以增加了熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪显微鉴别;当归、红参、续断、黄芪、五味子薄层鉴别;以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)为定量指标,制订了续断的含量测定方法。现将起草工作情况说明如下:
2、样品收集情况,见壮腰补肾丸(水蜜丸)性状考察结果表1。
表1样品收集明细
表1样品收集明细
批号 | 20110301 | 20110302 | 20110303 |
性状 | 显黑色;味甘、微酸 | 显黑色;味甘、微酸 | 显黑色;味甘、微酸 |
3、名称:未修订。本品是由壮腰补肾丸(蜜丸)经改变规格制成的水蜜丸,因此命名仍为壮腰补肾丸。
4、处方与制法:修订。依据《中国药典》2010年版一部药材项下炮制品名称有关要求,对处方中的远志(制)修改为制远志;牡蛎(煅)修改为煅牡蛎。制法:以上二十味,粉碎成细粉,过筛,混匀,每100g粉末用炼蜜15~30g,加适量的水,制丸,干燥,即得。
5、鉴别:
5.1显微鉴别:本品为药材全生粉入药,采用显微法鉴别处方中的熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪,具体内容为:薄壁组织灰棕色至黑棕色,细胞多皱缩,内含棕色核状物(熟地黄)。淀粉粒三角状卵形或矩圆形,直径24~40μm,脐点短缝状或人字状(山药)。不规则分枝状团块无色,遇水合氯醛试液溶化;菌丝无色或淡棕色,直径4~6μm(茯苓)。种皮表皮石细胞淡黄色或淡黄棕色,表面观类多角形,壁较厚,孔沟细密,胞腔含暗棕色物(五味子)。花粉粒类圆形,直径24~34μm,外壁有刺,长3~5μm,具3个萌发孔(菊花)。纤维成束或散离,壁厚,表面有纵裂纹,两端断裂成帚状或较平截(黄芪)。结果见图(1-1)~(1-6)。
5.2薄层鉴别
5.2.1当归:新增方法。参照《中国药典》2010年版一部有关内容进行了修订,采用薄层色谱法,以当归为对照药材,鉴别处方中的当归。
5.2.1.1供试品溶液的制备:取三批样品各15g,研碎,加乙醚60ml,超声处理20分钟,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
5.2.1.2对照药材溶液的制备:根据样品中当归含量,将当归对照药材用量定为0.5g,取当归对照药材0.5g,加乙醚20ml,超声处理20分钟,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为对照药材溶液。
5.2.1.3阴性样品溶液的制备:原方除去当归,按比例配方,并按制剂工艺制成缺当归的阴性样品,参照5.2.1.1供试品溶液的制备方法进行制备,作为阴性对照溶液。
5.2.1.4薄层条件及结果:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取当归对照药材溶液2μl,三批供试品溶液和阴性对照溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的荧光主斑点,阴性无干扰。结果见图2。
5.2.2红参:新增方法。参照《中国药典》2010年版一部有关内容进行了修订,采用薄层色谱法,以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1为对照品,鉴别处方中的红参。
5.2.2.1供试品溶液的制备:取三批样品各7g,研碎,置索氏提取器中,加甲醇100ml,加热回流提取3小时,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣用水30ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次20ml,正丁醇液蒸干,残渣用水30ml溶解,滤过,滤液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm,柱高为12cm),先后用水50ml、40%乙醇30ml和70%乙醇50ml洗脱,收集70%乙醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
5.2.2.2对照品溶液的制备:取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。
5.2.2.3阴性样品溶液的制备:原方除去红参,按比例配方,并按制剂工艺制成缺红参的阴性样品,参照5.2.2.1供试品溶液的制备方法进行制备,作为阴性对照溶液。
5.2.2.4薄层条件及结果:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述溶液各2~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰。结果见图3。
5.2.3续断:新增方法。参照《中国药典》2010年版一部有关内容进行了修订,采用薄层色谱法,以川续断皂苷Ⅵ为对照品,鉴别处方中的续断。
5.2.3.1供试品溶液的制备:取5.2.2.1项下的三批样品的溶液,作为供试品溶液。
5.2.3.2对照品溶液的制备:取川续断皂苷Ⅵ对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。
5.2.3.3阴性样品溶液的制备:原方除去续断,按比例配方,并按制剂工艺制成缺续断的阴性样品,参照5.2.2.1供试品溶液的制备方法进行制备,作为阴性对照溶液。
5.2.3.4薄层条件及结果:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取5.2.2.1项下的供试品溶液各10μl、缺续断阴性对照溶液10μl、川续断皂苷Ⅵ对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰。结果见图4。
5.2.4黄芪:新增方法。参照《中国药典》2010年版一部有关内容进行了修订,采用薄层色谱法,以黄芪甲苷为对照品,鉴别处方中的黄芪。
5.2.4.1供试品溶液的制备:取5.2.2.1项下的三批样品的溶液,作为供试品溶液。
5.2.4.2对照品溶液的制备:取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。
5.2.4.3阴性样品溶液的制备:原方除去黄芪,按比例配方,并按制剂工艺制成缺黄芪的阴性样品,参照5.2.2.1供试品溶液的制备方法进行制备,作为阴性对照溶液。
5.2.4.4薄层条件及结果:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取5.2.2.1项下的供试品溶液、缺黄芪阴性对照溶液各10μl、黄芪甲苷对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰。结果见图5。
5.2.5五味子:新增方法。参照《中国药典》2010年版一部有关内容进行了修订,采用薄层色谱法,以五味子甲素为对照品,鉴别处方中的五味子。
5.2.5.1供试品溶液的制备:取三批样品各15g,研碎,加环己烷50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml甲醇使溶解,作为供试品溶液。
5.2.5.2对照品溶液的制备:取五味子甲素对照品,加环己烷制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。
5.2.5.3阴性样品溶液的制备:原方除去五味子,按比例配方,并按制剂工艺制成缺五味子的阴性样品,参照5.2.5.1供试品溶液的制备方法进行制备,作为阴性对照溶液。
5.2.5.4薄层条件及结果:照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液、缺五味子阴性对照溶液各20μl、五味子甲素对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(8:1.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。结果见图6。
6、含量测定
6.1熟地黄:对处方中熟地黄进行含量测定试验摸索,采用乙腈-0.1%乙酸不同比例溶液为流动相对其中主要成分毛蕊花糖苷进行分析,结果阴性有干扰,此方法不可行。
6.2续断:本品处方含有二十味药材,续断在处方中占4.3%,具有补肝肾、强筋骨,调血脉,止崩漏之功效作用,为方中的君药,其主要有效成分为三萜皂苷类化合物,而川续断皂苷Ⅵ为其中代表性成分,因此测定川续断皂苷Ⅵ的含量,已成为评价续断药材及其制剂质量的重要指标。照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定。具体试验方法如下:
6.2.1色谱柱的选择
试用不同填料色谱柱及同一填料不同长度色谱柱,发现使用资生堂CAPCELLPAK MG C18(φ4.6×250mm)柱样品中川续断皂苷Ⅵ与其它杂质峰基本可达到完全分离。
6.2.2流动相的选择
试验中还曾使用乙腈-0.05%磷酸溶液(27:73)、乙腈-0.05%磷酸溶液(31:69)、乙腈-水(30:70)等流动相分离样品溶液,样品图谱中川续断皂苷Ⅵ分离状态均不佳。采用正文中流动相乙腈-0.05%磷酸溶液(30:70)川续断皂苷Ⅵ与其它组分均能达到基线分离。理论塔板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算不低于4000,分离度为1.95(见色谱图7)。
理论板数n=5.54(tR/Wh/2)2=9038
分离度R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=1.95
6.2.2检测波长的选择
中国药典2010年版一部续断药材含量测定项下川续断皂苷Ⅵ的测定波长为212nm,并以二级管阵列检测器对川续断皂苷Ⅵ对照品溶液进行检测,其最大吸收波长为212nm,所以选定212nm为测定波长。
6.2.3仪器、试剂及试药
岛津LC-10A型高效液相色谱仪(岛津LC-10AT泵;SPD-M10A二级管阵列检测器;CLASS-LC10色谱工作站);川续断皂苷Ⅵ对照品(批号111685-201003)由中国药品生物制品检定所提供;壮腰补肾丸(水蜜丸)为颈复康药业集团赤峰丹龙药业有限公司提供;乙腈为色谱纯;水为二次蒸馏水;其它试剂均为分析纯。
6.2.4提取方法的考察
测定时采用超声提取的方式,分别对提取溶剂及提取时间进行了选择。
6.2.4.1提取溶剂的选择
提取溶剂的确定:其它条件不变,用甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂,根据出峰时间、峰型、检测含量等因素进行考察,用同一批产品进行对比试验,结果见不同溶媒提取效果比较表2。
表2不同溶媒提取效果比较
组号 | 提取溶媒 | 含量(mg/g) |
1 | 甲醇 | 0.93 |
2 | 乙醇 | 0.55 |
3 | 70%甲醇 | 0.35 |
4 | 70%乙醇 | 0.27 |
试验结果显示,用乙醇、70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂,川续断皂苷Ⅵ提取率低,所以选择甲醇作为提取溶剂。
6.2.4.2提取方法和时间的选择
甲醇提取样品溶液采用超声处理(A法)、加热回流(B法)两种提取方式进行比较,结果见表川续断皂苷Ⅵ含量测定提取方法和时间比较表3。
表3川续断皂苷Ⅵ含量测定提取方法和时间比较
提取时间(分钟) | 30 | 40 | 60 |
A法川续断皂苷Ⅵ含量(mg/g) | 0.76 | 1.01 | 0.95 |
B法川续断皂苷Ⅵ含量(mg/g) | 0.87 | 0.87 | 0.88 |
结显示,超声处理的提取率高,故在提取方法上选择超声提取40分钟。
6.2.5溶液的制备
6.2.5.1对照品溶液的制备取川续断皂苷Ⅵ对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.30mg的溶液,即得。
6.2.5.2供试品溶液的制备取本品,研细,取约5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100ml,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40KHZ)40分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液50ml,蒸干,残渣加水50ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次30ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次30ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
6.2.5.3阴性对照试验
按处方比例称取缺续断以外的其余药材,按制备工艺制成缺续断的阴性样品,按上述供试品制备方法制成缺续断的阴性溶液,按测定法进行测定,结果表明阴性样品中未检出川续断皂苷Ⅵ峰,说明本品中川续断皂苷Ⅵ来自续断药材,其它药味及辅料不干扰川续断皂苷Ⅵ的测定,见色谱图8、9。
6.2.6线性关系考察
精密称取川续断皂苷Ⅵ0.01914g,置25ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。分别精密量取对照品贮备液1ml、2ml、3ml、4ml、6ml、8ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,分别取10μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,结果见川续断皂苷Ⅵ含量测定线性关系考察结果表4。
表4川续断皂苷Ⅵ含量测定线性关系考察结果
浓度(mg/ml) | 0.0716 | 0.1432 | 0.2148 | 0.2864 | 0.4296 | 0.5728 | 0.716 |
峰面积 | 144553 | 284336 | 428614 | 568890 | 857735 | 1153425 | 1424740 |
回归方程:Y=1998157.78X-289.19,r=0.9999,线性关系图如图10
结果表明,在0.0716~0.716mg/ml范围内,川续断皂苷Ⅵ的浓度与峰面积呈良好的线性关系,在此线性范围内可以采用对照品比较法进行含量测定。
6.2.7溶液稳定性考察
样品溶液(批号:20110303)在室温下保存,分别于0、1、2、4、6、8、12、24小时测定川续断皂苷Ⅵ峰面积,结果见川续断皂苷Ⅵ含量测定稳定性试验考察结果表5,峰面积基本不变。
表5川续断皂苷Ⅵ含量测定稳定性试验考察结果
6.2.8精密度试验
6.2.8.1对照品溶液精密度试验
取对照品溶液注入液相色谱仪,连续6次进针,测定峰面积,结果见对照品溶液精密度试验考察结果表6,RSD符合要求。
表6对照品溶液精密度试验考察结果
6.2.8.2样品溶液精密度试验
取样品溶液注入液相色谱仪,连续6次进针,测定峰面积,结果见样品溶液精密度试验考察结果表7,RSD符合要求。
表7样品溶液精密度试验考察结果表
6.2.9重复性试验
取壮腰补肾丸(水蜜丸)(批号:20110303)60g,精密称定,研细,分别称取9份,分为三组,每组分别为4.0g,5.0g,6.0g,精密称定,按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液,另取对照品溶液,按上述色谱条件进行HPLC分析,测定川续断皂苷Ⅵ的峰面积,计算样品含量。结果见川续断皂苷Ⅵ含量测定重复性试验考察结果表8。
表8川续断皂苷Ⅵ含量测定重复性试验考察结果
结果表明,川续断皂苷Ⅵ含量测定的重复性试验符合要求。
6.2.10回收率试验
采用加样回收试验,取壮腰补肾丸(水蜜丸)(批号:20110303)60g,精密称定,研细,分别称取9份,每份2.5g,精密加入不同量的对照品,按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液,按上述色谱条件进行HPLC分析,测定川续断皂苷Ⅵ的峰面积,计算回收率,川续断皂苷Ⅵ的平均回收率为99.34%(n=9),RSD=1.49%,结果见川续断皂苷Ⅵ含量测定加样回收率试验考察结果表9。
表9川续断皂苷Ⅵ含量测定加样回收率试验
6.2.11样品测定结果,结果见壮腰补肾丸(水蜜丸)中川续断皂苷Ⅵ含量测定结果表10。
表10川续断皂苷Ⅵ含量测定结果表
含量限度的确定:中国药典2010年版一部中续断药材项下含量测定规定,续断含川续断皂苷Ⅵ不得少于2.0%,并根据以上检测结果,确定壮腰补肾丸(水蜜丸)每克含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mg。
Claims (1)
1.一种中药制剂壮腰补肾丸的检测方法,其中所述的药物配方由中药材处方:
组成,制法:以上二十味,粉碎成细粉,过筛,混匀,每100g粉末用炼蜜15~30g,加适量的水,制丸,干燥,即得;其特征在于该方法的步骤是:
(1)显微鉴别壮腰补肾丸处方中熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪,以当归对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷、五味子甲素为对照品,薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归、红参、续断、黄芪和五味子成分;
(2)以川续断皂苷Ⅵ为对照品,高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中续断的含量;
所述的显微镜鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有熟地黄、山药、茯苓、五味子、菊花、黄芪的方法为:取本品,置显微镜下观察,薄壁组织灰棕色至黑棕色,细胞多皱缩,内含棕色核状物为熟地黄;淀粉粒三角状卵形或矩圆形,直径24~40μm,脐点短缝状或人字状为山药;不规则分枝状团块无色,遇水合氯醛试液溶化,菌丝无色或淡棕色,直径4~6μm为茯苓;种皮表皮石细胞淡黄色或淡黄棕色,表面观类多角形,壁较厚,孔沟细密,胞腔含暗棕色物为五味子;花粉粒类圆形,直径24~34μm,外壁有刺,长3~5μm,具3个萌发孔为菊花;纤维成束或散离,壁厚,表面有纵裂纹,两端断裂成帚状或较平截为黄芪;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有当归成分的方法为:取本品15g,研碎,加乙醚60ml,超声处理20分钟,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取当归对照药材0.5g,加乙醚20ml,同法制成对照药材溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述两种溶液各2~5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯9∶1为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯365nm下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的荧光主斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有红参成分的方法为:取本品7g,研碎,置索氏提取器中,加甲醇100ml,加热回流提取3小时,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣用水30ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次20ml,正丁醇液蒸干,残渣用水30ml溶解,滤过,滤液通过D101型大孔吸附树脂柱,其内径为1.5cm,柱高为12cm,先后用水50ml、40%乙醇30ml和70%乙醇50ml洗脱,收集70%乙醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品,分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述四种溶液各2~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有续断成分的方法为:取川续断皂苷Ⅵ对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取鉴别“红参”项下的供试品溶液10μl、川续断皂苷Ⅵ对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水13:7:2,10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有黄芪成分的方法为:取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取[鉴别]“红参”项下的供试品溶液10μl、黄芪甲苷对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
所述的薄层色谱法鉴别壮腰补肾丸处方中是否含有五味子成分的方法为:取本品15g,研碎,加环己烷50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取五味子甲素对照品,加环己烷制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,按照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液20μl、五味子甲素对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚60~90℃-乙酸乙酯8:1.5为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯254nm下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
所述的以川续断皂苷Ⅵ为对照品,高效液相色谱法检测壮腰补肾丸处方中续断的含量的方法为:
⑴色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.05%磷酸溶液30:70为流动相;检测波长为212nm;理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算应不低于4000;
⑵对照品溶液的制备:取川续断皂苷Ⅵ对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.30mg的溶液,即得;
⑶供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品,研细,取约5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100ml,密塞,称定重量,超声处理,功率500W,频率40KHz,40分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续断滤液50ml,蒸干,残渣加水50ml溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次30ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次30ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
⑷测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;本品每1g含续断以川续断皂苷Ⅵ(C47H76O18)计,不得少于0.60mg。
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