CN103381217B - 一种六味补血胶囊及其质量控制方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种六味补血胶囊及其质量控制方法与应用，以当归、川芎、黄芪、熟地黄、紫草、白芍为原料，加入等辅料制成六味补血胶囊；一种六味补血制剂的质量控制方法，采用薄层色谱法，鉴别六味补血胶囊中是否含有白芍、当归、黄芪、熟地黄、紫草、川芎及其成分；采用高效液相法，测定六味补血胶囊的体外溶出行为，以指纹图谱鉴别有效成分群；以毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷为对照品同时测定六味补血胶囊中含量；采用气相色谱法测定六味补血胶囊中挥发性成分藁本内酯的含量。方法操作简便，准确先进，线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均良好，能够有效的控制产品的质量，保证产品疗效。一种制备治疗眼损伤、视物模糊药物中的应用。
Description
发明领域
本发明涉及中药领域，特别涉及一种六味补血胶囊及其质量控制方法与应用。
背景技术
六味补血胶囊由当归、白芍、熟地黄、黄芪、紫草、川芎等药材组成，具有益气养血功能，用于气血两虚证，症状见于头晕眼花，神疲乏力，唇甲色淡。当归具有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠之功效，常用于血虚诸证、月经不调等；白芍具有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗之功效，常用于治疗胸腹疼痛、阴虚发热等；熟地黄具有补血滋润、益精填髓之功效，常用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、崩不止、肝肾阴亏、潮热盗汗、遗精阳痿等；黄芪具有补气生阳、生津养血之功效，常用于气虚乏力、血虚萎黄、便血崩漏等。
为克服现有中药胶囊剂内容物容易吸潮板结等不足，提供了一种全新的六味补血胶囊的制备方法，同时针对其开发了全面的质量控制方法，为了有效地控制本品的质量，正文用高效液相色谱法建立了本品的毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的高效液相色谱法的含量测定法。选用对照品、对照药材建立六味补血胶囊中各组分TLC薄层色谱法(TLC)，用气相色谱法测定挥发性成分藁本内酯的含量；液相色谱法检查药物的指纹图谱等。同时本发明公开了六味补血胶囊在治疗眼损伤、视物模糊药物中的应用。
发明内容
本发明目的在于：提供一种六味补血胶囊及其质量控制方法，本发明克服了现有胶囊剂的不足之处，显著提高了其工艺优越性、增加了防潮效果并提高其生物利用度，更加方便患者用药；而且制定了科学合理的质量控制标准，可有效保证制剂的稳定有效，为企业及社会带来良好的经济效益和社会效益。同时本发明公开了六味补血胶囊在治疗眼损伤、视物模糊药物中的应用。
本发明是这样构成的：它是用紫草680g、白芍560g、当归760g、熟地黄880g、川芎420g、黄芪350g、硬脂酸镁5g、预胶化淀粉48g、微晶纤维素33g、甘露醇10g、滑石粉19g、二氧化硅5g制备而成的。
具体的制备方法为：(1)称取紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，备用。
(2)将当归、川芎用6～8倍量的水在30～50℃下浸渍1小时，蒸馏提取挥发油4～6小时，收集挥发油提取液，蒸馏后的水溶液另器贮存，备用，残渣待用。
(3)将提取挥发油后的药渣与白芍、紫草、黄芪、熟地黄混合，加入10～12倍量水煎煮2次，每次2h，分次滤过，合并滤液及蒸馏后的水溶液并浓缩至相对密度1.10～1.15(45～55℃)的清膏，冷却至室温时搅拌并加入98％乙醇，使溶液含醇量达到70％～80％，静置1～3小时，离心，取上清液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.25～1.65(45～55℃)的稠膏，60℃下减压干燥至水分含量4％-6％，粉碎，过60目筛，备用。
(4)将β-环糊精制成饱和溶液，滴加提取的挥发油乙醇溶液(1→5m1)，在40～50℃下，搅拌0.5～1小时，2～4℃下冷藏14～20小时，过滤，并以少量蒸馏水洗涤滤饼，洗去部分未饱和的环糊精，将滤饼减压干燥至水分含量4％-6％，粉碎，过60目筛，备用。
(5)将二氧化硅、微晶纤维素、预胶化淀粉及甘露醇于60～90℃下混合2～4小时，冷却，过60目筛，备用。
(6)将滑石粉与(3)、(4)中物料混合20～30分钟，加入(5)中物料混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合5分钟，填充胶囊。
(7)将制得的胶囊用含聚丙烯酸酯0.3％～0.6％的异丙醇溶液包衣直至增重3％，即制得1000粒本发明六味补血胶囊。
本发明制剂的质量控制方法：主要包括检查，以及鉴别、含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括以当归对照药材、川芎对照药材、白芍对照药材、赤芍对照药材、芍药苷对照品、熟地黄对照药材、黄芪对照药材、黄芪甲苷对照品、紫草对照药材为对照的薄层鉴别：检查包括以毛蕊花糖苷为对照指标的体外溶出行为；液相色谱法测定指纹图谱；液相色谱法测定毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量；气相色谱法测定藁本内酯的含量。
具体的说，鉴别方法包括以下项目的部分或全部：
(1)取六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入乙醚30ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加入丙酮5ml使其溶解，作为供试品溶液。另取当归、川芎对照药材各1.8g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入乙醚10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加入丙酮2ml使其溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶乙酸＝7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
(2)取六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入乙醇30ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加入乙酸乙酯5ml使其溶解，作为供试品溶液；另取白芍、赤芍对照药材2.0g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入乙醇10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，加入乙酸乙酯2ml使其溶解，作为对照药材溶液；再取芍药苷对照品适量，加入乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材及对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1.5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与白芍对照药材及芍药苷对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，不得与赤芍对照药材色谱相应的位置上有相同的点。
(3)取六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入50％甲醇50ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加水5ml使其溶解，用水饱和正丁醇振摇提取5次，合并正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取熟地黄对照药材2.5g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入50％甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加入甲醇2ml使其溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝16∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，用0.5％的2，2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸渍，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
(4)取六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入甲醇30ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液加于中性的大孔树脂柱上，分别用50％、65％、85％甲醇各100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用氨水洗涤3次，每次10ml，弃去氨水液，正丁醇挥干，残渣加入甲醇1ml使其溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材1.5g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入甲醇30ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液加于中性的大孔树脂柱上，分别用50％、65％、85％甲醇各100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用氨水洗涤3次，每次10ml，弃去氨水液，正丁醇蒸干，残渣加入甲醇1ml使其溶解，作为对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品适量，加入甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材及对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝10∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
(5)取六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入石油醚(80℃)50ml，超声处理45分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取紫草对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液5μl，供试品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶5∶0.5∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点；再喷以15％氢氧化钾甲醇溶液，应显相同颜色的蓝色斑点。
检查以毛蕊花糖苷为指标的体外溶出行为，具体方法如下：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.35％乙酸溶液(25∶75)为流动相；紫外检测器；波长为270nm，流速为1ml/min，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，加水适量制成10μg/ml对照品溶液，即得；
供试品溶液的制备取本品，溶出度法(中国药典2010年版二部附录XC第一法)试验，以脱气处理后的水900ml为溶出介质，转速为每分100转，依法操作，在30分钟时，取溶液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液适量配制成供试品溶液，即得；
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各100μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
取本品按照上述方法测定，按外标法计算每粒的溶出量。按外标法计算每片的溶出量；限度为含量测定结果的80％，应符合规定。
检查指纹图谱的具体方法如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填充剂；以含0.15％的磷酸及70％的甲醇的水溶液为流动相A，以含0.15％的磷酸及10％的甲醇的水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml/min，检测波长为286nm。理论板数以参照物(川芎嗪)峰计算不低于5000，以参照物(阿魏酸)峰计算不低于3000，以参照物(丹皮酚)峰计算不低于1800，以参照物(芍药苷)峰计算不低于4000。
参照物溶液的制备取川芎嗪、阿魏酸、丹皮酚、芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品内容物适量，混匀，研细，取约0.45g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声处理(功率720W，频率50kHz)45分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按照本发明所提供指纹图谱的建立方法，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准图谱，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不得低于0.85
气相色谱仪测定藁本内酯含量的具体方法如下：
色谱条件与系统适用性试验氮气为载气源，流速为每分钟1.0ml；用经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球为固定相；进样口温度200℃，柱温为65℃，检测器温度250℃，平衡温度80℃，平衡时间1小时；FID检测器；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于2000。
对照品的制备取藁本内酯对照品适量，精密称定，加正庚烷制成每1ml含藁本内酯5μg的溶液，即得。
供试品的制备取本发明内容物约2.0g，精密称定，置顶空瓶中，精密加正庚烷20ml，密封，振摇使其溶解，在恒温(80℃)控制的加热室中加热平衡30分钟至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡。
测定法由进样器自动吸取1ml顶空气注入气相色谱仪中，测定，即得。
本品按干燥品计算，每粒含藁本内酯的总量不得低于0.2mg。
毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定具体方法如下：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.3％乙酸溶液(32：68)为流动相；紫外检测器；波长为270nm，流速为1ml/min，理论板数以毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算均不低于5000；
对照品溶液的制备分别取毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，用80％乙醇溶液溶解并稀释成每1ml中分别约含50μg和100μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取装量差异项下的六味补血胶囊，研细(全部过4号筛)，混匀，取适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇30ml，密塞，称重，浸泡，超声处理40分钟，放冷，称重，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每粒含毛蕊花糖苷的含量不得少于5.0mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量不得少于4.0mg。
本发明提供一种六味补血胶囊在治疗眼损伤、视物模糊药物中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过优化工艺，缩短了工艺流程，提高产品质量；通过薄层色谱法，实现了对当归、白芍、川芎、紫草、熟地黄、黄芪的鉴别；采用高效液色谱法对毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的准确测定；采用气相色谱仪对挥发性成分藁本内酯含量的准确测定；采用高效液相色谱仪对毛蕊花糖苷的体外溶出进行准确测定；采用高效液相色谱法做指纹图谱鉴别，方法操作简便，准确先进，线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均良好，能够有效的控制产品的质量，保证产品疗效。
附图说明
图1为六味补血胶囊内容物供试品的指纹图谱
图2为六味补血胶囊含量测定HPLC图
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不仅仅限于以下实施例。
具体的实施方式
实施例1
(1)称取紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地黄880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，备用。
(2)将当归、川芎用6倍量的水在30℃下浸渍1小时，蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油提取液，蒸馏后的水溶液另器贮存，备用，残渣待用；
(3)将提取挥发油后的药渣与白芍、紫草、黄芪、熟地黄混合，加入10倍量水煎煮2次，每次2h，分次滤过，合并滤液及蒸馏后的水溶液并浓缩至相对密度1.10(45℃)的清膏，冷却至室温时搅拌并加入98％乙醇，使溶液含醇量达到70％，静置3小时，离心，取上清液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.25(45℃)的稠膏，60℃下减压干燥至水分含量4％，粉碎，过60目筛，备用；
(4)将β-环糊精制成饱和溶液，滴加提取的挥发油乙醇溶液(1→5m1)，在50℃下，搅拌0.5小时，2℃下冷藏20小时，过滤，并以少量蒸馏水洗涤滤饼，洗去部分未饱和的环糊精，将滤饼减压干燥至水分含量6％，粉碎，过60目筛，备用；
(5)将二氧化硅、微晶纤维素、预胶化淀粉及甘露醇于60℃下混合4小时，冷却，过60目筛，备用；
(6)将滑石粉与(3)、(4)中物料混合30分钟，加入(5)中物料混合10分钟，再加入硬脂酸镁混合5分钟，填充胶囊；
(7)将制得的胶囊用含聚丙烯酸酯0.3％的异丙醇溶液包衣直至增重3％，即制得1000粒本发明六味补血胶囊。
实施例2
(1)称取紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地黄880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，备用。
(2)将当归、川芎用7倍量的水在40℃下浸渍1小时，蒸馏提取挥发油5小时，收集挥发油提取液，蒸馏后的水溶液另器贮存，备用，残渣待用；
(3)将提取挥发油后的药渣与白芍、紫草、黄芪、熟地黄混合，加入11倍量水煎煮2次，每次2h，分次滤过，合并滤液及蒸馏后的水溶液并浓缩至相对密度1.12(50℃)的清膏，冷却至室温时搅拌并加入98％乙醇，使溶液含醇量达到75％，静置2小时，离心，取上清液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.48(49℃)的稠膏，60℃下减压干燥至水分含量5％，粉碎，过60目筛，备用；
(4)将β-环糊精制成饱和溶液，滴加提取的挥发油乙醇溶液(1→5m1)，在45℃下，搅拌1小时，3℃下冷藏17小时，过滤，并以少量蒸馏水洗涤滤饼，洗去部分未饱和的环糊精，将滤饼减压干燥至水分含量5％，粉碎，过60目筛，备用；
(5)将二氧化硅、微晶纤维素、预胶化淀粉及甘露醇于75℃下混合3小时，冷却，过60目筛，备用；
(6)将滑石粉与(3)、(4)中物料混合25分钟，加入(5)中物料混合15分钟，再加入硬脂酸镁混合5分钟，填充胶囊；
(7)将制得的胶囊用含聚丙烯酸酯0.5％的异丙醇溶液包衣直至增重3％，即制得1000粒本发明六味补血胶囊。
实施例3
(1)称取紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地黄880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，备用。
(2)将当归、川芎用8倍量的水在50℃下浸渍1小时，蒸馏提取挥发油4小时，收集挥发油提取液，蒸馏后的水溶液另器贮存，备用，残渣待用；
(3)将提取挥发油后的药渣与白芍、紫草、黄芪、熟地黄混合，加入12倍量水煎煮2次，每次2h，分次滤过，合并滤液及蒸馏后的水溶液并浓缩至相对密度1.15(55℃)的清膏，冷却至室温时搅拌并加入98％乙醇，使溶液含醇量达到80％，静置1小时，离心，取上清液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.65(55℃)的稠膏，60℃下减压干燥至水分含量6％，粉碎，过60目筛，备用；
(4)将β-环糊精制成饱和溶液，滴加提取的挥发油乙醇溶液(1→5m1)，在40℃下，搅拌1小时，4℃下冷藏14小时，过滤，并以少量蒸馏水洗涤滤饼，洗去部分未饱和的环糊精，将滤饼减压干燥至水分含量4％，粉碎，过60目筛，备用；
(5)将二氧化硅、微晶纤维素、预胶化淀粉及甘露醇于90℃下混合2小时，冷却，过60目筛，备用；
(6)将滑石粉与(3)、(4)中物料混合20分钟，加入(5)中物料混合10分钟，再加入硬脂酸镁混合5分钟，填充胶囊；
(7)将制得的胶囊用含聚丙烯酸酯0.3％的异丙醇溶液包衣直至增重3％，即制得1000粒本发明六味补血胶囊。
实施例4
鉴别
(1)取上述实施例3六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入乙醚30ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加入丙酮5ml使其溶解，作为供试品溶液。另取当归、川芎对照药材各1.8g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入乙醚10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加入丙酮2ml使其溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶乙酸＝7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取上述实施例3六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入乙醇30ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加入乙酸乙酯5ml使其溶解，作为供试品溶液；另取白芍、赤芍对照药材2.0g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入乙醇10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，加入乙酸乙酯2ml使其溶解，作为对照药材溶液；再取芍药苷对照品10.02mg，置于10ml的容量瓶中，加入乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材及对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1.5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与白芍对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，与赤芍对照药材色谱相应的位置上没有相同的点。
(3)取上述实施例3六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入50％甲醇50ml，超声处理1小时，滤过，滤液挥干，加水5ml使其溶解，用水饱和正丁醇振摇提取5次，合并正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取熟地黄对照药材2.5g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入50％甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加入甲醇2ml使其溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝16∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，用0.5％的2，2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸渍，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取上述实施例3六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入甲醇30ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液加于中性的大孔树脂柱上，分别用50％、65％、85％甲醇各100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用氨水洗涤3次，每次10ml，弃去氨水液，正丁醇挥干，残渣加入甲醇1ml使其溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材1.5g，剪碎，用粉碎机将其捣碎，加入甲醇30ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液加于中性的大孔树脂柱上，分别用50％、65％、85％甲醇各100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水50ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用氨水洗涤3次，每次10ml，弃去氨水液，正丁醇蒸干，残渣加入甲醇1ml使其溶解，作为对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品10.03mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材及对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝10∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(5)取上述实施例3六味补血胶囊10粒，将其内容物研细，加入石油醚(80℃)50ml，超声处理45分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取紫草对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液5μl，供试品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶5∶0.5∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点；再喷以15％氢氧化钾甲醇溶液，显相同颜色的蓝色斑点。
溶出度测定
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.35％乙酸溶液(25∶75)为流动相；紫外检测器；波长为270nm，流速为1ml/min，理论板数以毛蕊花糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备精密称取毛蕊花糖苷对照品20.36mg，置于100ml的容量瓶，加水溶解，取1ml置于20ml的容量瓶内加水稀释至刻度即得；
供试品溶液的制备取本品，照溶出度法(中国药典2010年版二部附录XC第一法)试验，以脱气处理后的水900ml为溶出介质，转速为每分100转，依法操作，在30分钟时，取溶液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液适量配制成供试品溶液，即得；
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各100μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
取本品按照上述方法测定，计算每粒的溶出量。测定结果见下表
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD(％) |
| 溶出量(％) | 86.4 | 85.2 | 84.8 | 85.2 | 86.1 | 85.6 | 85.55 | 0.71 |
指纹图谱
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填充剂；以含0.15％的磷酸及70％的甲醇的水溶液为流动相A，以含0.15％的磷酸及10％的甲醇的水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml/min，检测波长为286nm。理论板数以参照物(川芎嗪)峰计算不低于5000，以参照物(阿魏酸)峰计算不低于3000，以参照物(丹皮酚)峰计算不低于1800，以参照物(芍药苷)峰计算不低于4000。
参照物溶液的制备精密称定，取川芎嗪对照品10.23mg、阿魏酸对照品10.08mg、丹皮酚对照品10.21mg、芍药苷对照品10.06mg置于20ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，溶解，取稀释液1ml至20ml的容量瓶用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取实施例3的内容物适量，精密称定2.0016g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100ml，超声处理(功率720W，频率50kHz)45分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
按照本发明所提供指纹图谱的建立方法，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准图谱。所得六味补血制剂的标准指纹图谱中有10个特征共有峰，其中2号色谱峰为芍药苷参照峰，3号色谱峰为阿魏酸参照峰，5号色谱峰为丹皮酚参照峰，8号色谱峰为川芎嗪参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为60min，具体如下：
1号峰，平均保留时间RT为13.260min，RSD为1.11％，峰面积为1832471，RSD为20.11％；
2号峰，平均保留时间RT为16.150min，RSD为1.32％，峰面积为1365234，RSD为2.30％；
3号峰，平均保留时间RT为17.562min，RSD为0.81％，峰面积为1456314，RSD为0.69％；
4号峰，平均保留时间RT为18.527min，RSD为0.45％，峰面积为3536421，RSD为23.45％；
5号峰，平均保留时间RT为19.188min，RSD为0.21％，峰面积为1632456，RSD为21.56％；
6号峰，平均保留时间RT为20.153min，RSD为0.36％，峰面积为3642571，RSD为16.54％；
7号峰，平均保留时间RT为25.203min，RSD为0.86％，峰面积为6186471，RSD为27.51％；
8号峰，平均保留时间RT为28.457min，RSD为0.34％，峰面积为1231586，RSD为28.64％；
9号峰，平均保留时间RT为30.290min，RSD为0.16％，峰面积为1826543，RSD为22.46％；
10号峰，平均保留时间RT为42.697min，RSD为0.63％，峰面积为1798427，RSD为25.14％：
11号峰，平均保留时间RT为43.463min，RSD为0.67％，峰面积为5052354，RSD为25.14％；
12号峰，平均保留时间RT为50.840min，RSD为0.53％，峰面积为1756427，RSD为25.14％；
藁本内酯的含量测定
色谱条件与系统适用性试验氮气为载气源，流速为每分钟1.0ml；用经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球为固定相；进样口温度200℃，柱温为65℃，检测器温度250℃，平衡温度80℃，平衡时间1小时；FID检测器；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于2000。
对照品的制备取藁本内酯对照品5.01mg，精密称定，置于10ml的容量瓶中，加正庚烷稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品的制备取实施例3的内容物2.0010g，精密称定，置顶空瓶中，精密加正庚烷20ml，密封，振摇使其溶解，在恒温(80℃)控制的加热室中加热平衡30分钟至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡。
测定法由进样器自动吸取20μl顶空气注入气相色谱仪中，测定，即得。
本品按干燥品计算，每粒含藁本内酯的含量为0.23mg。
毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.3％乙酸溶液(32∶68)为流动相；紫外检测器；波长为270nm，流速为1ml/min，理论板数以毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备精密称定，取毛蕊花糖苷对照品10.16mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品20.12mg置于200ml的容量瓶中，加入80％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取上述实施例3的装量差异项下六味补血胶囊，研细(全部过4号筛)，混匀，精密称定，取2.0046g置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇100ml，密塞，称重，浸泡，超声处理40分钟，放冷，称重，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，毛蕊花糖苷的含量为5.31mg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量为4.78mg。毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法验证
对照品溶液的制备精密称定，取毛蕊花糖苷对照品10.24mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品20.16mg置于200ml的容量瓶中，加入80％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
线性关系试验：分别精密量取对照品溶液2、4、6、8、10、12μl，依次进样。在上述色谱条件下测定毛蕊花糖苷对照品和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品峰面积。以毛蕊花糖苷进样量C(μg)为横坐标，以峰面积积分A为纵坐标进行线性回归分析，得到毛蕊花糖苷回归方程为：A＝39248C-3742.9，r＝0.9994(n＝5)，试验结果表明，毛蕊花糖苷对照品浓度在19.01μg～114.07μg范围内与吸收度峰面积值呈良好的线性关系，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量C(μg)为横坐标，以峰面积积分A为纵坐标进行线性回归分析，得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程为：A＝15425C-3976.5，r＝0.9998(n＝5)，试验结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品浓度在14.82μg～88.89μg范围内与吸收度峰面积值呈良好的线性关系。
表1毛蕊花糖苷线性关系考察
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 进样体积(μl) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| 进样量(μg) | 19.01 | 38.02 | 57.04 | 76.05 | 95.06 | 114.07 |
| 峰面积 | 746182.98 | 1488583.80 | 2234766.78 | 2980910.51 | 3727093.48 | 4473237.21 |
表2毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系考察
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 进样体积(μl) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| 进样量(μg) | 14.82 | 29.63 | 44.45 | 59.26 | 74.08 | 88.89 |
| 峰面积 | 228598.5 | 453066.25 | 681664.75 | 910109 | 1138707.5 | 1367151.75 |
精密度试验：精密量取毛蕊花糖苷对照品溶液(10μl)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(10μl)，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录色谱，结果见表，毛蕊花糖苷的RSD＝0.16％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的RSD＝0.29％，说明有良好的精密度。
表3毛蕊花糖苷精密度试验
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 3732123 | 3729001.5 | 3718145.8 | 3719985.3 | 3724856 | 3724822.32 | 0.16 |
表4毛蕊异黄酮葡萄糖苷精密度试验
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1140456.6 | 1135425 | 1134841.5 | 1139149.2 | 1142654.5 | 1138505.36 | 0.29 |
稳定性试验：取六味补血胶囊内容物约2g，精密称定，按供试品溶液的制备方法进行制备，分别在0、2、4、6、8、12、72按上述色谱条件测定，记录色谱，结果见表，毛蕊花糖苷在72小时内峰面积平均为3731933.5，RSD＝0.10％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在72小时内峰面积平均为1132501.2，RSD＝0.41％，表明供试品溶液72小时内稳定性较好。
表5毛蕊花糖苷稳定性试验
| 时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 72 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 3737022 | 3735092 | 3734056 | 3732133 | 3730412 | 3728856 | 3725961 | 3731933 | 0.10 |
表6毛蕊异黄酮葡萄糖苷稳定性试验
| 时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 72 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1138102 | 1136845 | 1135189 | 1132948 | 1130578 | 1128412 | 1125432 | 1132501 | 0.41 |
重复性试验：取同一批六味补血胶囊按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，计算，结果见表，毛蕊花糖苷含量平均值为1.31mg/粒，RSD＝2.61％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量平均值为1.14mg/粒，RSD＝0.39％，表明方法重复性较好。
表7毛蕊花糖苷重复性试验
表8毛蕊异黄酮葡萄糖苷重复性试验
加样回收率试验：称取5份六味补血胶囊2.0g，精密称定，分别精密加入对照品5mg，按照供试品溶液制备方法制备，按上述测定方法测定，记录色谱图，计算，结果见表，毛蕊花糖苷平均回收率99.88％，RSD为0.19％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均回收率88.86％，RSD为0.27％，表明方法回收率好。
表9毛蕊花糖苷回收率试验
表10毛蕊异黄酮葡萄糖苷回收率试验
藁本内酯含量测定方法验证
对照品溶液的制备精密称定，取藁本内酯对照品5.24mg，置于10ml的容量瓶中，加正庚烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
线性关系试验：分别精密量取对照品溶液2、4、6、8、10、12μl，依次进样。在上述色谱条件下测定藁本内酯对照品峰面积。以藁本内酯进样量C(μg)为横坐标，以峰面积积分A为纵坐标进行线性回归分析，得到藁本内酯回归方程为：A＝2540C-2790，r＝0.9998(n＝5)，试验结果表明，藁本内酯对照品浓度在10.20μg～61.20μg范围内与吸收度峰面积值呈良好的线性关系。
表11藁本内酯线性关系考察
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 进样体积(μl) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
| 进样量(μg) | 10.20 | 20.40 | 30.60 | 40.80 | 51.00 | 61.20 |
| 峰面积 | 25908 | 49026 | 74934 | 100842 | 126750 | 152658 |
精密度试验：精密量取藁本内酯对照品溶液(10μl)、在上述色谱条件下，重复进样5次，记录色谱，结果见表，藁本内酯的RSD＝0.41％，说明有良好的精密度。
表12藁本内酯精密度试验
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 126550 | 125430 | 126612 | 126400 | 126721 | 126342.6 | 0.41 |
稳定性试验：取六味补血胶囊约2g，精密称定，按供试品溶液的制备方法进行制备，分别在0、2、4、6、8、12、72h按上述色谱条件测定，记录色谱，结果见表，藁本内酯在72小时内峰面积平均为125121.8，RSD＝0.82％，表明供试品溶液72小时内稳定性较好。
表13藁本内酯稳定性试验
| 时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 72 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 126865 | 126432 | 126001 | 125120 | 124320 | 123890 | 123225 | 125121 | 0.82 |
重复性试验：取同一批六味补血胶囊按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，计算，结果见表，藁本内酯含量平均值为0.21mg/粒，RSD＝2.61％，表明方法重复性较好。
表14藁本内酯重复性试验
加样回收率试验：称取5份六味补血胶囊内容物2.0g，精密称定，分别精密加入对照品2mg，按照供试品溶液制备方法制备，按上述测定方法测定，记录色谱图，计算，结果见表，藁本内酯平均回收率99.5％，RSD为0.58％，表明方法回收率好。
表15藁本内酯回收率试验
理药效试验具体如下：
实施例1益气补血药效试验
实验原理：本实验采用小鼠皮下注射APH(乙酰苯肼)以及腹腔注射CY(环磷酰胺)让小鼠产生各种类型的贫血及骨髓造血障碍，出现红细胞、粒细胞、血小板或全血细胞减少，然后观察受试药物对各种血液成分及骨髓造血功能的影响。
受试药物制备：取一定量的六味补血胶囊的内容物，将其制成60g/100ml的溶液，备用。
对比样品：取驴叫补血颗粒适量，按照常规方法制备，制成60g/100ml的溶液(以生药材计)，备用。
四物汤剂：取熟地120g，当归90g，白芍90g，川芎60g，加10倍量水煎煮2小时，滤过，滤渣加8倍量水煎煮2小时，滤过，合并滤液，浓缩至60g/100ml的溶液(以生药材计)，备用。
生理盐水：500ml。
实验设计：实验动物小白鼠60只，年龄6-8星期，雌雄各半，随机分为5组，每组12只。其中第1组为对比样品组，第2组为四物汤剂制剂组，第3组为本发明中药组合物胶囊剂组，第4组为模型组、第5组为空白对照组。第1、2、3各给药组均用灌胃给药0.6ml/只。空白对照与模型组给予等容积煮沸消毒的自来水。模型组及各给药组小鼠分别于第2天和第5天皮下注射APH(乙酰苯肼)20mg/kg、40mg/kg，从第5天开始连续4天腹腔注射CY(环磷酰胺)40mg/kg，空白对照组小鼠同时注射等容量的生理盐水。各组于第1、4、7天给药前称重，末次给药后1.5h眼底静脉丛采血测血常规。结果如表16所示
表16各组血常规检验结果(x+s)
| 组别 | HGB/g·L-1 | RBC/1012·L-1 | HCT |
| 空白对照组 | 136.5±7.2 | 8.16±0.59 | 0.47±0.02 |
| 模型组(生理盐水) | 100.5±7.7△△ | 4.31±0.65△△ | 0.27±0.02△△ |
| 对比样品组 | 115.8±5.2** | 5.68±0.13** | 0.26±0.04** |
| 四物汤剂组 | 123.4±5.7** | 5.22±0.54* | 0.30±0.02* |
| 本发明实施组 | 131.6±6.8** | 6.54±0.39** | 0.45±0.02** |
△△P＜0.01vs空白对照组，*p＜0.01，**P＜0.05Vs模型组
动物于造模后，开始出现不同程度的懒动、毛色干枯、少食。尾、耳、眼苍白，体重增长缓慢。模型组最为明显。给药汤剂、胶囊剂组小鼠行动敏捷，毛色正常，眼、耳、尾呈粉红色，与正常组无明显差别。结果表明，综合各指标，本发明实施例中药组合物在RBC(红细胞)、HCT(红细胞压积)均显著高于对比样品与四物汤剂，且本发明实施例中药组合物HGB(血红蛋白)/g·L-1与空白对照组无差别，说明本发明实施例中药组合物药理效果最为明显。
实施例2治疗眼损伤药效试验
试验原理：采用透射电镜观察电击小白鼠及小白鼠服用本发明药物和相关治疗眼损伤的药物后眼损伤的超微形态学改变
受试药物制备：取本发明药物的内容物适量，经过相关的工艺制备成25.00g.kg-1.d-1的溶液，备用。
试剂：电镜固定液3.0％戊二醛、生理盐水
试验分组：试验把动物分成电击组和非电击组，试验小白鼠，雄性，随机，180～200g，电击组分为服用本发明药物组、对照组、珠红滴眼液对照组。每组10例。
试验方法：将电击组小白鼠四肢固定，使其俯卧于木板上；确定220V，50Hz交流电的火线固定接触额部，地线接触右下肢，接通电源后将小白鼠电击但不要致死。按照电击组的分组将本发明药物组每天给小白鼠静脉注射本发明药物三次，每次10ml；对照组每天给小白鼠静脉注射生理盐水三次，每次10ml，珠红滴眼液对照组每天给小白鼠的眼睛滴珠红眼液三次；非电击组就以正常的生活习性养殖。照上述的要求，将所有的小白鼠养殖30天后，将其断颈处死，死后15min分别取各组小白鼠的眼球，用3.0％戊二醛于2℃固定24h后，酸固定1h，65％～75％的梯度酒精，丙酮顺序脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，电镜观察细胞膜与细胞器、细胞质以及间质中纤维，血管内皮细胞超微结构改变，并加以摄片保存。
从上述的观察结果表明，在注射本发明药物后被电击的小白鼠的眼损伤有明显的药效作用。通过上述的试验表明，当电流通过人体途径经过眼睛时，可造成眼球全层的电流损伤。其中以角膜、视网膜改变最为突出，但是通过服用相关的药物，对小白鼠的眼损伤药效作用明显，可以看出本发明药物对治疗眼部电击损伤有着很好的治疗效果。
Claims (2)
1.一种六味补血胶囊，由如下组分制成：紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地黄880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，其特征在于制备方法包含以下步骤：
(1)称取紫草680g，白芍560g，当归760g，熟地黄880g，川芎420g，黄芪350g，硬脂酸镁5g，预胶化淀粉48g，微晶纤维素33g，甘露醇10g，滑石粉19g，二氧化硅5g，备用；
(2)将当归、川芎用6～8倍量的水在30～50℃下浸渍1小时，蒸馏提取挥发油4～6小时，收集挥发油提取液，蒸馏后的水溶液另器贮存，备用，残渣待用；
(3)将提取挥发油后的药渣与白芍、紫草、黄芪、熟地黄混合，加入10～12倍量水煎煮2次，每次2h，分次滤过，合并滤液及蒸馏后的水溶液并浓缩至相对密度1.10～1.15且温度控制为45～55℃的清膏，冷却至室温时搅拌并加入98％乙醇，使溶液含醇量达到70％～80％，静置1～3小时，离心，取上清液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.25～1.65且温度控制为45～55℃的稠膏，60℃下减压干燥至水分含量4％-6％，粉碎，过60目筛，备用；
(4)将β-环糊精制成饱和溶液，滴加提取的挥发油乙醇溶液(1→5mL)，在40～50℃下，搅拌0.5～1小时，2～4℃下冷藏14～20小时，过滤，并以少量蒸馏水洗涤滤饼，洗去部分未包合的环糊精，将滤饼减压干燥至水分含量4％-6％，粉碎，过60目筛，备用；
(5)将二氧化硅、微晶纤维素、预胶化淀粉及甘露醇于60～90℃下混合2～4小时，冷却，过60目筛，备用；
(6)将滑石粉与(3)、(4)中物料混合20～30分钟，加入(5)中物料混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合5分钟，填充胶囊；
(7)将制得的胶囊用含聚丙烯酸酯0.3％～0.6％的异丙醇溶液包衣直至增重3％，即制得1000粒六味补血胶囊。
2.一种治疗眼损伤药物，其特征在于，该药物为权利要求1所述的六味补血胶囊。
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