CN110716002A - 十味参归灌肠液的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种十味参归灌肠液的质量控制方法，采用薄层色谱法对制剂中的延胡索、丹参、桃仁、赤芍进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对制剂中丹酚酸B进行含量测定。该法通过对处方中的君药或臣药所含成分或主要成分进行定性定量分析，初步建立了本品的质量控制标准。研究表明，应用本发明对处方中延胡索、丹参、桃仁、赤芍四味药材进行定性鉴别，色谱图中斑点分离清晰、集中；高效液相色谱法中，丹酚酸B对照品进样量在54.55～545.5μg范围内时，与峰面积呈良好的线性关系，丹酚酸B回收率为102.77％，RSD＝1.01％。综上，本发明可有效控制中药制剂“十味参归灌肠液”的质量，确保病人用药安全、保证药物稳定有效。

Description

十味参归灌肠液的质量控制方法

技术领域

本发明属于中药质量控制技术领域，尤其涉及一种十味参归灌肠液的质量控制方法。

背景技术

十味参归灌肠液是在南宁市妇幼保健院临床十多年中药经验方的基础上，采用现代制剂技术研制而成的中成药制剂。该产品处方由丹参、延胡索、桃仁、赤芍等十味中药组成具清热解毒、活血祛瘀、行气止痛、软坚散结等功效，适用于临床常见瘀毒内结型、湿热蕴结型、湿热瘀结型、气滞血瘀型急慢性盆腔炎，疗效确切。然而，由于十味参归灌肠液为新研发的制剂品种，尚未建立完善的定性定量检验方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种科学合理、操作简单的十味参归灌肠液的质量控制方法，以便于有效控制中药制剂“十味参归灌肠液”的质量，确保用药安全稳定。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

十味参归灌肠液的质量控制方法，采用薄层色谱法(TCL)对制剂中的延胡索、丹参、桃仁、赤芍进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对制剂中丹酚酸B进行含量测定。

上述十味参归灌肠液的质量控制方法，包括延胡索的薄层鉴别、丹参的薄层鉴别和桃仁及赤芍的薄层鉴别，以及丹酚酸B的含量测定。

延胡索的薄层鉴别按以下进行操作：

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液30ml，加浓氨试液调至碱性(pH为9.6～9.8)，加乙醚萃取3次，每次20ml，合并乙醚层，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1g，加甲醇50ml超声处理30分钟，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；

对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

延胡索的阴性对照品溶液的制备：取缺延胡索的阴性制剂(处方去除延胡索，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)20ml，照供试品溶液的制备方法制得相应的延胡索阴性对照品溶液；

鉴别方法：吸取十味参归灌肠液供试品溶液和阴性对照品溶液各3～6μl、对照药材溶液和对照品溶液各2～3μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比9∶2的甲苯－丙酮混合液为展开剂展开，取出晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。

丹参的薄层鉴别按以下进行操作：

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，加乙醚10ml萃取2次，弃去乙醚液，下层水液加乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品，加无水乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；

丹参的阴性对照品溶液的制备：取缺丹参的阴性制剂(处方除去丹参，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)10ml，照供试品溶液的制备方法制成缺丹参的阴性对照品溶液；

鉴别方法：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5～6μl，点于同一硅胶F254薄层板上，以体积比2∶3∶4∶0.5∶2的甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸混合液为展开剂展开，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

桃仁及赤芍的薄层鉴别按以下进行操作：

桃仁的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液；

对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；

桃仁的阴性对照品溶液的制备：取桃仁的阴性制剂(处方除去桃仁，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)10ml，照供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液；

鉴别方法：取供试品溶液、苦杏仁苷对照品溶液及阴性对照品溶液各2μl，在硅胶G－CMCNa板薄层板上，以体积比15∶40∶22∶10的氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水混合液为展开剂，喷以磷钼酸硫酸溶液显色，在日光下检测；

赤芍的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液；；

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

鉴别方法：取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于硅胶G－CMCNa板薄层板上；以体积比15∶40∶22∶10的氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水混合液为展开剂展开，以磷钼酸硫酸溶液显色。

丹酚酸B的含量测定按以下进行操作：

色谱条件

色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以体积比为27：8：2：63的甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；流速：1.0ml/min；检测波长286nm；柱温：25～35℃；进样量：10μ1；

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成丹酚酸B含量约为0.2mg/ml的溶液作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密量取十味参归灌肠液2ml，置5ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

针对院内制剂十味参归灌肠液质检体系缺失的问题，发明人建立了一种十味参归灌肠液的质量控制方法，采用薄层色谱法(TCL)对制剂中的延胡索、丹参、桃仁、赤芍进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对制剂中丹酚酸B进行含量测定。该法通过对处方中的君药或臣药所含成分或主要成分进行定性定量分析，初步建立了本品的质量控制标准。研究表明，应用本发明对处方中延胡索、丹参、桃仁、赤芍四味药材进行定性鉴别，色谱图中斑点分离清晰、集中；高效液相色谱法中，丹酚酸B对照品进样量在54.55～545.5μg范围内时，与峰面积呈良好的线性关系，丹酚酸B回收率为102.77％，RSD＝1.01％。综上，本发明方法可有效控制中药制剂“十味参归灌肠液”的质量，确保病人用药安全、保证药物稳定有效。

附图说明

图1是十味参归灌肠液中延胡索的薄层鉴别色谱图(365nm)，图中：1、延胡索阴性对照品溶液，2、样品130702，3、样品130704，4、样品130708 5、样品131104，6、样品131106，7、样品131111，8、延胡索对照药材，a.b.c.d.为特征荧光斑点(a.黄绿色，b.c.d.均为绿色)，9、延胡索乙素对照品，d、特征荧光斑点(绿色)。

图2是十味参归灌肠液中丹参的薄层鉴别色谱图(254nm)，图中：1、丹参的阴性对照品溶液，2、样品130702，3、样品130704，4、样品130708，5、样品131104，6、样品131106，7、样品131111，8、丹酚酸B对照品，a丹酚酸B对照品特征斑点。

图3是十味参归灌肠液中桃仁、赤芍的薄层鉴别色谱图，图中：1、赤芍阴性对照品溶液，2、桃仁阴性对照品液，3、样品130702，4、样品130704，5、样品130708，6、样品131104，7、样品131106，8、样品131111，9、苦杏仁苷和芍药苷对照品，a芍药苷对照品特征斑点(蓝黑色)，b苦杏仁苷对照品特征斑点。(蓝黑色)

图4是十味参归灌肠液中丹酚酸B含量测定系统适应性试验色谱图，图中：A丹酚酸B对照品，B十味参归灌肠液，C丹参阴性制剂。

具体实施方式

1仪器和材料

1.1仪器

LC-20A高效液相色谱仪(岛津公司)；YOKO-ZS紫外分析摄影仪(武汉药新技术开发有限公司)；XS205DuaLRange型电子分析天平(瑞士特勒公司)；SB3200DTS双频超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EASYPUREⅡ超纯水器(美国热电公司)；HP250HS型恒温恒湿箱(武汉瑞华仪器设备有限责任公司)。

1.2材料

延胡索乙素对照品(批号：110726-201112)、胡索对照药材(批号：120928-201007)、苦杏仁苷对照品(批号：110820-201004)、芍药苷对照品(批号：110736-201136)均由中国食品药品检定研究院提供；丹酚酸B对照品(批号：ES-AS-0260)由上海亿欣生物科技有限公司提供。

硅胶F254薄层板、硅胶G、硅胶H由青岛海洋化工分厂提供；硅胶G加0.1％氢氧化钠和硅胶G加0.1％羧甲基纤维素钠的薄层板为自制板，使用青岛海洋化工有限公司的薄层层析硅胶制备。HPLC测定用甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

十味参归灌肠液制剂共9批，批号为：130702、130704、130708、131104、131106、131111、140401、140403、140405，由南宁市妇幼保健院委托广西中医药大学附属瑞康医院制备。阴性对照样品由广西民族医药研究院制备。其中，十味参归灌肠液制剂处方及制法如下：

处方组成

丹参50g、当归75g、延胡索50g、车前草75g、桃仁75g、鱼腥草75g、刘寄奴50g、蒲公英75g、赤芍50g、败酱草75g；共制成灌肠液1000ml

制法

以上十味，丹参、延胡索用70％乙醇回流提取2次(第一次70％乙醇加入量为药材量的6倍、第二次为5倍)，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，备用；余下8味药材加水煎煮2次(第一次加水量为药材量的13倍量，第二次加水量为药材量的10倍量)，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，浓缩至550ml，相对密度为1.10～1.20(80℃)，静置，放冷，加入2倍量乙醇1100ml，搅匀，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏。合并以上所得两种清膏，加水调整总量至1000ml，搅匀，分装为每瓶100ml，热压灭菌，即得。

阴性制剂制法基本同上，仅不加相应药材。

2结果与分析

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1延胡索的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取本品30ml，加浓氨试液调至碱性(pH为9.6～9.8)，加乙醚萃取3次，每次20ml，合并乙醚层，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1g，加甲醇50ml超声处理30分钟，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

延胡索的阴性对照品溶液的制备：取缺延胡索的阴性制剂(处方去除延胡索，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)20ml，同法制得相应的延胡索阴性对照品溶液。

鉴别方法：吸取本品6批供试品溶液(130702、130604、130608、131104、131106、131111)和阴性对照品溶液各3～6μl、对照药材溶液和对照品溶液各2～3μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮(9∶2)为展开剂展开，取出晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。

结果：如图1所示，6批供试品样品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。阴性对照溶液色谱则无此斑点。说明本法专属性强、无阴性干扰。

2.1.2丹参的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取本品10ml，加乙醚10ml萃取2次，弃去乙醚液，下层水液加乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品，加无水乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

丹参的阴性对照品溶液的制备：取缺丹参的阴性制剂(处方除去丹参，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)10ml，同法制成缺丹参的阴性对照品溶液。

鉴别方法：吸取6批供试品溶液(130702、130704、130708、131104、131106、131111)、阴性对照品溶液、对照品溶液各5～6μl，点于同一硅胶F254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂展开，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

结果：如图2所示，6批供试品溶液色谱中，在与对照品相对应的位置上，均显相同的暗斑；阴性对照溶液色谱则无此斑点。说明本法重现性好、专属性强，无阴性干扰。

2.1.3桃仁的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取本品10ml，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液。

对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

桃仁的阴性对照品溶液的制备：取桃仁的阴性制剂(处方除去桃仁，其余各味按一日处方量投料，按处方制法共制成100ml)10ml，同法制备阴性对照品溶液。

鉴别方法：取6批供试品溶液(130702、130704、130708、131104、131106、131111)、苦杏仁苷对照品溶液及阴性对照品溶液各2μl，在硅胶G－CMCNa薄层板上，以氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)为展开剂，喷以磷钼酸硫酸溶液显色，在日光下检测。

结果：如图3所示，6批供试液色谱图中，在与苦杏仁苷对照品溶液相对应的位置上，显相同的蓝黑色斑点，且特征斑点Rf值适中，斑点分离清晰、集中，层析效果较理想。2.1.4赤芍的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取本品10ml，采用石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液。

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

鉴别方法：取6批供试品溶液(130702、130604、130608、131104、131106、131111)、对照品溶液各5μl，分别点于硅胶G－CMCNa板薄层板上；以氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)为展开；以磷钼酸硫酸溶液显色。

结果：如图3所示，6批供试品色谱中，在与对照品相应的位置上有分离较好、清晰且集中的蓝黑色斑点，且阴性无干扰。说明本法重现性好、专属性强，无阴性干扰，且可与桃仁同时鉴别。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件

色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(27：8：2：63)；流速：1.0ml/min；检测波长286nm；柱温：25～35℃；进样量：10μ1。如图4所示，在上述色谱条件下，理论板数以丹酚酸B峰计不低于3000，分离度>1.5，各成分基线分离良好。

2.2.2对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成丹酚酸B含量约为0.2mg/ml的溶液作为对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备

精密量取十味参归灌肠液2ml，置5ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4阴性样品溶液的制备

取缺丹参的阴性制剂2ml加甲醇稀释到5ml，作为供试品溶液。

2.2.5专属性及系统适应性试验

分别取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10μ1，测定。

结果：如图4所示，供试品溶液的色谱图中有与丹酚酸B保留时间相同的吸收峰，阴性样品溶液的色谱图则无此吸收峰。说明用本方法测定丹酚酸B含量无阴性溶剂干扰，专属性强。理论板数不低于3000。

2.2.6线性关系考察

称取丹酚酸B对照品10.91mg，置10ml量瓶中，加75％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。分别吸取以上对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml置5ml量瓶中，分别加入75％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液各10μl，测定丹酚酸B含量，以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

结果：当丹酚酸B对照品进样量在54.55～545.5μg范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝11321X-274412，r＝0.9996。

2.2.7精密度试验

取同一份供试品溶液(批号131111)，连续测定6次。

结果：6次测定的丹酚酸B峰面积分别为1931820、1902552、1957857、1956873、1948326、1965612，RSD＝1.20％(n＝6)表明本法的精密度良好。

2.2.8稳定性试验

取同一供试品溶液(批号131111)2ml，加甲醇稀释至5ml，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样检测。

结果：7次测定的丹酚酸B峰面积分别为1931820、1957857、1948326、1945136、1954849、1938928、1948462，RSD＝0.460％(n＝7)，表明供试品溶液在24小内稳定。

2.2.9重复性试验

取同一批药品(批号131111)，按供试品溶液制备方法分别制备出供试品溶液6份，分别测定其中酚酸B含量。

结果：6份供试品溶液测得丹酚酸B峰面积分别为1912300、1920219、1931167、1919238、1946654、1924301，RSD＝0.493％(n＝6)，表明方法重复性良好。

2.2.10回收率试验

取本品(批号131111)1ml共6份，分别置5ml量瓶中，依次加入上述丹酚酸B对照品溶液后稀释到刻度，测定，计算加样回收率。

结果：如表1所示，丹酚酸B平均回收率为102.77％，RSD＝1.01％(n＝6)，表明方法回收率良好。

表1丹酚酸B回收率试验结果

2.2.11耐用性试验

分别以规格相同的(5μm、4.6mm×250mm)的菲罗门Gemini C18柱、岛津InertsilODS-SP C18柱两根色谱柱，测定本品(批号131111)中的丹酚酸B含量。

结果：两根色谱柱测出丹酚酸B含量分别为0.497mg/ml和0.520mg/ml，RSD＝3.19％(n＝2)。表明本方法耐用性良好。

2.2.12样品测定

取十味参归灌肠液样品6批，按上述色谱条件测定，计算样品中丹酚酸B的含量，见表2。

表2 6批样品含量测定结果(n＝2)

3讨论

十味参归灌肠液主治妇科急慢性盆腔炎，处方由丹参、延胡索、桃仁、赤芍等十味中药组成。丹参作为君药，主要含脂溶性二萜酯类成分和水溶性成分，其中丹酚酸B是水溶性成分中含量最多，活性最高的主要有效成分，具有内皮细胞保护功能，通过血管舒张作用来改善微循环，促进组织的修复与再生。延胡索主要含延胡索甲素、乙素等生物碱类及挥发油等成分。桃仁主含苦杏仁苷、甾醇及其糖苷、脂肪酸类成分。赤芍含芍药苷、氧化芍药苷等多种苷类、牡丹酚、挥发油、胡萝卜素甾醇等化学成分，具有清热凉血，祛瘀止痛的功效。本发明以丹酚酸B、延胡索乙素、苦杏仁苷、芍药苷作为定性或定量指标，对控制制剂质量、建立检测标准，具有重要意义。

在对本制剂丹参的TLC鉴别方法研究中，曾采用《中国药典》2010年版一部丹参项下薄层鉴别方法进行试验。针对本制剂为水溶液剂，首先考虑尝试水溶液直接蒸干后用75％甲醇溶解，作为供试品溶液，按药典的方法鉴别该成分，即点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，显示杂斑点干扰太多，没有独立的特征斑点。为了去除干扰成分，对提取方法进行改进，用乙醚萃取除去小极性的成分，下层水液直接蒸干后用甲醇溶解，但该供试液在药典的分离方法下，仍然显示有多种成分干扰。于是，又改用在乙醚萃取的基础上，下层水液用水饱和正丁醇萃取，蒸干后甲醇溶解作为供试品溶液，层析结果显示，在丹酚酸B对照品相对应的位置仍呈一条色带。最后，我们换极性比正丁醇略小的乙酸乙酯作为下层水液的提取溶剂，蒸干乙酸乙酯后用无水乙醇溶解，作为供试品溶液，层析结果显示，在紫外灯(254nm)下，对应丹酚酸B对照品的位置可检视到清晰、集中的暗斑，其附近没有其他暗斑干扰。故本标准丹酚酸B薄层鉴别选择乙酸乙酯作为下层水液的提取溶剂，蒸干乙酸乙酯后用无水乙醇溶解，作为供试品溶液。

在对本制剂桃仁的TLC鉴别方法研究中，曾试用乙醚脱脂-乙酸乙酯萃取、乙醚脱脂-正丁醇萃取、石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱等不同提取方法；试用氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)，氯仿－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40∶5∶10∶0.2)，氯仿－甲酸乙酯－甲醇(4∶1∶2)，乙酸乙酯-石油醚(60～90℃)-甲苯(8：10：1)等不同展开系统；并尝试在10％硫酸－乙醇溶液105℃下加热显色、日光下或365nm下观察、磷钼酸硫酸溶液显色后日光下观察等不同显色及观察方法。经过多次反复试验，最终发现，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液，在硅胶G薄层板板上，以氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)为展开剂，喷以磷钼酸硫酸的薄层条件下，供试液色谱图中，在与苦杏仁苷对照品溶液相对应的位置上，显相同的蓝黑色斑点，且特征斑点Rf值适中，斑点分离清晰、集中。故将此法收入质量标准。

本研究在高效液相色谱法条件试验中，曾分别对甲醇-5％乙酸水(34：66)、甲醇-乙腈-36％乙酸-水(30：10：1：59)、甲醇-乙腈-甲酸-水(27：8：2：63)三种流动相系统进行试验。结果以甲醇-乙腈-甲酸-水(27：8：2：63)流动相分离效果较好，故本法采用之。

供试品溶液制备方法的建立，通过分别对比样品稀释到2.5倍和5倍、选用甲醇和乙醇两种溶剂，稀释样品后作为供试品溶液，HPLC测定得出其中丹酚酸B含量分别为0.484mg/ml、0.488mg/ml、0.475mg/ml、0.473mg/ml，RSD＝1.49％(n＝4)，表明溶剂与稀释倍数因素，对含量的测定影响不大。但考虑与流动相一致并方便操作，确定选用甲醇作为稀释剂，将样品稀释到2.5倍作为供试品溶液。

在选择色谱柱的过程中，曾以规格均为5μm，4.6mm×250mm的菲罗门Gemini C18柱和岛津Inertsil ODS-SP C18柱两种色谱柱，分别测定本品(批号131111)中的丹酚酸B含量。结果两个品牌的色谱柱对供试品溶液均具有良好的分离效果。故本方法选择以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂。

4结论

本发明建立的十味参归灌肠液中的延胡索、丹参、桃仁、赤芍TLC鉴别方法操作简易，专属性和重复性高，可有效控制制剂的原料药材真伪；建立的丹酚酸B的高效液相色谱定量检测方法专属性较强，精密度高，重现性好，具有可操作性，可作为控制该制剂质量优劣的方法。经方法学及耐受性考察，建立的该制剂定性定量方法，均符合中药质量标准制订技术要求，可作为十味参归灌肠液的质量控制的标准。

Claims (6)

1.一种十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于采用薄层色谱法对制剂中的延胡索、丹参、桃仁、赤芍进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对制剂中丹酚酸B进行含量测定。

2.根据权利要求1所述的十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于包括延胡索的薄层鉴别、丹参的薄层鉴别和桃仁及赤芍的薄层鉴别，以及丹酚酸B的含量测定。

3.根据权利要求1所述的十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于所述延胡索的薄层鉴别按以下进行操作：

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液30ml，加浓氨试液调至碱性，加乙醚萃取3次，每次20ml，合并乙醚层，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1g，加甲醇50ml超声处理30分钟，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液；

对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

延胡索的阴性对照品溶液的制备：取缺延胡索的阴性制剂20ml，照供试品溶液的制备方法制得相应的延胡索阴性对照品溶液；

鉴别方法：吸取十味参归灌肠液供试品溶液和阴性对照品溶液各3～6μl、对照药材溶液和对照品溶液各2～3μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比9∶2的甲苯－丙酮混合液为展开剂展开，取出晾干，置碘缸中3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯下检视。

4.根据权利要求1所述的十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于所述丹参的薄层鉴别按以下进行操作：

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，加乙醚10ml萃取2次，弃去乙醚液，下层水液加乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品，加无水乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；

丹参的阴性对照品溶液的制备：取缺丹参的阴性制剂10ml，照供试品溶液的制备方法制成缺丹参的阴性对照品溶液；

鉴别方法：吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5～6μl，点于同一硅胶F254薄层板上，以体积比2∶3∶4∶0.5∶2的甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸混合液为展开剂展开，取出晾干，置紫外光灯下检视。

5.根据权利要求1所述的十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于所述桃仁及赤芍的薄层鉴别按以下进行操作：

桃仁的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液；

对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；

桃仁的阴性对照品溶液的制备：取桃仁的阴性制剂10ml，照供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液；

鉴别方法：取供试品溶液、苦杏仁苷对照品溶液及阴性对照品溶液各2μl，在硅胶G－CMCNa板薄层板上，以体积比15∶40∶22∶10的氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水混合液为展开剂，喷以磷钼酸硫酸溶液显色，在日光下检测；

赤芍的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取十味参归灌肠液10ml，以石油醚脱脂-过D101大孔树脂柱醇洗脱方法制备供试品溶液；；

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

鉴别方法：取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于硅胶G－CMCNa板薄层板上；以体积比15∶40∶22∶10的氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水混合液为展开剂展开，以磷钼酸硫酸溶液显色。

6.根据权利要求1所述的十味参归灌肠液的质量控制方法，其特征在于所述丹酚酸B的含量测定按以下进行操作：

色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以体积比为27：8：2：63的甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；流速：1.0ml/min；检测波长286nm；进样量10μl；

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成丹酚酸B含量为0.2mg/ml的溶液作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密量取十味参归灌肠液2ml，置5ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

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