CN1733273B - 三金药物制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种治疗泌尿系统等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法，它是将金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草制成药剂学上可以接受的剂型，得到的制剂崩解性好，生物利用度高，特别的它们的辅料用量都比较少，特别适合老年人及吞服药片或胶囊有困难的患者服用，本发明还提供了这种制剂的质量控制方法，能够保证制备的制剂质量并方便工业化生产的要求；与现有技术相比，提供的药物制剂用于对急、慢性肾盂肾炎，慢性尿路感染等疾病的治疗，有比较好的效果；本发明提供的制备工艺先进，简单易行；而且本发明提供的这些制剂不良反应小、可供病人长期使用。

Description

三金药物制剂的检测方法

技术领域：本发明是一种治疗泌尿系统等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法，属于中药的技术领域。

技术背景：急、慢性肾盂肾炎，尿路感染是当今世界上广大人民身心健康的常见疾病，给患者带来了极大的痛苦，传统的治疗方法多为抗生素或理疗，长期使用抗生素，可使患者发生耐药且易造成双重感染，理疗则使多数患者不能长期坚持而中断治疗。为了达到防治目的，许多发明人及药品企业做了大量的研究，也提供了一些治疗的产品；如：申请号为03124080，名称为“一种治疗泌尿系统疾病的药物组合物及其制备方法、用途”的申请，及上市的三金片、三金胶囊、三金颗粒，这三种产品均为治疗此类疾病而开发。但是，其提取工艺和质量控制方法过于简单粗糙，不能最大限度的富集有效成分，也不能全面考察和控制产品的质量；所以鉴于这些情况，寻找更理想的制备工艺，更稳定的质量控制方法依然是我们目前急需解决的事情。

发明内容：本发明的目的在于：提供一种治疗泌尿系统疾病等的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法；用于对急、慢性肾盂肾炎，慢性尿路感染等疾病的治疗；本发明是提供的工艺合理可行，质量控制方法能有效的控制产品质量。

本发明是这样构成的：按照重量组分计算，它是将金樱根8-12份、菝葜4-6份、羊开口4-6份、金沙藤1-4份、积雪草1-4份或相应重量份它们的提取物制作而成分散片、泡腾片、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微丸、滴丸、注射剂，包括：粉针制剂、冻干粉针剂，缓释制剂、控释制剂、凝胶剂、煎膏剂、浸膏剂和膜剂等药剂学上可以接受的剂型。准确的说：所述的制剂是分散片、软胶囊剂、微丸、颗粒剂、胶囊剂、泡腾片、滴丸、片剂，所用的积雪草可用给定组分的积雪草提取的积雪草苷替代。

本发明所述的三金药物制剂的制备方法：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水或乙醇提取，提取液浓缩，用乙醇沉淀法、有机溶剂萃取法、柱层析法中的一种或几种进行纯化，得到的提取物加不同辅料制成相应制剂。

优选为：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩溶剂至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

本发明所述的三金药物制剂的制备方法：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加入乙醇进行沉淀纯化，过滤，收集滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

可以是：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用适量水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

或者是：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，在80℃以下减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

也可以是：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

还可以是：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

它的质量控制方法包括以下全部或部分内容：(1)金樱根药材、积雪草药材、金沙藤药材、羊开口药材、菝契药材、积雪草苷、羟基积雪草苷、菝契皂苷元、薯蓣皂苷元、反式对香豆酸、咖啡酸中全部或部分物质的鉴别测试方法；(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷、菝契皂苷元、薯蓣皂苷元、反式对-香豆酸、咖啡酸全部或部分成分的含量测试方法。准确的说：它的质量控制方法包括以下内容：(1)金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。

本方中，金樱根清热化湿止带为君药，菝葜祛风湿、利小便、消肿毒，羊开口清热凉血，共为佐药；金沙藤清热解毒，积雪草清热利湿、解毒消肿，为使药，诸药相合，共奏祛湿止痛、清热解毒之效。与现有技术相比，本发明提供的提供的制备工艺先进，简单易行；而 且本发明提供的这些制剂不良反应小、可供病人长期使用。

本发明制剂具有良好的抗炎、提高免疫功能的疗效，所以还可用于治疗腰腿痛、小儿急性肾小球肾炎、慢性前列腺炎、尿毒症期慢性肾功能不全、滴虫性阴道炎、肾病综合症等症。

本发明的关键在于：本申请人进行了一系列实验来选择本发明提供的药物制剂的制备工艺；保证其科学、合理、可行；保证得到的制剂具有有效的治疗效果，生产企业可以根据本发明直接生产、制备效果显著的药物制剂，而不再需要进行新的摸索、研究；实际上对于制剂技术来讲其关键就在于生产工艺条件的选择；如果选择不当，要么制备不出有效的产品、有时甚至危害健康，要么制剂品种的成本高昂、又不符合市场要求；本发明的选择解决了这些问题；同时，向市场又提供了新的品种，使医患双方有更多的选择余地。

工艺1：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩溶剂至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺2：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加入乙醇进行沉淀纯化，过滤，收集滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺3：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2-5次，每次1-4小时，合并煎液，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用适量水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺4：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，在80℃以下减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺5：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺6：取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，加入不同辅料制成相应制剂。

工艺7：将金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为60℃时测为1.15-1.20的清膏，然后再分别制成不同的制剂。

实验例1：抗炎作用

对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

实验方法  临用前将各工艺制备的浸膏用0.5％羟甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成0.30g/ml混悬液备用，动物用健康昆明种小鼠，体重20克。将小鼠随机分为5组(对照组用生理盐水)，灌胃体积为20ml/kg，连续灌胃二周，每日一次，末次给药30分钟后用微量注射器将0.05ml二甲苯涂于小鼠右耳，15分钟后处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用8mm直径钢冲分别在左右耳廓相同部位打下圆耳片，扭力天平称两耳片湿重，以两耳片重量差值作为肿胀程度指标

组别       剂量(g/kg)     动物(只)     平均肿胀度(mg)

对照组     20ml/kg        8            24.21±4.60

工艺1组    6.0            8            14.18±2.11

工艺2组    6.0            8            14.23±4.21

工艺3组    6.0            8            14.11±3.32

工艺4组    6.0            8            14.08±5.30

工艺5组    6.0            8            14.15±2.20

工艺6组    6.0            8            14.18±1.79

工艺7组    6.0            8            16.91±3.34

结果表明，本发明提供的工艺制备的浸膏具有良好的作用。

实验例2：对小鼠免疫功能影响的实验研究

对小鼠血清免疫球蛋白的影响取小鼠，体重22±2g，随机分组，即空白对照组、模型组、对照组，本发明工艺组，雌雄各半，空白对照组给予同剂量蒸馏水，各工艺制备的浸膏给予1.5mg/d，均灌胃，连续3个月每w称重1次。实验当日各组小鼠编号，眼球取血，离心取血清测定各组小鼠免疫蛋白。

对小鼠血清免疫球蛋白的影响(X±S)

组别           药物剂量(g/kg)    小鼠      IgA(mg/L)     IgA(mg/L)     IgM(mg/L)

正常对照组     NS                12        3.65±0.65    0.36±0.17    0.58±0.22

模型组         -                 10        2.91±0.68    0.30±0.10    0.45±0.27

工艺7组       15mg/d             10        3.84±1.78    0.81±0.25    0.73±0.11

工艺1组       1.5mg/d            10        3.88±1.05    0.87±0.16    0.83±0.22

工艺2组       1.5mg/d            10        3.86±1.21    0.88±0.13    0.81±0.24

工艺3组       1.5mg/d            10        3.89±1.21    0.87±0.14    0.83±0.29

工艺4组       1.5mg/d            10        3.88±0.89    0.87±0.19    0.81±0.32

工艺5组       1.5mg/d            10        3.87±1.31    0.86±0.21    0.83±0.25

工艺6组       1.5mg/d            10        3.86±1.25    0.87±0.18    0.82±0.28

结果表明，小鼠灌服本发明工艺制备的浸膏后血清免疫球蛋白IgA、IgA、IgM含量提高

实验例3质量控制方法

鉴别

全方共五味药，原标准收载了金樱根、积雪草的TLC鉴别，现剂改仍保留，同时增加菝葜的薄层色谱鉴别。

在鉴别时，参考有关文献，对展开条件进行了研究，试验结果表明，本发明提供的鉴别方法操作简便，重现性和专属性良好。

(1)金樱根的薄层色谱鉴别  金樱根又名脱骨丹，为蔷薇科植物金樱子的根或根皮(Radix Rosa laevigata)，性味酸涩，有固精涩肠作用，考虑到暂无法获取金樱根专属性或特征性的指标成分供检测用，故选用金樱根对照药材为对照进行薄层色谱鉴别。同时以缺金樱根阴性样品作为阴性对照。供试品液制备方法如下：取本品适量研成细粉，取4g，加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol/L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，置分液漏斗中，加乙醚10ml，振摇提取，弃去乙醚液，水层再用醋酸乙酯10ml，振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液(水层备用)。另取缺金樱根阴性样品同法制成阴性样品溶液。再取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲酸(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置过夜后的下层溶液为展 开剂，展开，取出，晾干，结果斑点分离度较差，故不采用。后以氯仿-甲醇(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃烘至斑点显色清晰。结果Rf值适中，斑点圆整，分离度好且阴性对照无干扰，故采用。

(2)积雪草的薄层色谱鉴别  积雪草含有多种化学成分，包括三萜皂苷类成分，如积雪草苷(asiaticoside)、羟基积雪草苷(madecassoside)、波热模苷(brahmoside)、波热米苷(brahminosde)、参枯尼苷(thankuniside)等，还含有一些三萜酸类，如积雪草酸(asiatic acid)等。挥发油类成分，如石竹烯(caryophyllene)、榄香烯(elemene)等。多炔烯类成分以及其他成分。因为积雪草苷为其特征成分之一，故选用积雪草苷对照品为对照进行薄层色谱鉴别。同时以缺积雪草阴性样品作为阴性对照。供试品液制备方法如下：取金樱根鉴别项下的水层液，加水饱和的正丁醇15ml，振摇提取，分取正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层液，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺积雪草阴性样品同法制成阴性样品溶液。再取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，结果斑点未分开，Rf值太低，故不采用。后氯仿-甲酸-水(7∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。结果Rf值适中，斑点圆整，分离度好且阴性对照无干扰。

(3)菝葜的薄层色谱鉴别  菝葜中含有多种甾体皂苷、黄酮、植物甾醇、有机酸、萜类、氨基酸、鞣质、挥发油等多种化学成分。因薯蓣皂苷为其主要成分和特征成分，故选用薯蓣皂苷元对照品为对照进行薄层色谱鉴别。同时以缺菝葜阴性样品作为阴性对照。经研究并参考有关文献，供试品液制备方法如下：取本品或内容物适量研成细粉，取10g，加75％乙醇100ml，摇匀，加盐酸10ml，置水浴中加热回流3小时，取出，放冷，用石油醚(60～90℃)振摇提取4次(30ml，20ml，15ml，15ml)，合并石油醚提取液，挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺菝葜阴性样品同法制成阴性样品溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，结果斑点未分开，阴性有干扰，故未采用。后以环己烷-醋酸乙酯(4∶1)为展开剂，二次展开，每次展距18cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热使斑点显色清晰。结果Rf值适中，斑点圆整，分离度好且阴性对照无干扰。

羟基积雪草苷含量测定

(1)指标成分的选择

处方中积雪草具有清热利湿、解毒消肿之功效，主要含积雪草苷、羟基积雪草苷、羟基积雪草酸、积雪草酸等多种三萜类化合物，其有效组分积雪草总苷在国外已广泛应用于临床。故以羟基积雪草苷为指标成分，采用HPLC法测定羟基积雪草苷的含量，并结合微丸剂型特点，开展方法学研究。

(2)仪器与试药

高效液相色谱仪：Alltech426型泵及AllChrom Plus Client/Server色谱数据工作站(美国Alltech公司生产)；蒸发光散射检测器：Alltech ELSD 2000ES(美国Alltech公司生产)；XWK-III无油空气泵(天津市分析仪器厂)；sartoriusBP211D电子天平(感量0.1mg；0.01mg。载量210g；80g)；autoscienceAS5150A超声波清洗器；TGL-16G高速离心机。

甲醇为色谱纯(Fisher Chemicals)，水为重蒸馏水，其余试剂为分析纯。

(3)检测方法的选择

积雪草有效组分积雪草总苷处于紫外末端吸收，因此，选择蒸发光散射检测作为指标成分的检测方法。

(4)色谱条件的选择

①流动相的选择  实验曾以甲醇-水(55∶45)、甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(50∶50)为流动相，流速：1ml/min，以KromasilC₁₈柱(5um，150×4.6mm)为分析柱，柱温40℃，进行试验研究，结果前者分离效果较好。实验最终选用甲醇-水(55∶45)为流动相，流速1ml/min，柱温：40℃。

②分析柱的选择实验曾用Diamonsil(钻石)C₁₈柱(5um，150×4.6mm)与KromasilC₁₈柱(5um，150×4.6mm)，以甲醇-水(55∶45)为流动相，二者均达到满意的分离效果，羟基积雪草苷峰与相邻峰分离度大于1.5，理论塔板数以羟基积雪草苷峰计算均大于2000。方法学研究实验选用KromasilC₁₈柱(5um，150×4.6mm)。

(5)对照品溶液的制备

羟基积雪草苷对照品易溶于甲醇中，故实验选用甲醇直接溶解制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。

(6)供试品溶液的制备

由于该方提取工艺中，药材已提取至浸膏状，故供试品溶液的制备采用超声处理即可， 试验对提取溶剂、提取时间进行了考察。

①提取溶剂的考察  因羟基积雪草苷易溶于甲醇、乙醇等溶剂，故实验采用以下溶剂进行考察，结果见表。

提取溶剂考察结果

提取溶剂	乙醇	40％甲醇	60％甲醇	甲醇
					羟基积雪草苷含量(mg/g)	1.21	1.31	1.47	1.62

由上表可见，以甲醇为溶剂，羟基积雪草苷的含量最高，因此选用甲醇为提取溶剂。

②提取时间的考察

取021101批样品适量研细，取2.0g，3份，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，分别超声处理(150W，50KHz)30、45、60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中。将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml。取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得。计算含量，结果见表。

超声时间考察结果

提取时间(分钟)	30	45	60
				羟基积雪草苷含量(mg/g )	1.49	1.63	1.64

由表可见，超声处理45分钟后含量几无变化，试验选择提取时间为45分钟。

综上所述，供试品溶液的制备方法为：取本品或内容物适量研成细粉，取2.0g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中。将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml。取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得。

(7)缺积雪草阴性溶液的制备

取缺积雪草阴性样品2.0g，按上述供试品溶液的制备方法制备缺积雪草阴性溶液。

(8)标准曲线与线性范围

分别精密吸取对照品溶液(C＝0.8436mg/ml)2ul、5ul、8ul、10ul、12ul、15ul，注入液相色谱仪，按正文色谱条件进行分析，测定峰面积，结果见表。

羟基积雪草苷对照品标准曲线测定结果

对照品进样量(ug)	1.6872	4.2180	6.7488	8.4360	10.1232	16.8720
							峰面积	2246717	6913994	12432268	17330865	20471895	27058694

当羟基积雪草苷进样量在1.6872～16.8720ug范围内时，其常用对数值与峰面积的常用对数值呈很好的线性关系，回归方程及相关系数：Y＝1.2421X+6.0686，r＝0.9997(X为羟基积雪草苷进样量的常用对数值，Y为峰面积的常用对数值)；以进样量(ug)的常用对数值为横坐标(X)，峰面积(A)的常用对数值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，见附图1。

(9)精密度试验

精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定5次，测定峰面积，结果见表。

精密度试验结果

	1	2	3	4	5	平均值	RSD(％)
								对照品	17477840	17004161	17594817	17811123	17710672	17519723	1.79
供试品	16489573	16120736	15756508	15582651	15831625	15956219	2.23

由表可见，对照品峰面积平均值为17519723，RSD为1.79％；供试品峰面积平均值为15956219，RSD为2.23％，表明精密度良好。

(10)稳定性试验

取批号为021101的样品与羟基积雪草苷对照品适量，分别制备供试品溶液与对照品溶液，室温下保存，于制备完成后放置不同时间后，分别精密吸取10ul注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，考察其稳定性，结果见表。如表所示，供试品溶液及对照品溶液在配制后16小时内测定，结果稳定。

稳定性试验结果

放置时间(H)	0	2	4	8	16	RSD(％)
							供试品	16006318	16083871	16834179	16532018	16732153	2.28
对照品	16549193	17004101	17411923	16983826	17540632	2.30

(11)重复性试验

取批号为021101样品适量研细，精密称取2.0g，共5份，按样品分析方法进行测定，结果见表。如表所示，含量平均值为1.64mg/g，RSD＝2.51％，重复性良好。

重复性试验结果

(12)加样回收率试验

取样品适量研细(样品批号为021101，羟基积雪草苷含量为1.64mg/g)，精密称取1.0g，共5份，分别精密加入羟基积雪草苷对照品溶液(C＝0.6648mg/ml)3ml，再分别加甲醇25ml，测定，按下述计算式计算回收率，结果见表。如表所示，本方法平均加样回收率为99.18％，RSD为1.09％，表明回收率的重现性较好。

加样回收率试验结果

N0	峰面积	样品取样量(g)	样品含量(mg)	对照品加入量(mg)	实测含量(mg)	回收率(％)	平均回收率(％)	RSD(％)
									1	15826768	1.2383	2.0308	1.9944	3.9912	98.3	99.18	1.09
2	15446296	1.1983	1.9652	1.9944	3.9171	97.87
									3	16071699	1.2405	2.0344	1.9944	4.0387	100.5
4	16260214	1.2713	2.0849	1.9944	4.0751	99.79
									5	15490643	1.1843	1.9423	1.9944	3.9258	99.45

结果表明，本发明提供的质量控制方法合理可行。

附图说明：附图1是本发明以进样量(ug)的常用对数值为横坐标(X)，峰面积(A)的常用对数值为纵坐标(Y)绘制的标准曲线。

具体的实施方式：(份指重量份，如：公斤、克等)

本发明的实施例1：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩溶剂至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，粉碎，得浸膏粉，按浸膏粉∶羧甲基淀粉钠∶改性淀粉∶微晶纤维素＝20∶5∶5∶2的重量比例，将浸膏粉与羧甲基淀粉钠、改性淀粉、微晶纤维素过筛混匀，加适量水制成软材，制粒，整粒，按浸膏粉∶硬脂酸镁＝7∶2的重量比例，加入硬脂酸镁，采用PY129旋转式压片机，压力为6～7kg，转速为25 r/min，压片，即得分散片剂，本产品口服、一日三次、每次2片。

本发明的实施例2：金樱根12份、菝葜6份、羊开口6份、金沙藤4份、积雪草4份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮5次，每次4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩溶剂至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，干燥，粉碎，得浸膏粉，取浸膏粉1份，PEG40001.5份，混合均匀，水浴上熔解，搅匀，滴于二甲基硅油中成丸，滴距5cm滴口径2.5mm/2mm，混合药膏温度70℃，冷却液高度70cm，即得滴丸剂。

本发明的实施例3：金樱根10份、菝葜5份、羊开口5份、金沙藤3份、积雪草3份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加入乙醇进行沉淀纯化，过滤，收集滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，减压干燥，粉碎，得浸膏粉，按浸膏粉∶枸橼酸∶微粉硅胶∶微晶纤维素＝100∶2∶1∶95的重量比例，将浸膏粉与枸橼酸、微粉硅胶、微晶纤维素过筛混匀，加适量水制成软材，经挤出机筛板(孔径0.8mm)挤成细条状，挤出转速为250r/min，置滚圆机内，滚圆转速为1000r/min，滚圆时间为5min，取出微丸于50℃干燥3～4h，即得微丸剂。

本发明的实施例4：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮5次，每次4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加入乙醇进行沉淀纯化，过滤，收集滤液，减压回收乙醇至60℃相对密度为1.15～1.20的清膏，加入蒸馏水，即得口服液。

本发明的实施例5：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用适量水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，粉碎，得浸膏粉，按浸膏粉∶聚乙二醇400∶柠檬酸∶甘氨酸＝3∶200∶2∶2的重量比例，加入聚乙二醇400、柠檬酸、甘氨酸混匀，明胶甘油为囊材，压丸机的明胶盒温控65℃，喷体温控45℃，滚模转速2.0，胶皮厚度0.8mm，压丸，即得软胶囊剂。

本发明的实施例6：金樱根12份、菝葜6份、羊开口6份、金沙藤4份、积雪草4份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加水煎煮5次，每次4小时，合并煎液，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用适量水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，粉碎，制粒，即得颗粒剂。

本发明的实施例7：金樱根10份、菝葜6份、羊开口6份、金沙藤4份、积雪草4份，取金 樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30％乙醇回流提取0.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，粉碎，制粒，即得颗粒剂。

本发明的实施例8：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，粉碎，制粒，装胶囊，即得胶囊剂。

本发明的实施例9：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30％乙醇回流提取0.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，减压干燥，粉碎，制粒，装胶囊，即得胶囊剂。

本发明的实施例10：金樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加搅拌均匀，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，干燥，制丸，即得微丸剂。

本发明的实施例11：金樱根10份、菝葜6份、羊开口6份、金沙藤4份、积雪草4份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入30％乙醇回流提取0.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，粉碎，制粒，压片，即得片剂。

本发明的实施例12：樱根8份、菝葜4份、羊开口4份、金沙藤1份、积雪草1份，取金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草，加入80％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至相对密度60℃为1.15～1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，粉碎，加入8％碳酸氢钠、10％枸橼酸、1％阿司帕坦分别粉碎，制粒，压片，即得泡腾片剂。

本发明实施例中，所用的积雪草可用给定重量的积雪草提取的积雪草苷替代。

本发明的实施例13：质量控制方法包括以下全部或部分内容：

(1)金樱根药材、积雪草药材、金沙藤药材、羊开口药材、菝契药材、积雪草苷、羟 基积雪草苷、菝契皂苷元、薯蓣皂苷元、反式对香豆酸、咖啡酸中全部或部分物质的鉴别测试方法；

(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷、菝契皂苷元、薯蓣皂苷元、反式对香豆酸、咖啡酸全部或部分成分的含量测试方法。

本发明的实施例14：它的质量控制方法包括以下内容：

(1)金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；

(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。

本发明的实施例15：质量控制方法包括以下全部或部分内容：

【鉴别】(1)取本品或内容物适量研成细粉，取4g，加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol/L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，置分液漏斗中，加乙醚10ml，振摇提取，弃去乙醚液，水层再用醋酸乙酯10ml，振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液(水层备用)。另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10～15ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲酸(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取[鉴别](1)项下的水层，加水饱和的正丁醇15ml，振摇提取，分取正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层液，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲酸-水(7∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取本品适量研成细粉，取10g，加75％乙醇100ml，摇匀，加盐酸10ml，置水浴中加热回流3小时，取出，放冷，用石油醚(60～90℃)振摇提取4次(30ml，20ml，15ml，15ml)，合并石油醚提取液，挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(4∶1)为展开剂，二次展开，每次展距18cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热使斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

【含量测定】照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(55∶45)为流动相，用蒸发光散射检测器检测。理论板数按羟基积雪草苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品或内容物适量研成细粉，取2.0g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中。将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml。取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得。

测定法分别精密吸取上述对照品溶液5ul、10ul，供试品溶液5～10ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量，即得。

Claims (1)

1.一种三金药物制剂的检测方法，该药物制剂是按照重量组分计算的金樱根8-12份、菝葜4-6份、羊开口4-6份、金沙藤1-4份和积雪草1-4份或相应重量份它们的提取物制作成的，其特征在于：所述药物制剂的检测方法为以下内容：

(1)鉴别

(A)取本品或内容物适量研成细粉，取4g，加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol/L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，置分液漏斗中，加乙醚10ml，振摇提取，弃去乙醚液，水层再用醋酸乙酯10ml，振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液，水层备用；另取金樱根对照药材2.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10～15ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲酸＝5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(B)取备用的水层，加水饱和的正丁醇15ml，振摇提取，分取正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层液，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲酸∶水＝7∶3∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(C)取本品适量研成细粉，取10g，加75％乙醇100ml，摇匀，加盐酸10ml，置水浴中加热回流3小时，取出，放冷，用60～90℃的石油醚振摇提取4次，每次需要的溶剂量为30ml，20ml，15ml，15ml，合并石油醚提取液，挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶醋酸乙酯＝4∶1为展开剂，二次展开，每次展距18cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热使斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(2)含量测定

照高效液相色谱法，《中国药典》2000一部附录VID测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水＝55∶45为流动相，用蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按羟基积雪草苷峰计算不低于2000；精密称取经105℃干燥至恒重的羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；取本品或内容物适量研成细粉，取2.0g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中；将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml；取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液5ul、10ul，供试品溶液5～10ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。

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