CN105911192A - 一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法及指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法，取干燥的半枫荷根粉碎后采用乙醇提取1‑3次后浓缩干燥得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物；其中，半枫荷根和乙醇的比例为40‑50g:1ml；每次用乙醇提取时间为100‑200min。该提取方法提取准确性高、提取物活性高；此外本发明还提供一种半枫荷的活血化瘀活性部位的指纹图谱检测方法。该检测方法可以客观、全面、准确地评价半枫荷有效成分的质量，对控制半枫荷有效成分的质量和保证临床疗效有重要意义。

Description

一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法及指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法及指纹图谱检测方法。

背景技术

半枫荷(Semiliquidambar cathayensis Chang)是金缕梅科半枫荷新发现的寡种属植物,为我国特产。半枫荷是我国特有的药用植物，有祛风除湿、舒筋活血的功效(傅立国.中国植物红皮书-稀有濒危植物[M].第一册.北京:科学出版社，1992.)，初步研究发现，其化学成分主要为齐墩果酸衍生物和鞣酸衍生物(周光雄，杨永春，石建功，等.金缕半枫荷化学成分研究[J].中草药，2002.33(7):589-591.)。经研究，半枫荷的提取物有活血化瘀作用。(梁伟江，卢海啸，曾孟，等.半枫荷提取物对血瘀模型大鼠的影响[J].中药材，2015.38(2)：366-369.)该研究采用持续力竭游泳法制作大鼠血瘀模型，并对半枫荷不同极性提取物的活血化瘀活性进行了测定，发现不同极性半枫荷提取物均有活血化瘀的作用。

中药指纹图谱是指某种(或某地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。指纹图谱从中医整体观念和中药药效来自多种化学物质综合作用的观点出发，能够建立比较客观、整体和多指标的综合评价体系，并通过图谱的整体特征，能够比较全面地反映出中药所含化学成分的种类与数量，是一种综合的、可量化的质量控制手段。与测定单一组分相比，它的优势在于能够提供更丰富、有效的质和量的信息，因此指纹图谱能较为宏观和综合地反映中药的内在质量已被国内外研究者所认可。

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专利号CN201310692364.6(中药苦黄注射液及其原料药材、半成品的指纹图谱检测方法及应用顾治平；王恒斌；陈力建)公开了中药苦黄注射液及其原料药材、半成品的指纹图谱检测方法及其应用。该方法包括供试液的制备,对照指纹图谱的建立和供试液指纹图谱的测定。该专利根据中药苦黄注射剂中所含的活性成分,包括蒽醌类、黄酮类和生物碱类化合物的结构性质特点。并通过大量实验筛选出最佳的流动相组成,梯度洗脱程序、流速,检测波长、色谱柱,柱温等分析条件。

专利号CN201310313721.3(一种化橘红有效部位及其制剂的质量控制方法彭维；苏薇薇；邹威等)公开了一种化橘红有效部位及其制剂的质量控制方法。该发明以含新北美圣草苷、樱桃苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮内酯水合物、7-(2”-α-鼠李糖基-6”-(3””-羟基-3””-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素的混合甲醇溶液为对照品；以化橘红有效部位或其制剂的甲醇提取液为供试品；在特定的色谱条件下,采用高效液相色谱指纹图谱分析法,建立对照品的高效液相色谱、供试品的高效液相色谱指纹图谱和对照指纹图谱,通过供试品是否含有与对照品相对应的色谱峰,以及与对照指纹图谱的相似度评价结果,判断药品是否合格。

专利号CN103110677A(一种西洋参提取物的提取方法及其在制备防治艾滋病药物中的应用刘延军郭会军李青雅肖培根等)，本发明涉及一种防治艾滋病的药物的提取方法及其应用，具体涉及西洋参提取物的提取方法及其在制备防治艾滋病的药物中的应用，可通过添加药学上可接受的载体，将西洋参提取物制备成口服制剂或注射剂，所述口服制剂的剂型优选为胶囊、片剂、滴丸剂、微丸剂、口服液或颗粒剂。药效学试验表明西洋参提取物能在不损伤免疫功能的前提下，有效阻断HIV感染，无副作用，从而实现对艾滋病的防治。

在我国现有标准中，中药材、中成药的质量标准大量限于外观鉴别，性状检查、即使在建立成分测定的标准中，所测成分大部分仅为一、二个指标成分，而不是直接与疗效相关的有效成分，在常规检查中，外观、性状的鉴别以及化学鉴别项的内容中，存在大量普适性内容、专属性不强、很难对药材或制剂的特性有一个全面的描述。

发明内容

本发明的目的是提供一种半枫荷的活血化瘀活性部位的提取方法和指纹图谱检测方法。该检测方法可以客观、全面、准确地评价半枫荷有效成分的质量，对控制半枫荷有效成分的质量和保证临床疗效有重要意义。

本发明的技术方案为：一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法，取干燥的半枫荷根粉碎后采用乙醇提取1-3次后浓缩干燥得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物；

其中，半枫荷根和乙醇的比例为1g:40-50ml；每次用乙醇提取时间为100-200min。

在上述的半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法中，所述的提取温度为50-90℃。

在上述的半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法中，所述的乙醇的体积百分比为65％，每次加入的料液比为1g:45ml，在70℃下提取3次，每次提取时间为150min。

同时本发明还公开了上述的半枫荷活血化瘀活性部位的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1：精密称取5.0mg半枫荷提取物，用色谱纯甲醇溶解且定容至1ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到半枫荷供试品；

步骤2：对步骤1制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以保留时间为19.235±5％，32.858±5％，39.106±5％的三个特征峰作为反式-白藜芦醇葡萄糖苷、3,3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-2-L-吡喃鼠李糖苷、3,3′-甲醚-鞣花酸的特征峰，进行分析比较；

高效液相色谱的条件为：色谱柱填料为Aglient C18，规格为250mm×4.6mm 5μm，波长为254nm，流动相为乙腈-0.4％磷酸，梯度洗脱为：0～1min，乙腈体积百分比由5％～8％，0.4％磷酸体积百分比由95％～92％；1～10min,乙腈体积百分比由8％～12％,0.4％磷酸体积百分比由92％～88％；10～29min,乙腈体积百分比由12％～20％，0.4％磷酸体积百分比由88％～80％；29～42min,乙腈由体积百分比20％～30％，0.4％磷酸体积百分比由80％～70％；42～50min,乙腈体积百分比由30％～40％,0.4％磷酸体积百分比由70％～60％；50min～60min,乙腈体积百分比由40％～75％,0.4％磷酸体积百分比由60％～25％；60min～70min,乙腈体积百分比由75％～95％，0.4％磷酸体积百分比由25％～5％。

本发明的有益效果如下：

本发明以活血化瘀化学成分组(反式-白藜芦醇葡萄糖苷、3,3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-2-L-吡喃鼠李糖苷、3,3′-甲醚-鞣花酸化学成分)为评价指标，得到半枫荷提取物的最佳工艺条件：热回流方法提取、提取时间为150分钟、提取溶剂为乙醇、提取浓度为65％、料液比为1：45、提取次数为3次、提取温度为70℃，以此提高临床疗效，对半枫荷活血化瘀活性成分的质量控制方法研究具有实用价值和重大意义。

本发明通过运用现代提取技术、高效液相色谱分析方法、excel软件和SPSS软件等，明确半枫荷提取的最佳工艺条件，从而确定半枫荷的提取工艺，为提高半枫荷的活血化瘀活性部位提取率研究提供科学依据，又可进一步提高半枫荷的药理作用。

采用一测多评法同时鉴定及测定半枫荷的活血化瘀活性部位，有效地全面监控半枫荷药材质量。监控生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控、有效的避免了半枫荷药材伪品，保证半枫荷药材生产流通秩序。

附图说明

图1为实施例4的指纹图谱；

图2为实施例4的反式-白藜芦醇葡萄糖苷的保留特征峰；

图3为实施例4的3,3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-2-L-吡喃鼠李糖苷的保留特征峰；

图4为实施例4的3,3′-甲醚-鞣花酸的保留特征峰。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本发明的半枫荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步骤如下：

取干燥的半枫荷根，粉碎后过二号筛，然后加入乙醇，每次加入的料液比为1g:40ml,然后加热，在50℃下提取3次，每次提取时间为100min过滤后，浓缩干燥即可得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物。

所述的乙醇的体积百分数为65％。

实施例2

本发明的半枫荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步骤如下：

取干燥的半枫荷根，粉碎后过二号筛，然后加入乙醇，每次加入的料液比为1g：50ml,然后加热，在60℃下提取1次，每次提取时间为200min,过滤后，浓缩干燥即可得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物。

所述的乙醇的体积百分数为65％。

实施例3

本发明的半枫荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步骤如下：

取干燥的半枫荷根，粉碎后过二号筛，然后加入乙醇，每次加入的料液比为1g:45ml,然后加热，在70℃下提取3次，每次提取时间为150min,过滤后，浓缩干燥即可得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物。

所述的乙醇的体积百分数为65％。

实施例4

半枫荷高效液相指纹图谱的建立和验证

1仪器和试药

安捷伦1260及色谱工作站，甲醇和乙腈均为色谱纯，水为纯化水，其余为分析纯。

2半枫荷药材高效液相指纹图谱的建立

2.1供试品溶液制备:

精密称取5.0mg实施例1-3制备的半枫荷提取物，用色谱纯甲醇溶解且定容至1ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到半枫荷供试品。

2.2对照品溶液的制备：

通过高效液相色谱测定多个批次的半枫荷药材，高效液相色谱分析色谱柱填料为AglientC18，规格为250mm×4.6mm 5μm，波长为254nm，流动相为乙腈-0.4％磷酸，梯度洗脱为：0～1min，乙腈体积百分比由5％～8％，0.4％磷酸体积百分比由95％～92％；1～10min,乙腈体积百分比由8％～12％,0.4％磷酸体积百分比由92％～88％；10～29min,乙腈体积百分比由12％～20％，0.4％磷酸体积百分比由88％～80％；29～42min,乙腈体积百分比由20％～30％，0.4％磷酸体积百分比由80％～70％；42～50min,乙腈体积百分比由30％～40％,0.4％磷酸体积百分比由70％～60％；50min～60min,乙腈体积百分比由40％～75％,0.4％磷酸体积百分比由60％～25％；60min～70min,乙腈体积百分比由75％～95％，0.4％磷酸体积百分比由25％～5％。

得到指纹图谱共有12各共有特征峰，具体保留时间分别为：1.640±5％(1号峰)，2.386±5％(2号峰)，3.316±5％(3号峰)，4.246±5％(4号峰)，5.214±5％(5号峰)，19.235±5％(6号峰)，20.727±5％(7号峰)，27.65±5％(8号峰)，29.586±5％(9号峰)，32.858±5％(10号峰)，39.106±5％(11号峰)，61.782±5％(12号峰)。(图1)

其中保留时间为19.235±5％(6号峰)，32.858±5％(10号峰)，39.106±5％(11号峰)，分别为反式-白藜芦醇葡萄糖苷、3,3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-2-L-吡喃鼠李糖苷、3,3′-甲醚-鞣花酸(分别为图2、图3、图4)。

2.3对步骤2.1制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤2.2中确定的三个特征峰为评价指标，进行分析比较。

3方法学验证

3.1精密度试验

取同一半枫荷活性成分供试品溶液连续进样6次，检测指纹图谱。再采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果表明供试品溶液的相似度均等于1，说明仪器精密度良好。

3.2稳定性试验

取同一个半枫荷活性成分供试品溶液。分别在0.2.4.6.8.10.12.24.48小时进样，检测指纹图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果表明供试品溶液的相似度均等于1，说明供试品在放置48小时内稳定。

3.3重复性试验

取同一批半枫荷活性成分供试品6份，按“供试品溶液制备”方法制备，分别进样，检测指纹图谱。再采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价。得出半枫荷根干燥粉末重复性好。

4最佳制备技术的优选

通过指纹图谱对比，实施例1-3中的提取方法的提取率分别是8.58％、9.96％、12.75％，通过上述对比分析，本发明实施例3的提取方法提取率最好。

该研究采用持续力竭性游泳血瘀模型，检测舌象、全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数、血小板数、TT、PT、APTT、FIB等指标，考察半枫荷各极性提取物的活血化瘀作用。结果分布如下：

1.检测舌象检测

表1 半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠舌象评分的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

可知道与正常对照组比较，模型组大鼠舌象评分显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，除石油醚部位组外，各给药组舌象评分均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中以正丁醇部位组、水部位组对舌象改善最显著。

2.全血黏度及血浆黏度检测

表2 半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠全血黏度及血浆黏度的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与正常对照组比较，模型组全血黏度和血浆黏度均升高(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组全血黏度均显著降低(P＜0.01)。

3.红细胞聚集指数检测

表3 半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠红细胞聚集指数的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与正常对照组比较，模型组大鼠红细胞聚集指数显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组红细胞聚集指数均显著降低(P＜0.01)，其中以水部位组作用最佳。

4.血小板数检测

表4 半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠血小板计数的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组血小板数计数均显著降低(P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

5.半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠凝血四项的影响

表5 半枫荷提取物各极性部位对血瘀大鼠凝血四项的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

结果如表5所示，与正常对照组比较，模型组PT、APTT显著降低，TT、FIB显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组PT、APTT显著升高，TT、FIB显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中以水部位组作用最佳。

6.不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠

舌象评分的影响：

表6 不同剂量半枫荷水提取物部位对血瘀大鼠舌象评分的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05。

如表6所示，与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组舌象评分均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

7.不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠全血黏度及血浆黏度的影响：

表7 不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠全血黏度及血浆黏度的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组全血黏度及血浆黏度均显著降低(P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

8.不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠红细胞聚集指数的影响；

表8 不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠红细胞聚集指数的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组红细胞聚集指数均显著降低(P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

9.不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠血小板计数的影响：

表9 不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠血小板计数的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组血小板数计数均显著降低(P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

10.不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠凝血四项的影响：

表10不同剂量半枫荷提取物水部位对血瘀大鼠凝血四项的影响(n＝10)

注：与正常对照组比较，^＊＊P＜0.01；与模型组比较，^##P＜0.01

可知道与模型组比较，半枫荷水部位各剂量组PT、APTT显著升高，TT、FIB显著降低(P＜0.01)，其作用呈现一定的量效关系。

由以上结论可知半枫荷提取物均具有显著的活血化瘀作用，其活血化瘀的有效部位为水部位

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于：取干燥的半枫荷根粉碎后采用乙醇提取1-3次后浓缩干燥得到含有活血化瘀活性部位的半枫荷提取物；

其中，半枫荷根和乙醇的比例为1g：40-50ml；每次用乙醇提取时间为100-200min。

2.根据权利要求1所述的半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于，所述的提取温度为50-90℃。

3.根据权利要求1所述的半枫荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于，所述的乙醇的体积百分比为65％，每次加入的料液比为1g：45ml，在70℃下提取3次，每次提取时间为150min。

4.根据权利要求1至3任一所述的半枫荷活血化瘀活性部位的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：精密称取5.0mg半枫荷提取物，用色谱纯甲醇溶解且定容至1ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到半枫荷供试品；

步骤2：对步骤1制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以保留时间为19.235±5％，32.858±5％，39.106±5％的三个特征峰作为反式-白藜芦醇葡萄糖苷、3,3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-2-L-吡喃鼠李糖苷、3,3′-甲醚-鞣花酸的特征峰，进行分析比较；

高效液相色谱的条件为：色谱柱填料为Aglient C18，规格为250mm×4.6mm 5μm，波长为254nm，流动相为乙腈-0.4％磷酸，梯度洗脱为：0～1min，乙腈体积百分比由5％～8％，0.4％磷酸体积百分比由95％～92％；1～10min,乙腈体积百分比由8％～12％,0.4％磷酸体积百分比由92％～88％；10～29min,乙腈体积百分比由12％～20％，0.4％磷酸体积百分比由88％～80％；29～42min,乙腈由体积百分比20％～30％，0.4％磷酸体积百分比由80％～70％；42～50min,乙腈体积百分比由30％～40％,0.4％磷酸体积百分比由70％～60％；50min～60min,乙腈体积百分比由40％～75％,0.4％磷酸体积百分比由60％～25％；60min～70min,乙腈体积百分比由75％～95％，0.4％磷酸体积百分比由25％～5％。