发明内容
本发明的一个目的是提供一种疗效确切并且药味精简的妇科抗炎止血中药组合物。
本发明的又一目的是提供该药物的制备工艺。
本发明药物是由有效成分和/或药学上可接受的赋形剂组成,其中所述的有效成分是由下列重量配比的原料制成的:
32~60%、小蓟16~30%、广东紫珠、荷叶各为10~20%。
为了获得更好的疗效,优选原料用量为:
大蓟39~53%、小蓟20~27%;广东紫珠、荷叶各为13~18%。
为了获得最佳疗效,原料用量最佳为:
大蓟46.2%、小蓟23.1%;广东紫珠、荷叶各为15.4%。
其中所述的中药原料为:
大蓟为菊科植物蓟Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根。
小蓟为菊科植物刺儿菜Cirsium setosum(Willd)MB.的干燥地上部分,均为多年生草本,为中医治病的常用中药。均具有凉血止血,祛瘀消肿的功效。用于吐血、尿血、便血、崩漏下血、外伤出血。大蓟、小蓟主要含有黄铜类、挥发油等化学成份。
广东紫珠为马鞭草科植物广东紫珠Gallicarpa kwtungensis Chun.的茎枝及叶,功效为收敛止血,清热解毒,用于吐血、尿血、便血、崩漏下血、外伤出血。广东紫珠主要含有黄酮类等化学成份。
荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶。能清热解署,升发清阳,凉血止血。用于暑热烦渴,署湿泄泻,便血崩漏,荷叶主要含有生物碱类等化学成份。
如果本发明药物的有效成分是水提物,优选后由以下方法制得:将大蓟、小蓟、广东紫珠和荷叶加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度1.35~1.38(60℃)的稠膏。
通过对本中成药的制备工艺的药理实验和正交试验研究,确定取大蓟600g、小蓟300g、广东紫珠200g、荷叶200g,加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度1.35~1.38(60℃)的稠膏。
本发明药物的提取物可以与药学上可接受的各种赋形剂按照不同剂型制备方法制备成各种剂型如片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、糖浆剂、合剂、口服液剂、膏剂等。
提取工艺的优选研究资料
1样品的制备
本方药材中分别含蒙花苷,柳穿鱼叶苷,芸香苷,原儿荼酸、绿原酸,咖啡酸,齐墩果酸,熊果酸,荷叶碱,莲碱及O-去甲基荷叶碱等,上述化学成分大多数以水溶性为主,也含醇溶性成分,因此,我们根据生产是通常以水煎煮提取和醇回流提取实际情况,取一个处方药材分别煎煮提取和回流提取。
煎煮提取:取大蓟600g、小蓟300g、、荷叶200g广东紫珠200g加9倍量水煎煮提取2次,每次煎煮提取3小时,滤过,浓缩至每1ml含生药1mg,作为供试品1。
回流提取:取大蓟600g、小蓟300g、、荷叶200g广东紫珠200g加5倍量70%乙醇回流提取2次,每次提取3小时,滤过,浓缩至每1ml含生药1mg,作为供试品2。
2药效学预实验
2.1.剪尾法测小鼠出血时间及玻片法测凝血时间
2.1.1动物:KM小鼠,雌雄各半共120只,体重15~20g,购自江西中医学院实验动物中心。
2.1.2实验器材:眼科剪,秒表,大头针,玻片,脱脂棉球。
3.2.1.3实验用药:阳性药为断血流颗粒(10g/袋,安徽省天康药业有限公司批号:030303);受试药物为蓟荷止血片水提液、醇提液。
2.1.4实验过程
2.1.4.1小鼠按体重随机分为空白、阳性药、蓟荷止血片水提液低、中和高剂量、醇提液低、中和高剂量共8组。
2.1.4.2各组动物分别灌胃给与生理盐水和药物共4天。最后一次给药后0.5h,用眼科剪剪去鼠尾约3mm,待血液自然流出开始计时,每隔15秒左右用滤纸轻轻吸去血液,至出血自然止住结束,此时间即为出血时间(结果见表1)。凝血时间测定则是小鼠眼眶采血滴一滴到清洁玻片,血滴直径约5mm,立即计时,每隔15秒左右用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次,看有无血丝挑起,从采血开始至挑起血丝的时间即为凝血时间(结果见表2)。
表1蓟荷止血片对小鼠出血时间的影响
注:与空白组比较,*P<0.01,与阳性组比较,▲P<0.05 ▲▲P<0.01。下同
表2蓟荷止血片对小鼠凝血时间的影响
表1结果表明,各给药组的止血时间与空白组均有显著差异,其中以水提液高剂量组最显著;与阳性组比较,水提液高剂量组、醇提液高剂量组均有显著性差异。
表2结果表明,各给药组的凝血时间与空白组均有显著差异;同样以水提液高剂量组最显著;与阳性组比较,水提液高剂量组、醇提液高剂量组均有显著性差异。
2.2.大鼠血浆复钙试验
2.2.1动物:SD大鼠,雌42只、雄性43只,共85只,体重180~200g,购自江西省实验动物中心。
2.2.2实验器材:秒表,加样器,离心机,恒温水浴锅。
2.2.3实验用药及试剂:阳性药为断血流颗粒(10g/袋,安徽省天康药业有限公司批号:030303);受试药物为蓟荷止血片水提液、醇提液。1.25%CaCl2溶液,枸橼酸钠(38mg/ml)。
2.2.4实验过程
2.2.4.1大鼠按体重随机分成空白、阳性药、蓟荷止血片水提液低、中和高剂量、醇提液低、中和高剂量共8组。
2.2.4.2各组动物分别灌胃给与生理盐水和药物共5天.最后一次给药后0.5h,大鼠静脉取血4.5ml装入含有0.5ml枸橼酸钠的试管中,混匀.1000rpm离心10min,取血浆备用.空白试管2支,每管分别加入0.1ml血浆和0.1ml生理盐水,摇匀即放入37℃水浴锅孵育1min后,再加入0.1ml 1.25%CaCl2溶液,混匀。重新放入水浴锅并立即计时直至出现弥漫白色颗粒时为止,取两管时间的平均值,即为大鼠血浆复钙时间(结果见表3)。
表3蓟荷止血片对大鼠血浆复钙时间的影响
表3结果表明,各给药组的大鼠血浆复钙时间与空白组均有显著差异;以醇提液的中、高剂量组最显著;与阳性组比较,水提液的中、高剂量组、醇提液的低、中和高剂量组均有显著性差异。
3结论
以上3个试验的结果表明水提取与醇回流提取药液对小鼠出血时间、凝血时间和大鼠血浆复钙时间均有显著的缩短,说明该药物有一定的止血功效,但水煎煮和醇回流提取没有显著差异,因此拟采用水煎煮提取。
4.水煎煮工艺优化研究
4.1水煎煮因素和水平设计影响水煎煮的主要因素有加水量、煎煮次数、煎煮时间,因此,我们用正交实验考察了上述三因素对提取结果的影响,用正交表L9(34)进行试验,实验以半个处方量进行,方案见表4,实验方法及结果见表5。
表4水煎煮工艺因素水平安排
4.2检测指标:处方君药大蓟、小蓟均含黄酮类化合物,因此,工艺考察以蒙花苷的含量为试验指标。
4.3药材中蒙花苷含量测定:取大蓟、小蓟药材照高效液相色谱仪色谱法测定蒙花苷含量,结果测得大蓟蒙花苷含量为0.015%,小蓟蒙花苷含量为0.81%。
4.4供试品溶液的制备及测定:每组取1个处方药材,按表4正交实验安排工艺煎煮提取,将收集的煎煮液分别量出体积,备用。
【蒙花苷含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.2%磷酸(50∶50),为流动相;检测波长326nm;理论板数按蒙花苷峰计应不低于2000.
对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的蒙花苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取相当于2.0g大、小蓟药材的提取液,置50ml量瓶中,加甲醇至刻度,滤过,续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见表5。
4.5实验结果及数据分析
表5水煎煮工艺试验设计和结果
表6蒙花苷的方差分析表
F0.05(2,2)=19.0 F0.01(2,2)=99.0
以提取物中蒙花苷的含量为考察指标,方差分析结果表明:因素B的影响有极显著性意义(P<0.05),表5中极差R值大小显示,各因素作用的主次为B>A>C;以A3B3C3最佳,根据B因素K值,因素B2、B3值相近,考虑节约能源及缩短生产时间,因此,因素B拟采用B2,因素A、C各水平对提取结果无显著性意义,因此拟采用因素A2C3,即拟加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时。
本发明药物可以采用下列方法加以鉴别:
【鉴别】(1)取本品20片,研细,加甲醇25ml,超声提取30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,转移至分液漏斗中,用乙醚萃取2次,每次20ml,蒸干,残渣用甲醇0.5ml使溶解,作为供试品溶液。取大蓟对照药材2g,研细,加甲醇25ml,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验,吸对照药材溶液、供试品溶液各10μl,分别点于同一用羧甲基纤维素钠制成的硅胶G薄层板上,以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,在105℃烘约5分钟。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(2)取本品12片,研细,加甲醇25ml超声提取30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用水15ml使溶解,转移至分液漏斗中,用4%NaOH溶液调pH至10,加入乙醚萃取4次,每次20ml,乙醚液蒸干,残渣用0.5ml甲醇使溶解,作为供试品溶液。另取荷叶碱对照品适量,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验,吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl,分别点于同一用羧甲基纤维素纳制成的硅胶G薄层板上,以甲苯-丙酮-乙醇-氨水(30∶8∶1∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以改良碘化铋钾溶液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.2%磷酸(50∶50)为流动相;检测波长326nm;理论板数按蒙花苷峰计应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的蒙花苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取片量差异项下的本品,研细,取约1.5g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)45分钟,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每片含大蓟、小蓟以蒙花苷(C28H32O14)计,不得少于0.36mg。
实施例1:片剂的制备
称取大蓟600g、小蓟300g、广东紫珠200g、荷叶200g,加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度1.35~1.38(60℃)的稠膏,加入辅料混匀,制粒,干燥,压片即得。
实施例2:颗粒剂的制备
称取大蓟600g、小蓟300g、广东紫珠200g、荷叶200g,加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度1.35~1.38(60℃)的稠膏,加入辅料混匀,制粒,干燥,即得.
实施例3:胶囊剂的制备
称取大蓟600g、小蓟300g、广东紫珠200g、荷叶200g,加8倍量水煎煮提取二次,每次3小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度1.35~1.38(60℃)的稠膏,加入辅料混匀,制粒,干燥,装入胶囊,即得。
蓟荷止血片药效学试验研究资料及文献资料
摘要:蓟荷止血片高(8g生药/kg)、中剂量(4g生药/kg)均可明显缩短小鼠出血时间,提示蓟荷止血片对于剪尾所致的小鼠出血有明显的止血作用;蓟荷止血片高(8g生药/kg)、中(4g生药/kg)、低(2g生药/kg)剂量和阳性均可明显缩短小鼠凝血时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用;蓟荷止血片高(6g生药/kg)、中(3g生药/kg)、低剂量(1.5g生药/kg)可明显缩短大鼠复钙时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用;蓟荷止血片高、中、低剂量均可明显缩短小鼠出、凝血时间,提示蓟荷止血片对于肝素所致的有出血倾向小鼠出血有明显的止血作用;蓟荷止血片高、中剂量可明显减少小鼠溃疡个数,高剂量还可使出血小鼠的个数减少,出血程度减轻,提示蓟荷止血片对于小鼠胃溃疡出血有一定的止血作用;蓟荷止血片高、中、低剂量对凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、血小板数量均无明显影响;蓟荷止血片高、中、低剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显影响;对小鼠腹腔毛细血管通透性有明显影响。提示蓟荷止血片有一定的抗炎作用。
试验材料:
1、试验动物:
昆明种小鼠,17-25g,♀♂兼有,江西医学院实验动物中心提供,合格证号:021-9602。
SD大鼠,170-230g,♀♂兼有,江西医学院实验动物中心提供,合格证号:021-9602。
2、药物与试剂:
(1)受试药物:蓟荷浸膏:1.375g生药/浸膏,1.1g/ml,由江西省振源医药科技有限公司提供,批号:040301。
药物配制(小鼠用):
高剂量:8.0g生药/kg,0.40g生药/ml,准确称取浸膏14.54g,+蒸馏水至50ml,充分搅匀;
中剂量:4.0g生药/kg,0.20g生药/ml,准确称取浸膏7.27g,+蒸馏水至50ml,充分搅匀;
低剂量:2.0g生药/kg,0.10g生药/ml,准确称取浸膏3.64g,+蒸馏水至50ml,充分搅匀;
大鼠用:
高剂量:6.0g生药/kg,0.60g生药/ml,准确称取浸膏65.46g,+蒸馏水至150ml,充分搅匀;
中剂量:3.0g生药/kg,0.30g生药/ml,准确称取浸膏32.73g,+蒸馏水至150ml,充分搅匀;
低剂量:1.5g生药/kg,0.15g生药/ml,准确称取浸膏16.36g,+蒸馏水至150ml,充分搅匀;
(2)阳性药:断血流颗粒(10g/袋,安徽省天康药业有限公司批号:030303),人临床用量:一次一袋,一日三次。折算成小鼠用量约为6g颗粒/kg体重。方法:准确称取断血流颗粒15g,+蒸馏水至50ml,充分搅匀。
(3)利血平注射液:广东邦民制药有限公司,批号:040308,规格:1mg/ml。
(4)0.5%福尔马林溶液。
(5)盐酸雷尼替丁胶囊,杭州塞诺菲圣德拉堡民生制药有限公司,批号:856,一粒含雷尼替丁为0.15g,加蒸馏水至50ml,充分搅匀。
(6)肝素钠注射液:南京新天生物化学制药有限公司,批号:010506,12500单位/ml,配制方法:取1ml+生理盐水至200ml,即62.5单位/ml。
(7)二甲苯:南昌洪都试剂化工厂,批号:020121,规格:500ml/瓶。
(8)醋酸泼尼松片:天津天药药业股份有限公司,批号:040512,规格5mg/片。取60mg,加蒸馏水之100ml,充分搅匀。
(9)依文思蓝:进口分装,国药集团化学试剂有限公司,批号:F20040213,规格:10g/瓶。
(10)冰乙酸:上海试剂厂,批号:82-06-03,规格:500ml/瓶。
3、给药容量:小鼠20ml/kg体重,大鼠10ml/kg体重。
4、仪器与设备:Beckman-ACL7000凝血酶原测定仪,美国Beckman公司产品;Sysmex-XE2100全血仪,日本产品。
5、统计处理
采用SPSS统计软件进行统计处理,方差齐同用LSD检验,不齐用Dunnett T3检验。
试验方法与结果:
一、蓟荷止血片对正常小鼠出血时间的影响(剪尾法)[1]
试验目的:通过测定小鼠剪尾后的出血时间,了解蓟荷止血片的止血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠75只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次给药30分钟后,用利剪在距小鼠尾尖部约3mm处剪断,等有血自然流出开始记时,每30秒用滤纸轻轻擦去血液,至小鼠不再出血为止,此间时间即为出血时间。
表1对正常小鼠出血时间的影响
与生理盐水组比较,△▲P<0.05,▲▲△P<0.01,▲▲▲P<0.001;
从表1可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中剂量均可明显缩短小鼠出血时间,提示蓟荷止血片对于剪尾所致的小鼠出血有明显的止血作用。
二、蓟荷止血片对正常小鼠凝血时间的影响
(一)(玻片法)[2]
试验目的:通过玻片法观察小鼠体外凝血时间,了解蓟荷止血片的促凝血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠80只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次30分钟后,用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球,即有血液流出,于载玻片上滴一滴血,血滴直径在5mm左右,立即用秒表记时,每隔30秒用清洁大头针自血滴边缘向里轻挑动一次,并观察有无血丝,从采血开始至挑起血丝止,所历时间即为凝血时间。
表2对正常小鼠凝血时间影响
与生理盐水组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;
从表2可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量和阳性均可明显缩短小鼠凝血时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用。
(二)(毛细玻管片法)[2,3]
试验目的:通过毛细玻管法观察小鼠体外凝血时间,了解蓟荷止血片的促凝血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠90只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次用玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛,深约4-5mm,轻轻转动再缩回,自血液流入管内开始计时,血液注满后平放于桌子上,每隔30秒折断两端0.5cm,并缓慢向左右拉开,观察折断处是否有血凝丝,至血凝丝止,所历时间即为凝血时间。
表3对正常小鼠凝血时间影响
与生理盐水组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;
从表3可看出,与空白组比较,蓟荷止血片中剂量可明显缩短小鼠凝血时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用。
三、对大鼠血浆复钙时间的影响[4]
试验目的:通过观察加钙以后血浆凝固所需要的时间,了解蓟荷止血片的促凝血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:SD大鼠,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒10ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次给药后0.5h,大鼠静脉取血4.5ml装入含有0.5ml枸橼酸钠试管中,混匀。1000rpm离心10min,取血浆备用。空白试管2支,每管分别加入0.1ml血浆和0.1ml生理盐水,摇匀即放入37℃水浴锅孵育1min后,再加入0.1ml 1.25%CaCl2溶液,混匀。重放入水浴锅立即计时直至出现弥漫白色颗粒。取两管时间的平均值。
表4对正常大鼠血浆复钙时间影响
与生理盐水组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;
从表4可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量可明显缩短大鼠复钙时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用。
四、对肝素所致出血倾向小鼠出、凝血时间的影响
(一)对出血时间的影响[5]
试验目的:通过测定给肝素小鼠剪尾后的出血时间,了解蓟荷止血片对于有出血倾向小鼠的止血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠80只,雌雄兼有,按体重随机分为6组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)、模型组和生理盐水组。
2、除空白组、模型组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次空白组灌胃后30min,尾静脉注射生理盐水0.1ml/10g,其他组灌胃后30min,尾静脉注射62.5单位/ml肝素钠注射液0.1ml/10g,以上小鼠15min后剪尾法测其出血时间。
表5对肝素所致出血倾向小鼠出血时间的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型组比较,▲P<0.05,▲ ▲P<0.01,▲▲▲P<0.001。
从表5可看出,与空白组比较,模型组小鼠出血时间明显延长,说明造模是成功的,蓟荷止血片高、中、低剂量均可明显缩短小鼠出血时间,提示蓟荷止血片对于肝素所致的有出血倾向小鼠出血有明显的止血作用。
(二)对凝血时间的影响[5]
试验目的:通过测定给肝素小鼠凝血时间,了解蓟荷止血片对于有出血倾向小鼠的促凝血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠72只,雌雄兼有,按体重随机分为6组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)、模型组和生理盐水组。
2、除空白组、模型组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次空白组灌胃后30min,尾静脉注射生理盐水0.1ml/10g,其他组灌胃后30min,尾静脉注射62.5单位/ml肝素钠注射液0.1ml/10g,以上小鼠15min后毛细玻管法测其凝血时间。
表6对肝素所致出血倾向小鼠凝血时间的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型组比较,▲P<0.05,▲ ▲P<0.01,▲▲▲P<0.001。
从表6可看出,与空白组比较,模型组小鼠凝血时间明显延长,说明造模是成功的,蓟荷止血片高、中、低剂量均可明显缩短小鼠出血时间,提示蓟荷止血片对于肝素所致的有出血倾向小鼠出血有明显的促凝血作用。
五、对胃出血模型小鼠的影响[6]
试验目的:通过观察用药后胃出血模型小鼠胃中溃疡点数和出血情况,了解蓟荷止血片的胃出血的止血作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠72只,雌雄兼有,按体重随机分为6组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(雷尼替丁胶囊)、模型组和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药三天,每天一次;第四天各组给与相应的药物10ml/kg,给药后2小时腹腔注射利血平10mg/kg,之后2小时再按上述剂量给药一次。利血平注射后6小时以0.5%福尔马林(1ml/只)灌胃固定,30分钟后拉颈处死,摘取胃观察胃粘膜溃疡点数。
表7对胃出血模型小鼠溃疡个数的影响
表8对胃出血模型小鼠出血情况的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型组比较,▲P<0.05,▲ ▲P<0.01,▲▲▲P<0.001。
从表7、8可看出,与模型空白组比较,蓟荷止血片高、中剂量可明显减少小鼠溃疡个数,高剂量还可使出血小鼠的个数减少,出血程度减轻,提示蓟荷止血片对于小鼠胃溃疡出血有一定的止血作用。
六、对凝血酶原时间和部分凝血酶原时间的影响
试验目的:通过测定大鼠凝血酶原时间和部分凝血酶原时间,了解蓟荷止血片的对外凝系统的影响。
试验方法与结果:
1、动物分组:SD大鼠70只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液10ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒10ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次灌胃后一小时腹腔注射3%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉,剪开胸腔,心脏取血约2ml,送医院进行凝血活酶和部分凝血活酶时间测定。
表9对正常大鼠出血凝血酶原时间和部分凝血酶原时间的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;
从表9可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量对凝血酶原时间和部分凝血酶原时间均无明显影响。
七、蓟荷止血片对正常小鼠血小板数量的影响
试验目的:通过测定给药后小鼠血液中血小板的数量,了解蓟荷止血片的止血作用是否与血小板有关。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠75只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(断血流颗粒)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig断血流颗粒20ml/kg,连续给药四天,每天一次;末次给药30分钟后,摘眼球取血送医院进行血小板计数。
表10对正常小鼠血小板数量的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;
从表10可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量对血小板均无明显影响。
八、对小鼠抗炎作用的影响
(一)耳廓肿胀法[7]:
试验目的:通过观察用药后对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的肿胀度情况,了解蓟荷止血片的抗炎作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠75只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(醋酸泼尼松片)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig醋酸泼尼松片20ml/kg,连续给药七天,每天一次;末次给药后1小时,动物用乙醚麻醉,在右耳的前后两面涂布致炎剂二甲苯,每只小鼠0.02ml,左耳不作任何处理。4小时后,将动物处死,剪下双耳用8mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,电子天平称重。肿胀度按下述公式计算:肿胀度=右耳片重量-左耳片重量。
表11对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;
从表11可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显影响。
(二)对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响[8]:
试验目的:给小鼠腹腔内注射稀醋酸溶液,在H+的刺激下,腹腔内毛细血管通透性增加,血液内液体成分从血管内向腹腔渗出,当静脉内注射依文思蓝,该染料可与血浆蛋白发生瞬间结合,而随体液成分渗入腹腔,测量腹腔内染料量,可代表炎性渗出的多少。本试验通过比较小鼠腹腔渗入之染料量,来衡量药物的抗炎作用。
试验方法与结果:
1、动物分组:昆明种小鼠50只,雌雄兼有,按体重随机分为5组,即蓟荷止血片高、中、低剂量组,阳性药组(醋酸泼尼松片)和生理盐水组。
2、除空白组igNS外,高剂量组动物ig高浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,低剂量组动物ig低浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,中剂量组动物ig中浓度蓟荷止血片药液20ml/kg,阳性药组ig醋酸泼尼松片20ml/kg,连续给药七天,每天一次,末次药后1小时各鼠iv 0.1ml/10g 1%伊文斯兰溶液,同时ip 0.6%醋酸溶液0.2ml/只,20min后处死小鼠,用5ml生理盐水冲洗小鼠腹腔,收集冲洗液,3000rpm离心15min,取上清液用722分光光度计于590nm处比色测定光密度值。
表12对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
与生理盐水组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;
从表12可看出,与空白组比较,蓟荷止血片高、中、低剂量对小鼠腹腔毛细血管通透性有明显影响。
结论
(1)蓟荷止血片高、中剂量均可明显缩短小鼠出血时间,提示蓟荷止血片对于剪尾所致的小鼠出血有明显的止血作用。
(2)蓟荷止血片高、中、低剂量和阳性均可明显缩短小鼠凝血时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用。
(3)蓟荷止血片高、中、低剂量可明显缩短大鼠复钙时间,提示蓟荷止血片有一定的促凝作用。
(4)蓟荷止血片高、中、低剂量均可明显缩短小鼠出、凝血时间,提示蓟荷止血片对于肝素所致的有出血倾向小鼠出血有明显的止血作用。
(5)蓟荷止血片高、中剂量可明显减少小鼠溃疡个数,高剂量还可使出血小鼠的个数减少,出血程度减轻,提示蓟荷止血片对于小鼠胃溃疡出血有一定的止血作用。
(6)蓟荷止血片高、中、低剂量对凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、血小板数量均无明显影响。
(7)蓟荷止血片高、中、低剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显影响;对小鼠腹腔毛细血管通透性有明显影响。提示蓟荷止血片有一定的抗炎作用。