CN105572261A - 建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法，该方法采用超高效液相色谱法建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱，包括以下步骤：1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；2)制备朝藿定C对照品溶液：3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱，并限定了所述超高效液相色谱仪的色谱条件。本发明还提供了上述技术UPLC来检测该产品质量的方法，利用了在不同时间段采用不同的检测波长以更好地实现仙灵骨葆胶囊中化学成分的检测；与现有仙灵骨葆胶囊指纹图谱研究相比，能检出更多的特征成分；同时，缩减了分析时间，减少了溶剂的消耗。

Description

建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量的检测领域，具体涉及建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法，本发明还涉及所述仙灵骨葆胶囊的质量检测方法。

背景技术

中药复方制剂“仙灵骨葆”胶囊是由著名骨伤科专家时光达教授依据中医学“肾主骨”的骨代谢平衡理论，在苗族民间验方的基础上，结合多年临床验证筛选后研制而成。它是由淫羊藿、续断、丹参、补骨脂、知母、地黄六味中药组成的复方中成药制剂。淫羊藿，别名仙灵脾，其性温，味辛、甘，归肾、肝经，补肾精，强筋骨。续断，其性微温，味辛、甘、苦，归肾、肝经，补肝肾，行血脉，续筋骨。补骨脂，其性大温，味辛、苦，归肾、脾经，补肾壮阳，固精缩尿。地黄，其性微温，味甘，归肾、肝经，养血滋阴，补精益髓。丹参，其性微寒，味苦，益气养血，活血化瘀。知母，其性寒，味苦、甘，活血化瘀，滋阴润燥。方中以淫羊藿、续断、补骨脂、地黄补精填髓，强精壮骨；由于有瘀血阻滞脉络不通，不通则痛，气血失去滋养，则以丹参、知母益气活血，化瘀，瘀去则新生，通则不痛。全方以补肾壮骨为主，兼以活血化瘀，以达到标本兼治之效。

通过现代循证医学原则——“随机分组、双盲对照，多中心观察”进行的临床实验，确认了“仙灵骨葆”胶囊抗骨质疏松的临床疗效及其安全性。2007年，美国药品评价机构信纳克医学研究中心按照循证医学原理，对仙灵骨葆的临床药效进行了确认，随后，又启动了仙灵骨葆在美国的FDA认证程序。这是我国第一个按照国际通行药品验证标准和美国食品药品监督管理局(FDA)标准评定的中药相关实验。仙灵骨葆胶囊已入选《国家基本药物目录》(2009版)。在临床上，仙灵骨葆主要用于骨质疏松症的预防和治疗。但是，到目前为止，对于仙灵骨葆的质量标准较低，现行国家食品药品监督管理局药品标准(试行)(WS-10269(ZD-0269)-2002)，仅对其中单个成分淫羊藿苷的含量进行了规定，即“每克仙灵骨葆胶囊粉末中淫羊藿苷的含量不低于3毫克”。根据2010年药典编制大纲提出中成药及中药材应“逐步由单一指标性成分定性定量测定，向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化”。其中，在对鉴定的技术要求中指出，所采用的色谱特征图谱，“应至少指认其中3个以上的有效成分、特征成分或主成分并对其比例作出规定，而指认峰的峰面积之和应大于总峰面积的50％。”(参见2010年版《中华人民共和国药典》一部提取物质量标准起草技术要求)。

为此，有必要建立一种稳定、精密度高的多成分和特征指纹图谱，用以科学、有效地检测中药复方制剂仙灵骨葆胶囊的质量。该指纹图谱应具有以下几个特点：

1、至少应指认出指纹图谱中3个以上的色谱峰，指认色谱峰的峰面积之和应大于总峰面积的50％；

2、指认的色谱峰应能覆盖复方中的组成中药；

3、指认的色谱峰应当覆盖与组方(复方)功效大体相应的活性成分。

发明内容

为解决现有技术存在的问题与不足，本发明的主要目的在于为包含淫羊藿、续断、补骨脂、丹参、知母、地黄六味中药的复方仙灵骨葆胶囊提供一

种基于指纹图谱技术的简便、稳定、精密度高的整体质量检测方法。

本发明的再一目的是提供建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱及其标准指纹图谱的方法。

本发明的主要目的通过下列技术方案实现：本发明提供了建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法，该方法采用超高效液相色谱法建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱，包括以下步骤：

1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

2)制备朝藿定C对照品溶液：

3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件是：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含体积分数为0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D，2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D，3.5-5min15.5％-20.5％D，5-5.5min20.5％-22.5％D，5.5-6min22.5％-23.5％D，6-7.5min23.5％-28％D，7.5-8min28％-28％D，8-9min28％-37％D，9-10min37％-38％D，10-12min38％-50％D，12-12.8min50％-65％D，12.8-14.3min65％-65％D，14.3-15min65％-100％D，15-16min100％-100％D，16-16.5min100％-2％D，16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL；以朝藿定C计算，理论塔板数在5000-8000范围之内。

优选的，所述制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液的步骤还包括将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/mL，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。

进一步地，本发明提供了建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱的方法，该方法采用超高效液相色谱法建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱，其中所述标准指纹图谱含有28个色谱峰，峰面积总和占总峰面积80％以上；所述方法包括以下步骤：

1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

2)制备朝藿定C对照品溶液：

3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件是：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含体积分数为0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D，2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D，3.5-5min15.5％-20.5％D，5-5.5min20.5％-22.5％D，5.5-6min22.5％-23.5％D，6-7.5min23.5％-28％D，7.5-8min28％-28％D，8-9min28％-37％D，9-10min37％-38％D，10-12min38％-50％D，12-12.8min50％-65％D，12.8-14.3min65％-65％D，14.3-15min65％-100％D，15-16min100％-100％D，16-16.5min100％-2％D，16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL；以朝藿定C计算，理论塔板数在5000-8000范围之内。

优选的，所述制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液的步骤还包括将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/mL，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。

优选的，所述方法还包括确定所述标准指纹图谱的重现性的步骤。通过对6份仙灵骨葆胶囊内容物的指纹图谱进行相似性分析，所述标准指纹图谱的相似度不低于0.99。

更进一步地，本发明还提供了检测仙灵骨葆胶囊的质量的方法，包括采用上述方法建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱；

然后按照采用上述方法建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱；

最后将供试品仙灵骨葆胶囊的指纹图谱与标准图谱进行比较。

具体地，在本发明的仙灵骨葆胶囊的质量检测方法中，仙灵骨葆胶囊指纹图谱的建立包括以下步骤：

-将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/ml，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。在一个具体实施方式中，取仙灵骨葆胶囊内容物，精密称定约0.10000g，置5mL容量瓶中，加入体积分数为60％甲醇约4mL，超声处理(功率150W，频率40kHz)30min，取出，放冷至室温，用60％甲醇定容，摇匀，提取液于10000rpm离心1min，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

-取朝藿定C对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有朝藿定C1mg的溶液，即得朝藿定C对照品溶液；

-精密取上述供试品及对照品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

-以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱。

注：指纹图谱中的28个色谱峰的化学结构已经被准确指认，其中补骨脂苷、异补骨脂苷、双叶淫羊藿B、大花淫羊藿苷F、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷A、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II是从仙灵骨葆胶囊中富集并分离得到，木兰碱、当药苷、马钱苷酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芒果苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿次苷、补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、淫羊藿次苷Ⅱ、新补骨脂异黄酮、补骨脂定、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifolA、补骨脂酚购于上海融禾生物科技有限公司。以朝藿定C的色谱保留时间和峰面积为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及色谱峰对应的化学物质依次是：

1号峰：马钱苷酸0.227±0.001；0.152±0.079

2号峰：木兰碱0.318±0.002；0.193±0.054

3号峰：当药苷0.332±0.001；0.140±0.052

4号峰：补骨脂苷0.432±0.001；0.476±0.199

5号峰：异补骨脂苷0.477±0.001；0.310±0.137

6号峰：芒果苷0.508±0.001；0.068±0.027

7号峰：双叶淫羊藿B0.852±0.001；0.061±0.019

8号峰：补骨脂素0.885±0.001；0.127±0.096

9号峰：异补骨脂素0.918±0.001；0.131±0.119

10号峰：朝藿定A0.962±0.001；0.057±0.028

11号峰：丹酚酸B0.971±0.001；0.109±0.044

12号峰：朝藿定B0.983±0.001；0.084±0.056

13号峰：朝藿定C1.00；1.00

14号峰：淫羊藿苷1.019±0.001；0.412±0.176

15号峰：大花淫羊藿苷F1.216±0.001；0.101±0.082

16号峰：大花淫羊藿苷B1.265±0.004；0.018±0.005

17号峰：大花淫羊藿苷A1.313±0.001；0.075±0.035

18号峰：2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II1.377±0.001；0.420±0.130

19号峰：淫羊藿次苷Ⅱ1.459±0.001；0.077±0.031

20号峰：异补骨脂二氢黄酮1.475±0.001；0.020±0.007

21号峰：新补骨脂异黄酮1.528±0.001；0.192±0.071

22号峰：补骨脂宁1.572±0.001；0.014±0.005

23号峰：补骨脂二氢黄酮甲醚1.657±0.001；0.124±0.044

24号峰：补骨脂定1.701±0.002；0.044±0.018

25号峰：补骨脂乙素1.712±0.002；0.022±0.015

26号峰：丹参酮ⅡA1.732±0.002；0.016±0.017

27号峰：corylifolA1.740±0.002；0.070±0.019

28号峰：补骨脂酚1.823±0.002；1.934±0.618

上述化学结构已经被准确指认的色谱峰的峰面积总和占总峰面积81.77％。

本发明对由淫羊藿、续断、补骨脂、丹参、知母、地黄六味中药组成的复方仙灵骨葆胶囊，建立了覆盖该复方组方中药的28个主要特征峰的、组方来源清楚并且得到明确的化学指认的指纹图谱。因此，本发明提供了仙灵骨葆的指纹图谱，包括28个色谱峰，所述28个色谱峰的峰面积总和占总峰面积为81.77％。所述28个色谱峰的化合物鉴定为以下28种化合物：马钱苷酸、木兰碱、当药苷、补骨脂苷、异补骨脂苷、芒果苷、双叶淫羊藿B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定A、丹酚酸B、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、大花淫羊藿苷F、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷A、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II、淫羊藿次苷Ⅱ、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂乙素、丹参酮ⅡA、corylifolA、补骨脂酚。

更进一步地，本发明还提供了上述方法获得的标准指纹图谱在检测仙灵骨葆胶囊的质量中的应用。可以将该指纹图谱与标准指纹图谱进行相似性分析。

本发明的仙灵骨葆胶囊的质量检测方法能够用于鉴定由淫羊藿、续断、补骨脂、丹参、知母、地黄组成的复方仙灵骨葆胶囊的质量。发明人应用指纹图谱对市售中药复方制剂仙灵骨葆胶囊的质量进行了分析。

本发明的有益效果：

本发明利用在不同时间段采用不同的检测波长(0-7.6min，254nm；7.6-18min，270nm)的方法，更好地实现仙灵骨葆胶囊中多种化学成分的同时检测；

对28个色谱峰进行了化学指认，与之前的仙灵骨葆胶囊指纹图谱研究相比，能检出更多的特征成分，如马钱苷酸；

之前的仙灵骨葆胶囊指纹图谱研究对28批市售制剂进行质量评价，相似度在0.952以上，本发明对16批市售制剂进行质量评价，相似度在0.959以上，两者评价效果相当，但是本发明对一批制剂的分析仅用18min，若对20批制剂进行分析，以之前的方法需耗时42小时(以每天工作8小时计算，需分5个工作日才能完成)，而使用本发明提供的新方法仅需6小时(一个工作日内即可完成)，大大缩减了分析时间，使得大样本抽样检测，实时监控产品的质量成为可能；此外，在有机溶剂使用方面，之前的方法需消耗有机溶剂约2L，而本发明仅需其十分之一，大大减少了溶剂的消耗，更加节能环保。

附图说明

图14种不同的色谱柱分析图；

图24种不同的流动相体系分析图；

图33种不同的色谱柱柱温分析图；

图44种不同的洗脱梯度分析图；

图5仙灵骨葆胶囊不同比例溶剂提取后的UPLC图谱；

图6仙灵骨葆胶囊经不同超声时间提取后的UPLC图谱；

图7是仙灵骨葆胶囊指纹图谱和28个混合对照品的UPLC图谱，并且示出了图谱中色谱峰的中药来源；其中，★来源于淫羊藿色谱峰▲来源于补骨脂色谱峰◆来源于续断色谱峰●来源于丹参色谱峰■来源于知母色谱峰；

图8示出了图7中对应28个主要色谱峰的1-28个化合物的化学结构；

图9示出了仙灵骨葆胶囊的UPLC指纹图谱的稳定性(重现性)；

图10示出了16批市售中药复方制剂仙灵骨葆胶囊的UPLC指纹图谱的叠加图；

图11示出了仙灵骨葆对照指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实施方式并不局限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1UPLC色谱条件摸索及优化

1.考察不同色谱柱

分别考察了AcquityUPLCBEHShieldRPC18柱(2.1×50mm,1.7μm)，AcquityUPLCBEHPhenyl(2.1×50mm,1.7μm)，AcquityUPLCHSST3柱(2.1×50mm,1.8μm)，AcquityUPLCBEHAmide(2.1×50mm,1.7μm)4种不同的色谱柱，结果如图1所示。由图1可以看出，色谱柱AcquityUPLCBEHShieldRPC18柱的分离效果及色谱峰个数明显优于其他色谱柱，因此选择AcquityUPLCBEHShieldRPC18作为仙灵骨葆指纹图谱分析用色谱柱。

2.考察不同流动相体系

分别考察了ACN-H2O(各含0.1％FA)，ACN-H2O，MeOH-H2O(各含0.1％FA)，MeOH-H2O4种不同的流动相体系，结果如图2所示。由图2可以看出，当流动相为ACN-H2O(各含0.1％FA)时，色谱峰的分离效果，色谱峰个数明显优于其他流动相系统，因此选择ACN-H2O(各含0.1％FA)作为仙灵骨葆指纹图谱分析用流动相。

3.考察不同柱温

分别考察30℃，35℃，40℃3种不同的色谱柱柱温，结果如图3所示。由图3可以看出，柱温为30℃时，色谱峰的响应值，色谱峰个数及分离度明显优于其他柱温，因此选择30℃作为仙灵骨葆指纹图谱分析用柱温。

4.考察不同洗脱梯度

分别考察了4种不同的洗脱梯度，具体比例如下：

梯度1：0-2min5％-15％D,2-3.5min15％-15％D,3.5-6min15％-23％D,6-7.5min23％-23％D,7.5-9.5min23％-27％D,9.5-10.5min27％-40％D,10.5-11min40％-50％D,11-13min50％-51％D,13-14min51％-58％D,14-16min58％-100％D,16-18min100％-5％D,18-19min5％-5％D；

梯度2：0-2min:2％-10％D,2-4min10％-12％D,4-6.5min12％-24％D,6.5-8.5min24％-25％D,8.5-9min25％-29％D,9-10.5min29％-31％D,10.5-12min31％-37％D,12-14min37％-38％D,14-15min38％-55％D,15-18min55％-100％D；

梯度3：0-1.5min:2％-10％D,1.5-3min10％-12％D,3-4.5min12％-22％D,4.5-6.5min22％-22％D,6.5-8min22％-28％D,8-9.5min28％-29％D,9.5-11min29％-40％D,11-13min40％-40％D,13-17min40％-100％D；

梯度4：0-2min2％-9％D,2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D,3.5-5min15.5％-20.5％D,5-5.5min20.5％-22.5％D,5.5-6min22.5％-23.5％D,6-7.5min23.5％-28％D,7.5-8min28％-28％D,8-9min28％-37％D,9-10min37％-38％D,10-12min38％-50％D,12-12.8min50％-65％D,12.8-14.3min65％-65％D,14.3-15min65％-100％D,15-16min100％-100％D,16-16.5min100％-2％D,16.5-18min2％-2％D；

考察结果如图4所示。由图4可以看出，当洗脱梯度为梯度4时，色谱峰的峰形、分离效果及出峰时间最佳，因此选择梯度4作为最终的洗脱梯度。

因此最终确定仙灵骨葆UPLC指纹图谱色谱条件为：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含0.1％甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D,2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D,3.5-5min15.5％-20.5％D,5-5.5min20.5％-22.5％D,5.5-6min22.5％-23.5％D,6-7.5min23.5％-28％D,7.5-8min28％-28％D,8-9min28％-37％D,9-10min37％-38％D,10-12min38％-50％D,12-12.8min50％-65％D,12.8-14.3min65％-65％D,14.3-15min65％-100％D,15-16min100％-100％D,16-16.5min100％-2％D,16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL。

与现有技术相比，大大缩减了分析时间，李晓龙等建立了XLGB的HPLC指纹图谱，分析时间为80min；程红等建立了XLGB的HPLC指纹图谱，分析时间为125min；而本发明建立了XLGB的UPLC指纹图谱，分析时间仅为18min，从而大大降低了单位样本的检测时间，适用于实际生产过程中对大量样本的即时检测分析。

李晓龙等建立了XLGB的HPLC指纹图谱，流速为1mL/min；程红等建立了XLGB的HPLC指纹图谱，流速为0.8mL/min；而本发明建立的UPLC指纹图谱，流速为0.5mL/min，可以大大减少有机溶剂的使用量，更加节能环保。

实施例2样品的前处理方法考察

1.考察不同比例提取溶剂

取批号为1308031的仙灵骨葆胶囊，精密称定8份，每份约0.10000g。如表1所示，将8份仙灵骨葆胶囊分别置于5mL容量瓶中，并分别加入不同比例的提取溶剂(水、30％甲醇-水、60％甲醇-水和甲醇)4mL，室温下超声(功率150W，频率40kHz)30min，取出后放冷至室温，以提取溶剂定容。摇匀后转移至10mL离心管中，10000rpm离心1分钟，取上清液过0.22：μm微孔滤膜，续滤液供UPLC分析，测试图谱如图5所示。

表1不同比例提取溶剂的考察

通过比较仙灵骨葆胶囊经水、30％甲醇-水、60％甲醇-水、甲醇不同溶剂提取后的UPLC图谱，发现以60％甲醇-水作为提取溶剂能同时兼顾仙灵骨葆胶囊中最多不同极性的化合物出峰且对各色谱峰的提取率均最高，因此选用60％甲醇-水作为提取溶剂。

2.考察不同超声时间

取批号为1308031的仙灵骨葆胶囊，精密称定8份，每份约0.10000g。如表2所示，将6份仙灵骨葆胶囊分别置于5mL容量瓶中，加入4mL60％甲醇-水，室温下分别超声(功率150W，频率40kHz)提取15min、30min、60min，取出后放冷至室温，以提取溶剂定容。摇匀后转移至10mL离心管中，10000rpm离心1分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，续滤液供UPLC分析，测试图谱如图6所示。

表2不同超声时间的考察

通过比较仙灵骨葆胶囊以60％甲醇-水超声提取15min、30min、45min后的UPLC图谱，发现以60％甲醇-水作为提取溶剂，当超声时间达到30min时，各色谱峰的峰高均已达到最大值，且谱图展示度良好，因此选用超声30min。

综上，确定样品的前处理方法为：以60％甲醇-水作为提取溶剂，超声提取30min。

实施例3供试品溶液的制备

取仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，批号为1308031)内容物，精密称量约0.10000g，置于5mL容量瓶中，加入体积分数为60％甲醇约4mL，超声处理(功率150W，频率40kHz)30min，取出，放冷至室温，用60％甲醇定容(至10mL)，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/mL，摇匀，提取液于10000rpm离心1min，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。

实施例4对照品溶液的制备

取各对照品(即将28种单体化合物混合在一起形成的混合对照品溶液)适量，以适量甲醇溶解，分别配置成储备液后，再混合制得混合对照品溶液。

实施例5建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱的方法

1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液(同实施例3)；

2)制备朝藿定C对照品溶液(同实施例4)；

3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件是：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含体积分数为0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D，2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D，3.5-5min15.5％-20.5％D，5-5.5min20.5％-22.5％D，5.5-6min22.5％-23.5％D，6-7.5min23.5％-28％D，7.5-8min28％-28％D，8-9min28％-37％D，9-10min37％-38％D，10-12min38％-50％D，12-12.8min50％-65％D，12.8-14.3min65％-65％D，14.3-15min65％-100％D，15-16min100％-100％D，16-16.5min100％-2％D，16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL；以朝藿定C计算，理论塔板数在5000-8000范围之内。

具体指纹图谱如图7所示。该标准指纹图谱含有28个色谱峰，所述28个色谱峰鉴定为马钱苷酸、木兰碱、当药苷、补骨脂苷、异补骨脂苷、芒果苷、双叶淫羊藿B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定A、丹酚酸B、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、大花淫羊藿苷F、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷A、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II、淫羊藿次苷Ⅱ、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂乙素、丹参酮ⅡA、corylifolA、补骨脂酚。

该指纹图谱中的28个色谱峰的化学结构已经被准确指认，如图8所示。以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为马钱苷酸0.227±0.001、木兰碱0.318±0.002、当药苷0.332±0.001、补骨脂苷0.432±0.001、异补骨脂苷0.477±0.001、芒果苷0.508±0.001、双叶淫羊藿B0.852±0.001、补骨脂素0.885±0.001、异补骨脂素0.918±0.001、朝藿定A0.962±0.001、丹酚酸B0.971±0.001、朝藿定B0.983±0.001、朝藿定C1.00、淫羊藿苷1.019±0.001、大花淫羊藿苷F1.216±0.001、大花淫羊藿苷B1.265±0.004、大花淫羊藿苷A1.313±0.001、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II1.377±0.001、淫羊藿次苷Ⅱ1.459±0.001、异补骨脂二氢黄酮1.475±0.001、新补骨脂异黄酮1.528±0.001、补骨脂宁1.572±0.001、补骨脂二氢黄酮甲醚1.657±0.001、补骨脂定1.701±0.002、补骨脂乙素1.712±0.002、丹参酮ⅡA1.732±0.002、corylifolA1.740±0.002、补骨脂酚1.823±0.002。

实施例6检测仙灵骨葆胶囊的质量的方法

首先建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱(同实施例5)；

其次仙灵骨葆胶囊指纹图谱的建立包括以下步骤：

第一步将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/ml，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。在一个具体实施方式中，取仙灵骨葆胶囊内容物，精密称定约0.10000g，置5mL容量瓶中，加入体积分数为60％甲醇约4mL，超声处理(功率150W，频率40kHz)30min，取出，放冷至室温，用60％甲醇定容，摇匀，提取液于10000rpm离心1min，过

0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

第二步取朝藿定C对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有朝藿定C1mg的溶液，即得朝藿定C对照品溶液；

第三步精密取上述供试品及对照品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

第四步以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱。

注：指纹图谱中的28个色谱峰的化学结构已经被准确指认，其中补骨脂苷、异补骨脂苷、双叶淫羊藿B、大花淫羊藿苷F、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷A、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II是从仙灵骨葆胶囊中富集并分离得到，木兰碱、当药苷、马钱苷酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芒果苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿次苷、补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、淫羊藿次苷Ⅱ、新补骨脂异黄酮、补骨脂定、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifolA、补骨脂酚购于上海融禾生物科技有限公司。以朝藿定C的色谱保留时间和峰面积为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及色谱峰对应的化学物质依次是：

1号峰：马钱苷酸0.227±0.001；0.152±0.079

2号峰：木兰碱0.318±0.002；0.193±0.054

3号峰：当药苷0.332±0.001；0.140±0.052

4号峰：补骨脂苷0.432±0.001；0.476±0.199

5号峰：异补骨脂苷0.477±0.001；0.310±0.137

6号峰：芒果苷0.508±0.001；0.068±0.027

7号峰：双叶淫羊藿B0.852±0.001；0.061±0.019

8号峰：补骨脂素0.885±0.001；0.127±0.096

9号峰：异补骨脂素0.918±0.001；0.131±0.119

10号峰：朝藿定A0.962±0.001；0.057±0.028

11号峰：丹酚酸B0.971±0.001；0.109±0.044

12号峰：朝藿定B0.983±0.001；0.084±0.056

13号峰：朝藿定C1.00；1.00

14号峰：淫羊藿苷1.019±0.001；0.412±0.176

15号峰：大花淫羊藿苷F1.216±0.001；0.101±0.082

16号峰：大花淫羊藿苷B1.265±0.004；0.018±0.005

17号峰：大花淫羊藿苷A1.313±0.001；0.075±0.035

18号峰：2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II1.377±0.001；0.420±0.130

19号峰：淫羊藿次苷Ⅱ1.459±0.001；0.077±0.031

20号峰：异补骨脂二氢黄酮1.475±0.001；0.020±0.007

21号峰：新补骨脂异黄酮1.528±0.001；0.192±0.071

22号峰：补骨脂宁1.572±0.001；0.014±0.005

23号峰：补骨脂二氢黄酮甲醚1.657±0.001；0.124±0.044

24号峰：补骨脂定1.701±0.002；0.044±0.018

25号峰：补骨脂乙素1.712±0.002；0.022±0.015

26号峰：丹参酮ⅡA1.732±0.002；0.016±0.017

27号峰：corylifolA1.740±0.002；0.070±0.019

28号峰：补骨脂酚1.823±0.002；1.934±0.618

上述化学结构已经被准确指认的色谱峰的峰面积总和占总峰面积81.77％。

实施例7确定指纹图谱重现性

精密称取仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司)内容物6份，每份0.10000g，置5mL容量瓶中，加入体积分数为60％甲醇约4mL，超声处理(功率150W,频率40kHz)30min，取出，放冷至室温，用60％甲醇定容，摇匀，提取液于10000rpm离心1min，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得。采用实施例1中所述液相条件进行色谱分析，记录色谱图如图9所示。获得的UPLC指纹图谱中，20个主要色谱峰的相对保留时间的相对偏差均小于1.0％(见表3)，表明实施例1获得的UPLC指纹图谱具有较好的重现性。利用药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件计算，6份仙灵骨葆胶囊供试液的UPLC指纹图谱的相似度不低于0.99。

表3仙灵骨葆胶囊UPLC指纹图谱相对保留时间的稳定性

实施例8市售中药复方制剂仙灵骨葆胶囊的质量分析

仙灵骨葆胶囊为市售制剂(贵州同济堂制药有限公司，批号111031、1112009、1200074、1210049、1211130、1211131、1211132、1208074、1306072、1307120、1307121、1308031、1308032、1312065、1401028、1401055。

取仙灵骨葆胶囊内容物，精密称定约0.10000g，置5mL容量瓶中，加入体积分数为60％甲醇约4mL，超声处理(功率150W，频率40kHz)30min，取出，放冷至室温，用60％甲醇定容，摇匀，提取液于10000rpm离心1min，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得各批次制剂的供试液。

分别精密量取上述供试液2μL，采用实施例1中建立的色谱条件，注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图，如图10所示。使用药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件，生成对照指纹图谱，如图11，对16批市售仙灵骨葆制剂进行相似度评价，结果如表4所示，16批制剂指纹图谱的相似度均不低于0.95，只有3批制剂相较其他批次波动较大，相似度在0.97以下。

表416批市售仙灵骨葆胶囊UPLC指纹图谱的相似度

通过与标准指纹图谱的比较，可以确定16批市售制剂的相似度均不低于0.959。

之前的仙灵骨葆胶囊指纹图谱研究对28批市售制剂进行质量评价，相似度在0.952以上，本发明对16批市售制剂进行质量评价，相似度在0.959以上，两者评价效果相当，但是本发明对一批制剂的分析仅用18min，若对20批制剂进行分析，以之前的方法需耗时42小时(以每天工作8小时计算，需分5个工作日才能完成)，而使用本发明提供的新方法仅需6小时(一个工作日内即可完成)，大大缩减了分析时间，使得大样本抽样检测，实时监控产品的质量成为可能；此外，在有机溶剂使用方面，之前的方法需消耗有机溶剂约2L，而本发明仅需其十分之一，大大减少了溶剂的消耗，更加节能环保。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱，包括以下步骤：

1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

2)制备朝藿定C对照品溶液：

3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件是：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含体积分数为0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D，2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D，3.5-5min15.5％-20.5％D，5-5.5min20.5％-22.5％D，5.5-6min22.5％-23.5％D，6-7.5min23.5％-28％D，7.5-8min28％-28％D，8-9min28％-37％D，9-10min37％-38％D，10-12min38％-50％D，12-12.8min50％-65％D，12.8-14.3min65％-65％D，14.3-15min65％-100％D，15-16min100％-100％D，16-16.5min100％-2％D，16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL；以朝藿定C计算，理论塔板数在5000-8000范围之内。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液的步骤还包括将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/mL，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。

3.建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱，其中所述标准指纹图谱含有28个色谱峰，峰面积总和占总峰面积80％以上；所述方法包括以下步骤：

1)制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液；

2)制备朝藿定C对照品溶液：

3)采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；

4)以朝藿定C的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件是：采用AcquityUPLCBEHShieldRP18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；以乙腈(D)-水(C)(各含体积分数为0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱：0-2min2％-9％D，2-3min9％-12.5％D，3-3.5min12.5％-15.5％D，3.5-5min15.5％-20.5％D，5-5.5min20.5％-22.5％D，5.5-6min22.5％-23.5％D，6-7.5min23.5％-28％D，7.5-8min28％-28％D，8-9min28％-37％D，9-10min37％-38％D，10-12min38％-50％D，12-12.8min50％-65％D，12.8-14.3min65％-65％D，14.3-15min65％-100％D，15-16min100％-100％D，16-16.5min100％-2％D，16.5-18min2％-2％D；流速为0.5mL/min；检测波长：0～7.6min，254nm；7.6min～18min，270nm；色谱柱温度为30℃；进样量：2μL；以朝藿定C计算，理论塔板数在5000-8000范围之内。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备仙灵骨葆胶囊的供试品溶液的步骤还包括将仙灵骨葆胶囊内容物加入到体积分数为60％甲醇中，使得仙灵骨葆胶囊内容物的浓度为0.02g/mL，充分混合，离心，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得仙灵骨葆胶囊的供试品溶液。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包括确定所述标准指纹图谱的重现性的步骤。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述标准指纹图谱含有28个色谱峰，所述28个色谱峰鉴定为马钱苷酸、木兰碱、当药苷、补骨脂苷、异补骨脂苷、芒果苷、双叶淫羊藿B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定A、丹酚酸B、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、大花淫羊藿苷F、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷A、2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II、淫羊藿次苷Ⅱ、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂乙素、丹参酮ⅡA、corylifolA、补骨脂酚。

7.如权利要求3-6所述的方法获得的标准指纹图谱在检测仙灵骨葆胶囊的质量中的应用。

8.检测仙灵骨葆胶囊的质量的方法，包括采用权利要求3-6任意一项所述的方法建立仙灵骨葆胶囊的标准指纹图谱；

然后按照采用权利要求1或2所述的方法建立仙灵骨葆胶囊的指纹图谱；

最后将供试品仙灵骨葆胶囊的指纹图谱与标准图谱进行比较。