CN103156997B - 一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物,该组合物包括:毛蕊花糖苷、阿魏酸、皂苷、环烯醚萜苷、香豆素、木脂素、酚酸以及有机酸;以组合物的总重量为基础计,毛蕊花糖苷的含量为:0.157%-0.219%,阿魏酸的含量为:0.218%-0.306%;该组合物按如下方法制成:取北沙参、麦门冬、干生地、当归、枸杞子和川楝子6味原料药加水煎煮制得水煎液,该水煎液经大孔吸附树脂色谱柱,经极性溶剂洗脱,经低温浓缩,减压干燥而制成。此外,本发明还公开了该组合物的制备方法和应用。经试验验证,本发明中药有效部位组合物能显著降低模型大鼠肝组织胶原含量,减轻肝纤维化及肝损伤程度,有效阻止肝纤维化的发展,可用于防治各种慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化等病症。

Description

一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种中药组合物,尤其涉及一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物;此外,本发明还涉及该治疗慢性肝病的中药有效部位组合物的制备方法及其应用。
背景技术
肝硬化是多种慢性肝脏疾病的终末阶段,以弥漫性肝纤维化伴异常结节形成为其形态学特征。肝硬化是常见疾病和主要死亡病因之一。已有明确证据表明肝纤维化甚至肝硬化是可逆的,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的重要目标,但目前尚无FDA批准的抗肝纤维化化学或生物制剂进入临床应用。
美国肝纤维化研究权威Friedman教授曾指出:“肝纤维化机理的不断阐明使有效地抗肝纤维化治疗成为可能,然而,抗肝纤维化治疗仍然是一个富有挑战的艰巨任务,迄今为止临床上尚无有效的抗肝纤维化药物,其有效作用于肝脏而无明显毒副作用的治疗药物研制尚需长期努力。”
近二十多年来的中医药抗肝纤维化研究,已取得显著进展。自2000年起,已先后有复方鳖甲软肝片、扶正化瘀胶囊(片)等抗肝纤维化国家中药新药应用于临床,扶正化瘀片已被美国FDA批准在美国开展抗丙型肝炎肝纤维化II期临床试验。中药复方抗肝纤维化作用是通过多途径、多层次作用实现的,呈现出综合效应,与肝纤维化发生发展的复杂病理机制相适应,这也正是中医药整体观念的优势所在。
近二十多年来,国内外也开展了一些抗肝纤维化中药有效组分或成分的研究,并发现了一些有抗肝纤维化效应的中药有效组分或成分。然而,无论传统中药复方还是单一的有效成分,皆有其不足之处。传统中药复方由于成分复杂,质量控制困难,稳定性较差,这也是中药走向国际市场的难题之一;而单一组分或成分往往难以取得良好效应。因此如何对传统复方“去粗取精”而又保持中医复方配伍治疗复杂疾病的优势,是一大难题,也是中医药抗肝纤维化药物研究的重要发展方向之一。
“一贯煎”是清代著名中医学家魏玉璜所创,首见于《续名医类案·心胃痛门》。清·王孟英将其辑入《柳州医话》中。一贯煎由北沙参、麦门冬(又名麦冬)、干生地(又名生地黄)、当归、枸杞子和川楝子等6味中药组成,原方未著用量用法。目前方剂学教材中所列一贯煎的组方:北沙参,麦冬,当归(各9g),生地黄(18-30g),枸杞子(9-18g),川楝子(4.5g),水煎服。均与本发明的组成与制备方法有所不同。
以往的研究工作已经证实,对急、慢性肝损伤实验模型,一贯煎能有效改善肝功能,减轻肝细胞坏死,抑制肝脏纤维组织增生。本发明的前期研究结果显示,在CCl4诱导大鼠肝纤维化已形成阶段给予一贯煎能显著抑制肝硬化的形成,显著降低肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量及肝脏胶原纤维的增生程度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能提高抗肝纤维化、抗肝损伤作用,治疗慢性肝病的中药复方的有效提取部位,并提出该复方的有效提取部位的用途、制备方法。
本发明一方面提供一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物,该组合物包括:毛蕊花糖苷、阿魏酸、皂苷、环烯醚萜苷、香豆素、木脂素、酚酸以及有机酸;以组合物的总重量为基础计,所述毛蕊花糖苷的含量范围为:0.157%-0.219%,所述阿魏酸的含量范围为:0.218%-0.306%;该组合物按如下方法制成:取北沙参、麦门冬、干生地、当归、枸杞子和川楝子6味原料药材加水煎煮制得水煎液,该水煎液经大孔吸附树脂色谱柱,经极性溶剂洗脱,经低温浓缩,减压干燥而制成。
所述北沙参、麦门冬、当归、干生地、枸杞子和川楝子的重量比例为1∶1∶1∶(1.8-5)∶(1-2)∶(0.45-0.5)。
在本发明的另一方面,还提供上述中药有效部位组合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)水煎液的制备:
取原料药材饮片,加水8-10倍量煎煮三次,每次1小时至1.5小时,煎出液经适当浓缩,过滤得水煎液;
(2)有效部位的制备:
取上述水煎液上大孔吸附树脂色谱柱,装上样品一段时间后达吸附平衡,以水洗脱至经alfa-萘酚-浓硫酸试剂的显色反应呈阴性;然后以极性溶剂洗脱,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成。
优选的,步骤(2)中,所述大孔吸附树脂色谱柱中使用的大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂,选自D-101,HPD-100或DA-201。
优选的,步骤(2)中,所述极性溶剂为20-40%的乙醇水混合液。
优选的,步骤(2)中,所述的水煎液加上大孔吸附树脂色谱柱时的浓度为0.5-1.5克生药/毫升,上样量为1.0-3.0克生药/克干树脂;吸附时间为1-8小时。
此外,本发明还提供该中药有效部位组合物在制备治疗慢性肝炎药物中的应用,在制备防治肝损伤、肝纤维化药物中的应用,以及在制备防治肝硬化药物中的应用。
本发明对中药复方一贯煎治疗慢性肝损伤、肝纤维化的有效部位进行了筛选研究,明确了一贯煎治疗肝损伤、肝纤维化的有效部位,并对有效部位的制备工艺进行了研究,确立了有效部位的制备技术。经采用经典动物模型试验并验证,本发明的中药有效部位组合物具有显著改善四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的作用,能显著降低模型大鼠肝组织胶原含量,减轻肝纤维化以及肝损伤程度,有效阻止肝纤维化的发展,上述作用明显优于一贯煎原复方(例如水煎剂、水提醇沉、水提+二氯甲烷萃取等)的效果,可用于治疗和预防各种慢性肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化等慢性肝病病症。本发明的中药有效部位组合物可采用本领域常规的制剂方法制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、微丸等口服固体制剂。
附图说明
图1是实施例1的一贯煎及不同提取部位对小鼠急性肝损伤血清ALT活性的影响。
图2是实施例2的一贯煎及其有效部位(YGJ_D)对CCl4肝硬化小鼠肝脏Hyp含量的影响。
图3是实施例1的小鼠CCl4慢性模型中各组小鼠肝组织病理照片(HE染色,×200)。
图4是实施例2的小鼠CCl4慢性模型中各组小鼠肝组织病理照片(天狼星红胶原染色,×100)。
图5是实施例3中一贯煎有效部位(YGJ_D)的HPLC图谱,图中显示18个共有峰。
图6是实施例3中一贯煎有效部位(YGJ_D)指纹图谱共有模式图。
图7是实施例3中生地黄和当归中两个具有主要成分对照品的HPLC图,S1,S2分别是毛蕊花糖苷和阿魏酸的色谱峰。
具体实施方法
下面结合附图和具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
本发明的药物组合物的有益效果通过下述实验证实:
实施例1中药复方一贯煎抗肝损伤有效部位的筛选实验
1、一贯煎水煎液不同极性部位的制备
1.1一贯煎水煎液的制备:一贯煎处方为由北沙参,麦冬,当归(各10克),生地黄(18克),枸杞子(12克),川楝子(4.5克),加水煎三次,加水量分别为10倍、10倍、8倍;煎煮时间为1.5小时,1.5小时和1小时。
1.2不同极性部位的分离:
取一贯煎水煎液流浸膏,适当稀释,加95%乙醇至含醇量70%,醇沉二次,得YGJ_A(70%乙醇二次沉淀部分)
取一贯煎水煎液流浸膏,加水适当稀释至澄清溶液,等量二氯甲烷萃取,萃取液回收有机溶剂,得YGJ_B(CH2Cl2萃取物)
取一贯煎水煎液流浸膏,加水适当稀释至澄清溶液,加入预先处理好的大孔吸附树脂色谱柱中,经100%水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇水混合溶液充分洗脱。100%水洗脱至无甜味或以α-萘酚-浓硫酸试剂检测至反应明显呈阴性后,再以不同比例乙醇水溶液进行洗脱,至1000毫升流出液经蒸馏后基本无残留物。100%水及不同比例乙醇水混合溶剂洗脱后分别得到下列部分:得水洗脱部分(YGJ_C),30%乙醇洗脱部分(YGJ_D,即本发明中药有效部位组合物),60%乙醇洗脱部分(YGJ_E)
大孔吸附树脂主要使用非极性大孔吸附树脂,如D-101,HPD-100,HPD-300,DA-201,X-5或H103,并按说明书处理。
2、一贯煎不同极性部位供试液的制备
一贯煎处方药材量按人的临床剂量换算成小鼠的剂量为9.03g药材量/kg动物体重。不同极性部分按成人剂量及得率计算小鼠给药剂量。
3、四氯化碳急性肝损伤模型中一贯煎水煎液不同极性部分的筛选
3.1一贯煎(yiguanjian,YGJ)水煎液不同极性部分提取物对小鼠四氯化碳急性肝损伤模型血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)活性的影响。
3.2方法:6-8周龄Bal b/c小鼠,每组10只。实验开始先灌胃2d,1次/d,对照组灌生理盐水10ml/kg,给药组按成人剂量换算成相应剂量灌胃给药。实验第3天时,实验对照组分别腹腔注射0.5%CCl4-橄榄油10ml/kg一次造模型,灌胃改为2次/d,剂量同上。造模后48h将小鼠全部处死。处死前15h禁食,但不禁水,末次给药后1h摘取小鼠眼球,眼眶取血,离心分离血清后,测定ALT活性。结果以均数±标准差(x±s)表示。
3.3统计学方法:组间比较采用单因素方差分析。采用SPSS软件包进行统计分析。
4、结果:表明YGJ_D组分(即本发明中药有效部位组合物)具有显著改善四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的作用(见表1、图1和图3)。
表1.一贯煎及不同提取部位对小鼠急性肝损伤
血清ALT活性的影响
注:与正常对照组比较,#,p<0.01;与模型对照组比较,△△,p<0.01;△,p<0.05
实施例2四氯化碳慢性肝损伤模型中一贯煎水煎液有效部分干预肝硬化形成的实验
1、实验材料与方法
1.1模型制备:4-6周龄Bal b/c小鼠,每组15只。CCl4-橄榄油(1∶5)的混合液,按4μl/g的剂量皮下注射。除正常组外,每周1,3,5按给定剂量给药造模12周。
1.2分组与药物干预:在造模第7周首日始,继续造模的同时药物干预组按成人等剂量的用药量灌胃,每日一次,共计6周。一贯煎的成人剂量64.5g生药/65kg,按剂效剂量计算,小鼠的给药剂量为9.03g生药/kg;有效组分组按成人剂量和收率换算。临用前用适量的蒸馏水稀释,以0.2ml/10g小鼠体重的剂量给药,共6周。正常小鼠和模型对照组以同体积蒸馏水灌胃。
1.3样品采集和处理:用药6周(造模12周)后,打开腹腔观察大体情况,摘取肝、脾称重,选取肝右侧最厚一叶,切取肝组织2块,10%中性福尔马林固定,自动脱水机逐级酒精脱水,二甲苯透明,包埋,用于组织病理染色观测;剩余肝组织-80℃保存,用于肝组织羟脯氨酸含量的测定。
1.4肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量的测定采用Jamall法(Anal.Biochem.,1981,112(1):70-75)。结果以均数±标准差(x±s)表示。
1.5统计学方法:组间比较采用单因素方差分析。采用SPSS软件包进行统计分析。
2、实验结果:
实验结果如表2、图2和图4所示,与同期正常大鼠比较,模型对照大鼠肝组织胶原纤维组织显著增生,肝组Hyp含量显著增加(p<0.01),形成明显的肝纤维化;与模型对照组比较,一贯煎及其组分YGJ_D均能显著降低肝组织Hyp含量,显著改善肝组织损伤及纤维增生的程度。证实YGJ_D是一贯煎中抗纤维化,干预肝硬化形成的有效部位。
表2.一贯煎及其有效部位对CCl4肝硬化小鼠肝脏Hyp含量及胶原增生程度分期的影响
注:与正常对照组比较,#,p<0.01;与模型组比较,△△,p<0.01
实施例3一贯煎有效部位的化学成分及表征
1、一贯煎有效部位特征成分HPLC指纹图谱的表征
一贯煎有效部位为一贯煎水煎液经大孔吸附树脂吸附,经一定浓度的乙醇水混合溶剂洗脱制备而成。初步颜色反应和化学分离实验证实,该有效部位含有皂苷、环烯醚萜苷、香豆素、木脂素、酚酸、以及有机酸等成分。化学成分多而复杂,为表征一贯煎有效部位,本发明对经大孔吸附树脂吸附制备的10个批次的有效部位进行了HPLC的分析,建立了相应的指纹图谱(见图6)。
以中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版分析得出一贯煎有效部位指纹图谱的共有模式,并以10批样品均值生成的共有模式为对照计算各批样品图谱中各共有峰相对保留时间的RSD值及每个图谱与共有模式之间共有峰的相似度,结果表明RSD值均小于3%相似度值均在0.9-1之间。经通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版分析计算得出10批一贯煎有效部位指纹图谱相似度均在0.95以上。稳定性试验计算得出共有峰的相似度0.964,表明该供试品溶液在24h内稳定性良好,重复性试验相似度0.991,显示该方法具有良好的重复性。
液相色谱的操作条件如下:
Waters 2695高效液相色谱仪:四元泵,在线脱气,柱温箱,自动进样器,Waters 2487UV检测器,Empower 2色谱工作站;Sartorius BT 25S型十万分之一分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);SB52000型超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)。色谱柱:WatersSunfire C18(4.6mm×250mm,5μm);柱温:30℃;流动相:A(0.5%甲酸水溶液)-B(甲醇);梯度洗脱:0-10min(5%B-10%B),10-60min(10%B-20%B),60-100min(20%B-40%B),100-120min(40%B-90%B),120-130min(90%B)。流速:1mL·min-1;检测波长:330nm。
2、一贯煎有效部位中指标成分的HPLC含量测定
一贯煎中生地的有效成分毛蕊花糖苷(Acteoside)和当归的有效成分阿魏酸(Ferulic Acid),是中国药典2010版中地黄和当归药材的质量控制成分。为进一步控制一贯煎中有效部位的质量,申请人首次建立了一贯煎抗纤维化有效部位中两种质量控制成分毛蕊花糖苷和阿魏酸的含量测定方法,并对其含量进行了限定。
毛蕊花糖苷和阿魏酸对照品购自中国食品药品生物制品检定研究院。毛蕊花糖苷在0.030mg-0.750mg呈良好的线性关系,回归方程为Y=4065.6X+159.35,r=0.9999。毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为102.2%,RSD为0.99%(n=9)。阿魏酸在0.69μg-3.45μg呈良好线性关系,回归方程为Y=203653.3X-14295.2,r=0.9998。阿魏酸平均加样回收率为99.38%,RSD为1.11%(n=9)。典型HPLC色谱图和对照品HPLC色谱对照图见图5,图7。
对10批次的一贯煎有效部位进行含量测定,其中毛蕊花糖苷的含量范围为:0.157%-0.219%;阿魏酸的含量范围为;0.218%-0.306%。按最低含量的80%进行限定,一贯煎有效部位中含毛蕊花糖苷(C29H36O15)不得少于0.12%;含阿魏酸(C10H10O4)不得少于0.18%。
毛蕊花糖苷在0.0158mg-0.874mg呈良好的线性关系,回归方程为Y=2141.5X-35.72,r=0.9999;阿魏酸在0.025mg-0.850mg呈良好的线性关系,回归方程为Y=4065.6X+159.35,r=0.9999。毛蕊花糖苷、阿魏酸平均加样回收率分别为102.2%、103.9%。
液相色谱的操作条件如下:
Waters 2695高效液相色谱仪:四元泵,在线脱气,柱温箱,自动进样器,Waters 2487UV检测器,Empower 2色谱工作站;Sartorius BT 25S型十万分之一分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);SB52000型超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)。色谱柱:WatersSunfire C18(4.6mm×250mm,5μm);柱温:30℃;流动相:A(0.5%甲酸水溶液)-B(甲醇);梯度洗脱:0-10min(5%B-10%B),10-60min(10%B-20%B),60-100min(20%B-40%B),100-120min(40%B-90%B),120-130min(90%B)。流速:1mL·min-1;检测波长:330nm。
以下通过制备实施例对本发明作进一步的阐述:
实施例4中药有效部位组合物的制备
称取如下原料药饮片:北沙参,麦冬,当归(各10克),生地黄(18克),枸杞子(12克),川楝子(4.5克),将上述原料药饮片加水煎三次,加水量分别为10倍、10倍、8倍;煎煮时间为1.5小时,1.5小时和1小时,浓缩煎出液制成流浸膏。取一贯煎水煎液流浸膏,加水适当稀释至浓度为1.0克生药/毫升的澄清溶液,加入预先处理好的大孔吸附树脂色谱柱中(上样量为2.0克生药/克干树脂;吸附时间为5小时),经100%水洗脱至无甜味或以α-萘酚-浓硫酸试剂检测至反应明显呈阴性后,再以30%乙醇水溶液进行洗脱,至1000毫升流出液经蒸馏后基本无残留物,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成约1.37克中药有效部位组合物。
实施例5中药有效部位组合物的制备
称取如下原料药:北沙参,麦冬,当归(各10克),生地黄(50克),枸杞子(20克),川楝子(5克),将上述原料药加水煎三次,加水量分别为10倍、10倍、8倍;煎煮时间为1.5小时,1.5小时和1小时,浓缩煎出液制成流浸膏。取一贯煎水煎液流浸膏,加水适当稀释至浓度为1.5克生药/毫升的澄清溶液,加入预先处理好的大孔吸附树脂色谱柱中(上样量为3.0克生药/克干树脂;吸附时间为8小时),经100%水洗脱至无甜味或以α-萘酚-浓硫酸试剂检测至反应明显呈阴性后,再以20%乙醇水溶液进行洗脱,至1000毫升流出液经蒸馏后基本无残留物,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成约2.23克中药有效部位组合物。
实施例6中药有效部位组合物的制备
称取如下原料药:北沙参,麦冬,当归(各10克),生地黄(30克),枸杞子(10克),川楝子(4.8克),将上述原料药加水煎三次,加水量分别为10倍、9倍、8倍;煎煮时间为1.5小时,1.2小时和1小时,浓缩煎出液制成流浸膏。取一贯煎水煎液流浸膏,加水适当稀释至浓度为0.5克生药/毫升澄清溶液,加入预先处理好的大孔吸附树脂色谱柱中(上样量为1.0克生药/克干树脂;吸附时间为1小时),经100%水洗脱至无甜味或以α-萘酚-浓硫酸试剂检测至反应明显呈阴性后,再以40%乙醇水溶液进行洗脱,至1000毫升流出液经蒸馏后基本无残留物,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成约1.58克中药有效部位组合物。
实施例7片剂
按本领域技术人员常规的制剂方法将实施例4的中药有效部位组合物加入适量药用辅料制成片剂约15片。片剂每片含中药有效部位组合物90mg。用法:每次5片,每日3次,每周用药7天,12周为一疗程。
实施例8胶囊剂
按本领域技术人员常规的制剂方法将实施例5的中药有效部位组合物加入适量药用辅料制成胶囊剂约15粒。胶囊剂每粒含中药有效部位组合物150mg。用法:每次5粒,每日3次,每周用药7天,12周为一疗程。
实施例9颗粒剂
按本领域技术人员常规的制剂方法将实施例6的中药有效部位组合物加入适量药用辅料制成颗粒剂约9袋。颗粒剂每袋含中药有效部位组合物175mg。用法:每次3袋,每日3次,每周用药7天,12周为一疗程。

Claims (7)

1.一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物,其特征在于,该组合物包括:毛蕊花糖苷、阿魏酸、皂苷、环烯醚萜苷、香豆素、木脂素、酚酸以及有机酸;以组合物的总重量为基础计,所述毛蕊花糖苷的含量范围为:0.157%-0.219%,所述阿魏酸的含量范围为:0.218%-0.306%;该组合物按如下方法制成:(1)水煎液的制备:取北沙参、麦门冬、干生地、当归、枸杞子和川楝子6味原料药加水8-10倍量煎煮三次,每次1小时至1.5小时,煎出液经适当浓缩,过滤得水煎液;所述北沙参、麦门冬、当归、干生地、枸杞子和川楝子的重量比例为1:1:1:(1.8-5):(1-2):(0.45-0.5);(2)有效部位的制备:取上述水煎液上大孔吸附树脂色谱柱,装上样品一段时间后达吸附平衡,以水洗脱至经alfa-萘酚-浓硫酸试剂的显色反应呈阴性;然后以极性溶剂洗脱,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成;所述极性溶剂为20-40%的乙醇水混合液。
2.如权利要求1所述的中药有效部位组合物的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)水煎液的制备:
取原料药,加水8-10倍量煎煮三次,每次1小时至1.5小时,煎出液经适当浓缩,过滤得水煎液;
(2)有效部位的制备:
取上述水煎液上大孔吸附树脂色谱柱,装上样品一段时间后达吸附平衡,以水洗脱至经alfa-萘酚-浓硫酸试剂的显色反应呈阴性;然后以极性溶剂洗脱,收集洗脱液,减压回收溶剂,减压干燥而制成,所述极性溶剂为20-40%的乙醇水混合液。
3.如权利要求2所述的中药有效部位组合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述大孔吸附树脂色谱柱中使用的大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂,选自D-101,HPD-100或DA-201。
4.如权利要求2所述的中药有效部位组合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的水煎液加上大孔吸附树脂色谱柱时的浓度为0.5-1.5克生药/毫升,上样量为1.0-3.0克生药/克干树脂;吸附时间为1-8小时。
5.如权利要求1所述的中药有效部位组合物在制备治疗慢性肝炎药物中的应用。
6.如权利要求1所述的中药有效部位组合物在制备防治肝损伤、肝纤维化药物中的应用。
7.如权利要求1所述的中药有效部位组合物在制备防治肝硬化药物中的应用。
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