CN105031070A - 一种治疗痛风性关节炎的三色堇提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗痛风性关节炎的三色堇提取物及其制备方法，提取物制备方法包括：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的三色堇80～90份和干燥的甘草10～20份，混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。该提取物可以应用于痛风性关节炎，开发成治疗痛风性关节炎的药物。

Description

一种治疗痛风性关节炎的三色堇提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取物领域，具体涉及一种治疗痛风性关节炎的三色堇提取物及其制备方法，该提取物可以应用于制备治疗痛风性关节炎的药物。

背景技术

药材三色堇为堇菜科堇菜属植物三色堇的全草，又名蝴蝶花(《中国药用植物图鉴》)、游蝶花(《台湾药用植物志》)。

原植物三色堇(学名：ViolatricolorL.)是堇菜目、堇菜科、堇菜属的二年或多年生草本植物。基生叶叶片长卵形或披针形，具长柄，茎生叶叶片卵形、长圆形或长圆披针形，先端圆或钝，边缘具稀疏的圆齿或钝锯齿。三色堇是欧洲常见的野花物种，也常栽培于公园中，是冰岛、波兰的国花。花朵通常每花有紫、白、黄三色，故名三色堇。该物种较耐寒，喜凉爽，开花受光照影响较大。

三色堇可杀菌、治疗皮肤上青春痘、粉刺、过敏问题，三色堇药浴也有很好的丰胸作用。在中国医药古籍记载的护肤圣品中，三色堇无疑是最炫目的。三国时期的《名医别录》中就已把三色堇列为重要护肤药材，隋炀帝为讨后宫佳丽的欢心，曾组织太医研究三色堇去痘的多种方法，并将其一一写进《隋炀帝后宫诸宫药方》与《香方粉泽》等书之中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三色堇提取物，其制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备治疗痛风性关节炎的药物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种三色堇提取物，该提取物由以下方法制备：

(a)以重量计，每100份药材包含干燥的三色堇80～90份和干燥的甘草10～20份，混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。

为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差异，所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentZorbaxExtent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：35℃；进样量：10μL。

药物制剂，含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。

所述的提取物在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。

所述的药物制剂在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明三色堇提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明的优点：本发明通过对干燥的三色堇和甘草进行提取、除杂、富集处理，能得到具有治疗痛风性关节炎的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同批次制备的提取物的批间差异。

附图说明

图1为三色堇提取物HPLC液相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：三色堇提取物①制备(85份三色堇，15份甘草)

药材来源：三色堇和甘草购自安徽亳州中药材市场。

主要试剂：食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；85％磷酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。

制备方法：将8.5kg干燥三色堇根茎和1.5kg干燥甘草混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积(12L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积(18L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得三色堇提取物约150g。

实施例2：三色堇提取物②制备(80份三色堇，20份甘草)

制备方法：将8.0kg干燥三色堇根茎和2.0kg干燥甘草混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积(12L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积(18L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得三色堇提取物约150g。

实施例3：三色堇提取物③制备(90份三色堇，10份甘草)

制备方法：将9.0kg干燥三色堇根茎和1.0kg干燥甘草混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积(12L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积(18L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得三色堇提取物约150g。

实施例4：三色堇提取物④制备(75份三色堇，25份甘草)

制备方法：将7.5kg干燥三色堇根茎和2.5kg干燥甘草混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积(12L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积(18L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得三色堇提取物约150g。

实施例5：三色堇提取物⑤制备(95份三色堇，5份甘草)

制备方法：将9.5kg干燥三色堇根茎和0.5kg干燥甘草混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2L)；将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积(12L)除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积(18L)，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得三色堇提取物约150g。

实施例6：液相色谱分析

供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL10％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加10％乙腈水溶液定容。分析方法如下：

高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；

色谱柱：AgilentZorbaxExtent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：35℃；进样量：10μL。

用制备的10批次的三色堇提取物进行分析，进行色谱峰匹配，结果1～10号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定10个峰为共有色谱峰，据此建立该提取物的HPLC质量控制图谱，结果见图1。该10批次的三色堇提取物药理活性相似。

实施例7：提取物药理试验

一、材料与方法

1.1药物：三色堇提取物①～⑤分别按照实施例1～5制得。秋水仙碱片，批号100206，规格0.5mg/s，西双版纳版纳药业有限责任公司；取6片秋水仙碱，研磨，加蒸馏水至200mL，混匀配制成浓度为0.15mg/mL秋水仙碱溶液。微晶尿酸钠(MSU)，参照Coderre方法，194mL蒸馏水加6mL1mol/LNaOH，煮沸，加1g尿酸，用1mL1mol/LHCl调pH至7.2，搅拌冷却，4℃冰箱保存24h，去上清，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2h，取出，刮下粉末，放入研钵内研成细末，用孔径250μm的金属筛过筛，制成MSU粉末备用。

1.2试剂：尿酸(UA)试剂盒，批号：P100121，上海复星长征医学科学有限公司；一氧化氮(NO)试剂盒，批号：20110119，南京建成生物工程研究所；总蛋白(TP双缩脲法)试剂盒，批号：110601，北京睿基恒生物科技发展有限公司。

1.3动物：清洁级SD大鼠，雄性，体重200～220g，由浙江省医学科学院提供，合格证号：SCXK(浙)20080033。

1.4仪器：LP123电子天平，常熟市衡器厂，苏制00000153；YLS-7A大鼠足趾容积测量仪，山东省医学科学院设备站；HEMAVET950动物血液分析仪，ADrewScientificGroupCo；威图SELECTRA-E全自动生化仪，荷兰威图公司。

1.5实验方法及检测指标

1.5.1动物分组及给药：将大鼠随机分为18组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组(秋水仙碱0.0015g·kg^-1)、三色堇提取物①～⑤各设3个剂量组(100mg·kg^-1、200mg·kg^-1、300mg·kg^-1)，每组10只。造模前给药5d，1次/d，造模后继续给药。受试药组分别灌胃给予不同剂量的三色堇提取物，正常对照组灌胃给予相应体积的水，阳性对照药灌胃给予相应剂量的秋水仙碱药液。

1.5.2造模：取1000mgMSU加9mL生理盐水，再加lmL吐温-80，加热搅拌，配制成10mLMSU混悬液(浓度为100mg·mL^-1)，给药30min后大鼠右后踝关节屈曲，用手触摸可扪及两骨突部，75％医用酒精局部消毒后，用6号注射针在左右后侧踝关节背侧从45°方向插入胫骨肌腿内侧，将0.1mLMSU混悬液注入到踝关节腔，制备急性痛风性关节炎模型，伸曲、旋转运动2min，正常对照组大鼠用无菌生理盐水代替MSU混悬液。

1.5.3关节肿胀度：造模前在大鼠右后足踝关节三叉处外部绕踝关节用记号笔画圈做记号，测量大鼠右足至标记处排水容积两次，取平均值为给药前关节体积；造模后1h、4h、6h、24h测量大鼠右足至标记处排水容积，按公式计算肿胀度。

肿胀度(mL)＝致炎后踝关节排水容积(mL)－致炎前踝关节排水容积(mL)。

1.5.4血液分析：造模24h，末次给药30min后，测完指定部位的排水容积后，从大鼠眼眶后静脉丛采血5mL，其中4mL室温下自然凝血2h，3500r·min^-1离心10min，吸取血清，参照试剂盒说明书依法测定血清UA、NO含量；另1mL加10μLEDTA抗凝，使用动物血液分析仪依法测定白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量。

1.5.5生化及组织学指标：在玻璃纸上用锐利的刀片从大鼠右踝关节背侧快速切断筋膜，切取踝关节三叉处除骨的全部软组织及软骨，称重并加9倍量的冰生理盐水制成10％组织匀浆，3500r·min^-1离心10min，吸取上清，参照试剂盒说明书依法测定总蛋白、NO含量；处死取脾脏、肾脏，称重，计算脾体系数和肾体系数。

1.6统计分析：计量资料数据结果以x±s表示，组间比较采用t检验。

二、结果

2.1三色堇提取物对痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的影响

与正常对照组相比，模型对照组大鼠踝关节肿胀度在造模后1～6h内均显著升高(P<0.01)；造模后1h，与模型对照组相比，秋水仙碱组、三色堇提取物①～③各剂量组大鼠踝关节肿胀度均显著下降(P<0.01)；造模后4h，与模型对照组相比，秋水仙碱组、三色堇提取物①～③各剂量组大鼠踝关节肿胀度均显著下降(P<0.01)；造模后6h，与模型对照组相比，秋水仙碱组、三色堇提取物①～③高剂量组大鼠踝关节肿胀度均显著下降(P<0.05)；三色堇提取物①～③中、低剂量组大鼠踝关节肿胀度亦有降低的趋势；三色堇提取物④～⑤各剂量组在造模24h内与模型组相比均无显著差异。结果见表1(注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)。

表1三色堇提取物在造模24h内对痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀度的影响(x±s，n＝10)

2.2对痛风性关节炎大鼠脾体指数、肾体指数的影响

与正常对照组相比，模型组肾体指数明显降低，脾体指数明显升高(P<0.05、0.01)；与模型对照组相比，秋水仙碱组大鼠肾体指数显著升高，脾体指数显著降低(P<0.05)；三色堇提取物①～③高剂量组肾体指数明显上升(P<0.01)，三色堇提取物①～③各剂量组脾体指数均有不同程度的下降(P<0.05、0.01)；三色堇提取物④～⑤各剂量组对大鼠脾体指数、肾体指数的影响与模型组无显著差别。见表2(注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)。

表2三色堇提取物对痛风性关节炎大鼠脾指数、肾指数的影响(x±s，n＝10)

2.3对痛风性关节炎大鼠全血中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞水平的影响

与正常对照组相比，模型对照组的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量有升高的趋势；与模型组相比秋水仙碱和三色堇提取物①～③高剂量组大鼠的白细胞、中性粒细胞合淋巴细胞数量明显减少(P<0.05、0.01)，三色堇提取物①～③其余各剂量组均有降低趋势；三色堇提取物④～⑤各剂量组与模型对照组比无显著差异。见表3(注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)。

表3三色堇提取物对痛风性关节炎大鼠白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞影响(x±s，n＝10)

2.4对痛风性关节炎大鼠血清UA水平的影响

各组大鼠血尿酸值结果结果显示，与正常对照组相比，模型组血尿酸值明显升高(P<0.05)；与模型组相比，三色堇提取物①～③中高剂量组大鼠血尿酸明显下降(P<0.05)；三色堇提取物④～⑤各剂量组与模型组比均无显著性差异。见表4(注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)。

表4三色堇提取物对痛风性关节炎大鼠血清UA的影响(x±s，n＝10)

组别	剂量/(mg/kg)	UA/μmol·L-1
			正常对照组	-	74.79±19.57*
模型对照组	-	92.78±17.96
			秋水仙碱组	0.0015	82.42±21.99
提取物①低剂量组	100	79.17±14.48

提取物①中剂量组	200	72.09±15.66*
			提取物①高剂量组	300	71.70±20.58*
提取物②低剂量组	100	79.32±14.54
			提取物②中剂量组	200	72.64±15.42*
提取物②高剂量组	300	71.85±20.49*
			提取物③低剂量组	100	79.21±14.32
提取物③中剂量组	200	72.38±15.74*
			提取物③高剂量组	300	71.73±20.61*
提取物④低剂量组	100	92.18±14.21
			提取物④中剂量组	200	91.03±15.51
提取物④高剂量组	300	90.31±20.17
			提取物⑤低剂量组	100	92.00±14.19
提取物⑤中剂量组	200	90.87±15.69
			提取物⑤高剂量组	300	90.11±20.05

上述试验结果表明，三色堇提取物对大鼠痛风性关节炎具有治疗作用。三色堇提取物中甘草的含量对其发挥治疗作用至关重要。

实施例8：片剂的制备

按实施例1方法制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：口服液的制备

按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例10：胶囊剂或颗粒剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例11：注射液的制备

按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例12：无菌粉针的制备

按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims (6)

1.一种三色堇提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的三色堇80～90份和干燥的甘草10～20份，混合粉碎，用75％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用10％乙醇冲洗8个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩即得。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。

3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentZorbaxExtent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：270nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

4.一种药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的提取物在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。

6.权利要求4所述的药物制剂在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。