CN105125652A - 一种云雾七提取物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种云雾七提取物及其制备方法和医药用途，制备方法包括：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的云雾七80～90份和干燥的黄芪10～20份，混合粉碎；(b)用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；(c)对步骤(b)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(d)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用20～30％乙醇冲洗6～8个柱体积除去大极性杂质，再用55～65％乙醇洗脱8～10个柱体积，收集55～65％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。该提取物具有降血脂的作用。

Description

一种云雾七提取物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及植物提取物领域，具体涉及一种云雾七提取物及其制备方法和医药用途。

背景技术

云雾七为毛茛科植物秦岭翠雀花的根。秋季采挖，洗净，晒干用。

原植物形态秦岭翠雀花为多年生草本。高达1m，上部分枝。基生叶在开花时枯萎，茎下部及中部叶有较长柄；叶柄长为叶片的1.5-2倍，被少许开展的糙毛；叶片五角形，长6-7cm，宽7-10cm，掌状5深裂，中央深裂片菱形，先端短渐尖，中上部边缘有三角形粗牙齿，有时为3浅裂，侧深裂片不等2深裂，上面有少数糙毛，下面沿网脉疏被糙毛。总状花序长约8-11cm，有花约10朵，下部苞片3裂，上部苞片披针状线形或线形，长0.8-2.6cm；花梗只被白色柔毛，无黄色腺毛；小苞片生花梗中部或下部，线形，长5-8mm，宽约0.5mm；花两性，两则对称；萼片5，紫色，椭圆状卵形，长1.5-1.6cm，外面疏被短柔毛，距长约2cm，稍向下弯曲；花瓣2，干时黄色，无毛；退化雄蕊2，紫色，瓣片近方形，2深裂，腹面有黄色髯毛，爪与瓣片近等长；雄蕊多数，无毛；心皮3-5，无毛，花柱短。蓇葖果。花期5-6月，果期6-7月。

发明内容

本发明的目的在于提供一种云雾七提取物，该提取物的制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备降血脂药物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种云雾七提取物，该提取物由以下方法制备：

(a)以重量计，每100份药材包含干燥的云雾七80～90份和干燥的黄芪10～20份，混合粉碎；(b)用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；(c)对步骤(b)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(d)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用15～25％乙醇冲洗8～10个柱体积除去大极性杂质，再用60～70％乙醇洗脱8～10个柱体积，收集60～70％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

进一步地，步骤(d)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。

进一步地，步骤(b)中所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为70～80％。

进一步地，步骤(b)中所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75％。

进一步地，步骤(d)为用正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积除去大极性杂质，再用65％乙醇洗脱9个柱体积，收集65％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次药材制备的云雾七提取物批间差异，所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentZorbaxExtentC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液；

梯度洗脱程序：0～8min，A25％～35％；8～15min，A35％～50％；15～25min，A50％；25～26min，A50％～25％；26～30min，A25％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：255nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

药物制剂，含有治疗有效量的所述云雾七提取物和药学上可接受的载体。

所述的云雾七提取物在制备降血脂的药物中的应用。

所述的药物制剂在制备降血脂的药物中的应用。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明云雾七提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明的优点：本发明通过对云雾七药材进行提取、除杂、富集处理，能得到降血脂的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同批次药材制备的提取物的批间差异。

附图说明

图1为云雾七提取物HPLC液相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：云雾七提取物制备(85份云雾七，15份黄芪)

药材来源：云雾七和黄芪购自安徽亳州中药材市场。经鉴定，云雾七为毛茛科植物秦岭翠雀花的根。

主要试剂：食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；甲醇为HPLC级，购于TEDIA；甲酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。

将8.5kg干燥的云雾七和1.5kg干燥黄芪混合粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液(6L)；对浓缩液依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物285g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积(12L)，再用65％乙醇洗脱9个柱体积(15L)，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得云雾七提取物浸膏粉约155g。

实施例2：云雾七提取物②制备(80份云雾七，20份黄芪)

制备方法：将8.0kg干燥的云雾七和2.0kg干燥黄芪混合粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液(6L)；对浓缩液依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物285g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积(12L)，再用65％乙醇洗脱9个柱体积(15L)，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得云雾七提取物浸膏粉约155g。

实施例3：云雾七提取物③制备(90份云雾七，10份黄芪)

制备方法：将9.0kg干燥的云雾七和1.0kg干燥黄芪混合粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液(6L)；对浓缩液依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物285g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积(12L)，再用65％乙醇洗脱9个柱体积(15L)，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得云雾七提取物浸膏粉约155g。

实施例4：云雾七提取物④制备(75份云雾七，25份黄芪)

制备方法：将7.5kg干燥的云雾七和2.5kg干燥黄芪混合粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液(6L)；对浓缩液依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物285g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积(12L)，再用65％乙醇洗脱9个柱体积(15L)，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得云雾七提取物浸膏粉约155g。

实施例5：云雾七提取物⑤制备(95份云雾七，5份黄芪)

制备方法：将9.5kg干燥的云雾七和0.5kg干燥黄芪混合粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液(6L)；对浓缩液依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物285g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂(2kg，柱体积1.5L)富集，先用20％乙醇冲洗9个柱体积(12L)，再用65％乙醇洗脱9个柱体积(15L)，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得云雾七提取物浸膏粉约155g。

实施例6：液相色谱分析

供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物浸膏粉5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL25％甲醇水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加25％甲醇水溶液定容。

分析方法：

高效液相色谱仪：Agilent1100，二元泵；

色谱柱：AgilentZorbaxExtentC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液；

梯度洗脱程序：0～8min，A25％～35％；8～15min，A35％～50％；15～25min，A50％；25～26min，A50％～25％；26～30min，A25％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：255nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

对用10批不同批次云雾七制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹配，结果1～10号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定10个峰为共有指纹峰，据此建立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。

实施例7：云雾七提取物药理试验

一、材料

1.1受试物与试剂：云雾七提取物①～⑤分别按照实施例1～5制得，试验前制成混悬液，用时摇匀。阳性药血脂康(北京北大维信生物科技有限公司，批号20071116)。丙硫氧嘧啶片(广东华南药业有限公司，批号070701)。胆固醇(北京夏斯生物技术有限公司，Amresco分装产品，货号0433)。胆盐3号(国药集团化学试剂有限公司，批号F20061205)。戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，批号020919)。柠檬酸三钠(天津市化学试剂一厂，批号960911)。

1.2动物：SD大鼠，体重180～200g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号SCXK(京)2007-0001。

1.3仪器：Microlab300生化仪(荷兰Vitalscien-tific公司)；3K15台式多功能高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；BT-300型血液流变测试仪(北京博莱特医药技术有限公司)；LG-PABER-I型血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)。

二、方法

2.1脂肪乳剂的配制：乳剂配方为猪油15％+胆固醇6％+胆盐3号2％+丙基硫氧嘧啶0.2％。称取75g猪油在40℃水浴中融化，取1g丙硫氧嘧啶片在研钵中研磨至细粉后与30g胆固醇一起加入到猪油中用玻棒搅拌溶解，加入适量水，搅拌，加入10g胆盐，再加入30mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)，不断搅拌直至乳化现象产生，然后将事先准备好的37℃水缓慢加至500mL即制备得稳定的脂肪乳剂。放入冰箱保存待用，使用前置37℃水浴中融化。

2.2高脂血症模型的建立：SD大鼠198只，180～200g，雄性，随机分成18组，分别为正常组、模型组、阳性对照药血脂康0.24g·kg^-1组，以及云雾七提取物①～⑤低中高剂量组(0.6，1.2，2.4g·kg^-1)，每组11只。除正常组给予饮用水外，各组大鼠均以10mL·kg^-1的剂量灌胃脂肪乳剂，每天1次，连续3周。

2.3给药方法：SD大鼠，造高脂模型中灌胃脂肪乳剂2d后，开始给药。每日上午，除正常对照组给清水外，各组大鼠继续以10mL·kg^-1的剂量灌胃脂肪乳剂；下午，各给药组给云雾七提取物，高、中、低剂量组剂量分别为2.4，1.2，0.6g·kg^-1，给药容量均为20mL·kg^-1。阳性药血脂康0.24g·kg^-1，给药容量10mL·kg^-1。正常组和模型组给予饮用水。均采用灌胃给药，连续给药3周。

2.4检测指标：大鼠禁食12h，末次给药后1h，眼眦取血，离心取血清测定TG，TC，LDL-C，HDL-C。然后腹腔注射戊巴比妥钠45mg·kg^-1，麻醉后腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠1:9抗凝，于血液流变测试仪上测定全血黏度，之后将全血离心取血浆，测定血浆黏度，并在血小板聚集凝血因子分析仪上测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原含量(FIB)。

2.5统计学分析：数据经齐性分析与正态分布检验，采用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计分析，结果用x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有显著性。

三、结果

3.1云雾七提取物对血脂水平的影响

结果显示，模型组与正常组比较，TG，TC，LDL-C和HDL-C均明显升高，有显著性差异(P<0.01)，表明灌胃脂肪乳剂造大鼠实验性高脂血症模型成功。与模型组比较，阳性对照血脂康组能有效降低TG，TC，LDL-C水平，升高HDL-C水平，差异有显著性意义(P<0.01，P<0.05)；云雾七提取物①～③高剂量组能明显降低TG，TC水平，升高HDL-C水平，差异有显著性意义(P<0.01，P<0.05)，对LDL-C有下调的趋势，但差异没有统计学意义；云雾七提取物①～③中剂量组对TG有下调的作用，对HDL-C有上升的作用，并有显著性差异(P<0.01)；云雾七提取物①～③低剂组对血脂水平的影响不明显；云雾七提取物④～⑤各剂量组对TG、TC、HDL-C和LDL-C的作用与模型组无显著差异，对血脂水平的影响不明显(表1，注：与空白组比较¹⁾P<0.01，²⁾P<0.05；与模型组比较³⁾P<0.01，⁴⁾P<0.05，下同)。

表1云雾七提取物对高脂血症大鼠血脂水平的影响(x±s，n＝11)

组别	剂量/g·kg-1	TG	TC	LDL-C	HDL-C
						正常对照组	-	0.25±0.07	1.99±0.43	0.73±0.13	1.10±0.17
模型组	-	0.75±0.151)	6.53±1.141)	2.35±0.491)	2.19±0.511)
						阳性药组	0.24	0.36±0.063)	3.88±1.253)	1.94±0.504)	2.82±0.253)
提取物①低剂量组	0.6	0.77±0.19	6.59±1.90	2.53±0.64	2.75±0.604)
						提取物①中剂量组	1.2	0.50±0.163)	6.05±1.65	2.23±0.65	3.14±0.473)
提取物①高剂量组	2.4	0.42±0.103)	5.13±1.804)	2.14±0.47	3.26±0.463)
						提取物②低剂量组	0.6	0.79±0.21	6.73±1.93	2.61±0.66	2.73±0.634)
提取物②中剂量组	1.2	0.52±0.153)	6.07±1.68	2.27±0.68	3.12±0.453)
						提取物②高剂量组	2.4	0.44±0.123)	5.15±1.784)	2.16±0.49	3.24±0.473)
提取物③低剂量组	0.6	0.78±0.18	6.68±1.88	2.52±0.69	2.74±0.584)
						提取物③中剂量组	1.2	0.51±0.143)	6.09±1.64	2.25±0.63	3.11±0.493)
提取物③高剂量组	2.4	0.45±0.093)	5.14±1.824)	2.17±0.45	3.25±0.443)
						提取物④低剂量组	0.6	0.76±0.16	6.78±1.91	2.59±0.61	2.21±0.56
提取物④中剂量组	1.2	0.72±0.15	6.63±1.59	2.42±0.54	2.25±0.51
						提取物④高剂量组	2.4	0.69±0.11	6.47±1.74	2.37±0.48	2.29±0.48
提取物⑤低剂量组	0.6	0.78±0.17	6.83±1.90	2.55±0.62	2.22±0.54
						提取物⑤中剂量组	1.2	0.74±0.13	6.68±1.52	2.41±0.57	2.27±0.52
提取物⑤高剂量组	2.4	0.70±0.12	6.50±1.77	2.35±0.49	2.30±0.51

3.2云雾七提取物对全血黏度和血浆黏度的影响

结果显示，模型组的全血黏度和血浆黏度较正常组均有明显的升高，差异有显著性(P<0.01，P<0.05)。与模型组比较，血脂康组和云雾七提取物①～③高剂量组均能有效降低全血黏度，并具有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，中、低剂量组对高脂乳剂造成的全血黏度升高亦有一定的降低作用；同时，3个剂量组均能降低血浆黏度，差异有显著性意义(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；云雾七提取物④～⑤各剂量组的全血黏度和血浆黏度较模型组均没有显著性差异。结果见表2。

表2云雾七提取物对高脂血症大鼠全血黏度、血浆黏度的影响(x±s，n＝11)

3.3云雾七提取物对血浆凝血因子的影响

结果显示，模型组较正常组，活化部分凝血活酶时间有明显的缩短，纤维蛋白原含量显著升高，两者均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，血脂康组和云雾七提取物①～③高剂量组能延长活化部分凝血活酶时间，降低纤维蛋白原含量，两者差异均有显著性意义(P<0.01，P<0.05)，且高剂量组效果优于血脂康组；与模型组比，各给药组对凝血酶原时间和凝血酶时间的影响不明显。云雾七提取物④～⑤各剂量组与模型组相比，对活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原含量、凝血酶原时间和凝血酶时间的影响均不明显，均没有显著性差异。结果见表3。

表3云雾七提取物对高脂血症大鼠血浆凝血因子的影响(x±s，n＝11)

本实验表明，云雾七提取物高剂量组能降低实验性高脂血症大鼠的血脂水平、血液黏度、纤维蛋白原含量，改善血液循环，抑制因血脂升高和脂质代谢紊乱引起的血液凝血系统指标的改变，使血液处于低黏、低凝状态，防止静脉血栓的形成。但是，其作用与云雾七提取物中黄芪的含量有关，二者只有在一定的比例范围内才能发挥上述作用。

实施例8：片剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：口服液的制备

按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例10：胶囊剂或颗粒剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例11：注射液的制备

按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例12：无菌粉针的制备

按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (9)

1.一种云雾七提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：（a）以重量计，每100份药材包含干燥的云雾七80~90份和干燥的黄芪10~20份，混合粉碎；（b）用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；（c）对步骤（b）浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（d）正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用15~25%乙醇冲洗8~10个柱体积除去大极性杂质，再用60~70%乙醇洗脱8~10个柱体积，收集60~70%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（d）中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。

3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（b）中所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为70~80%。

4.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于：步骤（b）中所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75%。

5.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（d）为用正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用20%乙醇冲洗9个柱体积除去大极性杂质，再用65%乙醇洗脱9个柱体积，收集65%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

6.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentZorbaxExtentC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；

流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液；

梯度洗脱程序：0~8min，A25%~35%；8~15min，A35%~50%；15~25min，A50%；25~26min，A50%~25%；26~30min，A25%；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：255nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

7.药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的提取物在制备降血脂的药物中的应用。

9.权利要求7所述的药物制剂在制备降血脂的药物中的应用。