CN101843667A - 一种双黄连药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双黄连药物组合物，其先由金银花和连翘混合提取得银翘提取物，然后再与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成，金银花、连翘和黄芩的重量比为1∶2∶1；所述药物组合物中含20-40％总黄酮、5-20％总皂苷、20-30％总有机酸、8-18％糖类、0.2-2％总氨基酸、0.35-1.0％连翘苷。本发明双黄连药物组合物对所用的金银花、连翘和黄芩进行提取及分离有效成分，去除杂质及无效成分，并对各有效成分进行合理配比，同时严格限定绿原酸与咖啡酸的含量，在保证疗效的同时提高安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，具体地说，涉及一种双黄连药物组合物及其制备方法。
背景技术
中药制剂双黄连为金银花、连翘和黄芩经提取精制而得，主要含有黄芩苷、连翘苷、绿原酸等。现代药理研究证明，双黄连制剂具有抗菌、抗病毒、解热等作用，可以清热解毒，清宣风热，适用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛等病症。临床上被广泛用于治疗发热、微恶风寒或不恶寒、咳嗽气促、咳痰色黄、咽红肿痛等急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、轻型肺炎等病症。
但随着双黄连制剂在临床上的广泛应用，其不良反应的报道也屡见不鲜。双黄连制剂的不良反应主要表现为皮肤潮红、皮疹，偶见胃肠道、呼吸系统反应等。
因此，需要研究解决双黄连制剂在使用过程中引起的不良反应问题，从而确定更加安全的配方。
发明内容
本发明的目的是提供一种配比更加合理的双黄连药物组合物。
本发明的另一个目的是提供该组合物的制备方法。
经研究发现，双黄连制剂中所含的总黄酮、总皂苷、总有机酸、糖类、总氨基酸和连翘苷是其有效成分，同时总有机酸中的绿原酸既是抗病毒、抗菌的有效成分，也是可疑的致敏原性物质，进入机体后可能会导致过敏反应，而且绿原酸也不稳定，易分解为咖啡酸。
因此，本发明从双黄连制剂所用的金银花、连翘和黄芩中提取、分离有效成分，去除杂质及无效成分，并对各有效成分进行合理配比，同时严格限定绿原酸与咖啡酸的含量，在保证疗效的同时提高安全性。
为了实现本发明目的，本发明提供一种双黄连药物组合物，其先由金银花和连翘混合提取得银翘提取物，然后再与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成，金银花、连翘和黄芩的重量比为1∶2∶1；所述药物组合物中含20-40％总黄酮、5-20％总皂苷、20-30％总有机酸、8-18％糖类、0.2-2％总氨基酸、0.35-1.0％连翘苷。
其中，优选的为，该组合物中含25-35％总黄酮、10-15％总皂苷、25-30％总有机酸、10-15％糖类、0.6-1％总氨基酸、0.4-0.7％连翘苷。
黄芩苷占总黄酮的60-100％，总有机酸中绿原酸和咖啡酸占2.0-5.0％。优选为，黄芩苷占总黄酮的85-98％，总有机酸中绿原酸和咖啡酸占3.0-4.5％。
各含量均为重量百分含量。
本发明的药物组合物，其可与药学上可接受的载体制备成注射液、冻干粉针剂、口服液、片剂、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、分散片、滴丸、泡腾片或软胶囊。
本发明的药物组合物制备成注射液时，黄芩苷含量为6.5-8.5mg/ml，连翘苷含量为0.14-0.21mg/ml，绿原酸和咖啡酸含量为0.19-0.28mg/ml，总氨基酸含量为0.1-0.3mg/ml。
本发明药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)取1重量份金银花，2重量份连翘，加6-8倍原料量的水浸渍30分钟后，煎煮2次，每次1-2小时，合并滤液，浓缩至70-80℃测定相对密度为1.20-1.25的清膏，放冷至40℃时缓缓加入乙醇使含醇量达75％，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入浓缩膏重量的3-4倍量水，调节pH值至7.0，充分搅拌并加热至沸腾，静置48小时，滤取上清液，浓缩至70-80℃测定相对密度为1.10-1.15，放冷至40℃后进行二次醇沉，醇沉浓度为85％，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，得银翘提取物；
2)取1重量份黄芩加4-6倍量水煎煮2-3次，每次1-2小时，合并滤液，用2mol/L盐酸调节pH值至1.0-2.0，在80℃保温30分钟至1小时，静置12-24小时，滤过，沉淀加6-8重量份水，搅拌，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，并加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗涤至pH值至4.0，60℃以下干燥得黄芩提取物；
3)取黄芩提取物加水适量，加热并用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0使溶解，滤过，并取银翘提取物加水，溶解过滤，合并两种滤液；
4)将滤液上XDA-5和D101混合树脂柱(重量比0.5∶1-1∶0.5)，分别以水、氯化钠和磷酸盐的缓冲液、梯度乙醇进行洗脱，鉴定和定量分析各流分，进行收集，按照各组合物有效成分比例合并各流分。
本发明步骤4)的滤液先以水进行洗脱，收集流出液和洗脱液，得糖类流分；然后以氯化钠和磷酸盐缓冲液洗脱获得总氨基酸流分；用水冲洗树脂柱至中性后以10-15％的乙醇洗脱可得总有机酸流分；再以50-70％乙醇洗脱得总黄酮流分；最后以60-70％乙醇进行洗脱，得总皂苷和连翘苷流分。
本发明双黄连药物组合物对所用的金银花、连翘和黄芩进行提取及分离有效成分，去除杂质及无效成分，并对各有效成分进行合理配比，同时严格限定绿原酸与咖啡酸的含量，在保证疗效的同时提高安全性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例的双黄连药物组合物的制备过程如下：
1)取500g金银花，2000g连翘，加8倍量水浸渍30分钟后，煎煮2次，每次1小时，合并滤液，浓缩至相对密度为1.22(75℃测)，放冷至40℃，缓缓加入乙醇使含醇量达75％，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入3倍量水，调节pH值至7.0，充分搅拌并加热至沸腾，静置48小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.13(75℃测)，放冷至40℃，加入乙醇使含醇量达85％，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，得银翘提取物。
2)取500g黄芩酌以碎断，加4倍量水煎煮2次，每次1小时，合并滤液，用2mol/L盐酸调节pH值至1.5，在80℃保温30分钟，静置24小时，滤过，沉淀加8倍量水，搅拌，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，并加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗涤至pH值至4.0，60℃以下干燥，得黄芩提取物。
3)取黄芩提取物加水适量，加热并用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0使溶解，滤过，取银翘提取物加水适量，溶解过滤，合并两种滤液，得混合液。
4)将混合液上XDA-5和D101混合树脂柱(1∶1)，静置吸附8小时后，先以水进行洗脱，收集流出液和洗脱液，得流分1(糖类)；然后用0.25mol/L氯化钠和pH7.2磷酸盐缓冲液，以0.5ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，得流分2(总氨基酸)；用水冲洗树脂柱至中性，弃去该部分洗脱液，再以10％的乙醇，以1ml/min的流速冲洗树脂柱，收集洗脱液，得流分3(总有机酸)；再以50％乙醇，以1ml/min的流速冲洗树脂柱，收集洗脱液，得流分4(总黄酮)；最后以70％乙醇进行洗脱，得流分5(总皂苷和连翘苷)。
5)将各流分浓缩、干燥，混合，即得。经检测，含总黄酮35.53％(其中黄芩苷占97.04％)，总皂苷16.16％，总有机酸28.21％(其中绿原酸和咖啡酸占3.6％)，糖类14.25％，总氨基酸1.87％，连翘苷0.83％。
实施例2
本实施例的双黄连药物组合物的制备过程如下：
1)取500g金银花，2000g连翘，加6倍量水浸渍30分钟后，煎煮2次，每次2小时，合并滤液，浓缩至70℃测定相对密度为1.20的清膏，放冷至40℃时缓缓加入乙醇使含醇量达75％，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入4倍量水，调节pH值至7.0，充分搅拌并加热至沸腾，静置48小时，滤取上清液，浓缩至70℃测定相对密度为1.10，放冷至40℃后进行二次醇沉，醇沉浓度为85％，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，得银翘提取物；
2)取500g黄芩加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并滤液，用2mol/L盐酸调节pH值至2.0，在80℃保温30分钟至1小时，静置24小时，滤过，沉淀加8倍量水，搅拌，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，并加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗涤至pH值至4.0，60℃以下干燥得黄芩提取物；
3)取黄芩提取物加水适量，加热并用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0使溶解，滤过，取银翘提取物加水适量，溶解过滤，合并两种滤液，得混合液。
4)将混合液上XDA-5和D101混合树脂柱(1∶0.5)，静置吸附6小时后，先以水进行洗脱，收集流出液和洗脱液，得流分1(糖类)；然后用0.25mol/L氯化钠和pH7.2磷酸盐缓冲液，以0.5ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，得流分2(总氨基酸)；用水冲洗树脂柱至中性，弃去该部分洗脱液，再以15％的乙醇，以0.8ml/min的流速冲洗树脂柱，收集洗脱液，得流分3(总有机酸)；再以70％乙醇，以0.8ml/min的流速冲洗树脂柱，收集洗脱液，得流分4(总黄酮)。最后以60％乙醇进行洗脱，得流分5(总皂苷和连翘苷)。
5)将各流分浓缩、干燥，混合，即得。经检测，含总黄酮29.03％(其中黄芩苷占89.60％)，总皂苷13.88％，总有机酸28.04％(其中绿原酸和咖啡酸占3.5％)，糖类12.79％，总氨基酸0.96％，连翘苷0.58％。
实施例3
取实施例1组合物300g加800ml注射用水溶解，加入5‰药用炭，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，搅拌，煮沸15分钟，冷却，加注射用水稀释至1000ml，搅拌15分钟，经0.22μm微孔滤膜过滤，药液冷却至30～50℃超滤，超滤后的药液冷却至30℃以下，经0.45μm、0.22μm滤芯过滤，灌装、灭菌、包装，得注射液。
经检测，注射液中黄芩苷含量为7.02mg/ml，连翘苷含量为0.17mg/ml，绿原酸和咖啡酸含量为0.21mg/ml。
实施例4
取实施例2组合物290g加注射用水至1000ml溶解，加入5‰药用炭，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，加热至沸并保持微沸15分钟，冷却，滤过，灭菌，滤过，灌装，冷冻干燥，压盖，得冻干粉针剂。
实施例5
取实施例1组合物450g加水适量溶解，以40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，搅匀，4-8℃冷藏72小时，滤过，滤液加入200g蔗糖，搅拌使溶解，或再加入香精适量，调节pH值至7.0，加水制成1000ml，搅匀，静置12小时，滤过，灌装，灭菌，得口服液。
实施例6
取实施例1组合物2.25kg加入0.6kg微晶纤维素、45g的羧甲基淀粉钠，混匀，制成颗粒，干燥，加入25g的硬脂酸镁，混匀，压制成1000片，包薄膜衣，得片剂。
实施例7
取实施例2组合物2.9kg加水溶解后调节pH值至7.0-7.5，减压浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎；另取780g半合成脂肪酸酯加热溶化，温度保持在40±2℃，加入上述干膏粉，混匀，浇模，制成1000粒，得栓剂。
实施例8
取实施例2组合物1.8kg加入糊精等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000g(无蔗糖)；或加入组合物重量的3.5倍蔗糖、0.5倍糊精等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成2000g，得颗粒剂。
试验例1
本试验例在于研究本发明药物组合物各组分的检测方法
一)总黄酮
1仪器与试药
1.1仪器 紫外-可见分光光度仪；电子天平；水浴锅；医用数控超声波清洗器。
1.2试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所)；
ZrOCL2·8H2O(国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(分析纯)，水为超纯水。
2方法
2.1对照品溶液的制备
取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成0.29mg/ml的黄芩苷对照品溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
精密吸取组合物样品水溶液1ml至10ml容量瓶中，加水稀释定容，摇匀，即得。
2.3标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml置于10ml容量瓶中，加入2％ZrOCl2·8H2O的甲醇溶液1ml，再用甲醇稀释至10ml，摇匀，静置1h后，照紫外-可见分光光度法(中国药典一部附录VA)，以相应的试剂做空白，在424nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标、取样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
2.4测定法
精密吸取供试品溶液1ml，照标准曲线项下的方法，自“置于10ml容量瓶中...”起，依法测定吸光度。
二)总皂苷
1仪器与试药
1.1仪器紫外-可见分光光度仪；电子天平；水浴锅；医用数控超声波清洗器。
1.2试药齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所)；香草醛(北京芳草医药化工研制公司)。
2方法
2.1供试品溶液的制备
精密量取2.0ml组合物水溶液，加适量水(8ml)后用正丁醇等体积萃取5次，合并萃取液，减压蒸干，甲醇溶解，过滤，置于100ml容量瓶中，定容，即得。
2.2对照品溶液的制备
精密称取干燥(105℃)至恒重的齐墩果酸对照品15.4mg，置10ml容量瓶中，加入甲醇溶解，摇匀，定容；精密吸取1ml，用甲醇定容至10ml，摇匀，即得。
2.3标准曲线的制备
分别精密吸取0.2，0.25，0.35，0.4，0.5ml对照品溶液，分别置10ml具塞试管中，水浴挥干溶剂，依次加入0.5ml 8％香草醛乙醇溶液(精密称取香草醛0.8g，加10ml无水乙醇使溶解，摇匀)和5.0ml72％硫酸，摇匀后置60℃恒温水浴1h，随后立即取出，置冰浴中冷却15min，制成系列梯度溶液，以0.5ml 8％香草醛乙醇溶液和5.0ml72％硫酸为空白对照，在536nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标(A)，取样量为横坐标(C)，绘制标准曲线，计算回归方程。
2.4测定法
精密吸取供试品溶液2ml，照标准曲线项下的方法，自“置10ml具塞试管中..”起，依法测定。
三)总有机酸
1仪器与材料
1.1自动电位滴定仪；电子天平；医用数控超声波清洗器。
1.2试药乙酰水杨酸对照品(中国药品生物制品检定所)；0.01mol/mlNaOH滴定液(国家化学试剂质检中心)，甲醇(分析纯)，水为超纯水。
1.3材料001*1型阳离子交换树脂
2方法与结果
2.1对照品溶液的配制
称取乙酰水杨酸适量置10ml容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，制成4.01mg/ml的对照品溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
精密量取药物组合物水溶液5ml，过预先处理好的001*1型强酸性阳离子交换树脂柱(柱体积约10ml)，继续用水洗脱，流出液定容至50ml，摇匀，即得。
2.3测定方法
精密量取5ml供试品溶液置100ml滴定杯中，加水25ml，置于自动电位滴定仪上，用0.01mol/mlNaOH滴定液滴定，以测量值mv-ml绘制标准曲线，将结果用空白实验校正，总游离有机酸量按乙酰水杨酸计算，每1mlNaOH滴定液(0.01mol/ml)相当于1.699mg乙酰水杨酸。
四)糖类
1仪器与试药
1.1仪器高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，十万分之一电子天平，医用数控超声波清洗器，超纯水处理系统。
1.2试剂乙腈(色谱纯)，重蒸馏水。
1.3试药药物组合物水溶液，果糖对照品、葡萄糖对照品、蔗糖对照品(中国药品生物制品检定所提供)。
2色谱条件
色谱柱：ALLtech GRACE prevail carbohydrate ES(250×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈∶水(75∶25)；流速：1.0ml/min；检测器温度100℃，气体流速2.0L/min。
3对照品溶液的制备精密称取果糖对照品13.25mg、D-无水葡萄糖对照品15.65mg、蔗糖对照品18.05mg，置50ml量瓶中，加10％乙腈适量溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
4供试品溶液的制备 取药物组合物水溶液作为供试品溶液。
5测定法 精密吸取上述对照品溶液5μl、10μl和供试品溶液2μl、10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算样品的含量，即得。
五)总氨基酸
1仪器与材料
1.1仪器 氨基酸自动分析仪；电子天平；
1.2材料 氨基酸自动分析仪用缓冲液和茚三酮显色剂，5种缓冲液配比见表1，盐酸为分析纯，水为重蒸馏水；混合氨基酸对照品溶液(浓度为0.2μmoL·mL-1)
表1氨基酸分析中缓冲液的配比
2方法
2.1色谱条件
色谱柱：阳离子交换树脂分析柱(ID4.6mm×60mm)；采用五种缓冲液梯度洗脱，洗脱程序见表2，洗脱液流速为0.28mL·min-1；茚三酮显色剂柱后衍生显色，显色剂流速为0.32mL·min-1；检测波长：570nm，440nm(针对脯氨酸和羟脯氨酸)。进样量：10μl。
表2洗脱程序
2.2总氨基酸供试品溶液的制备
取药物组合物水溶液约4ml，精密称定，置5ml水解管中，加入6mol·L-1盐酸溶液5-6ml，水解管充氮气，密封，放置110℃加热块中水解22小时，冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用适量水分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置旋转蒸发瓶中反复蒸去盐酸，残渣用水溶解并定容至2ml，作为供试品溶液。
2.3标准曲线制备
分别精密吸取氨基酸混合对照品溶液10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μl进样，测定，以对照品的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
2.4样品测定
精密吸取总氨基酸供试品溶液100μl，注入氨基酸分析仪，记录色谱图，即得。
六)绿原酸和咖啡酸
1仪器与试药
1.1仪器高效液相色谱仪，十万分之一电子分子天平，医用数控超声波清洗器，超纯水处理系统。
1.2试剂 甲醇(色谱纯)，冰醋酸(分析纯)，重蒸水。
1.3试药 绿原酸对照品、咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)
2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：324nm；流动相：A相为1％冰醋酸(V/V)，B相为甲醇，洗脱程序如表3；理论板数按绿原酸峰计算应不低于6000，在咖啡酸色谱峰之前应有三个色谱峰，其中绿原酸与相邻的色谱峰分离度应达到0.8以上。
表3HPLC梯度洗脱程序
3方法
3.1对照品溶液的制备
取绿原酸对照品，咖啡酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml各含40μg、30μg的混合溶液，即得。
3.2供试品溶液的制备
精密吸取药物组合物水溶液2ml，至10ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.3测定法
精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
七)黄芩苷
以甲醇-水-冰醋酸(48∶52∶1)为流动相，检测波长为276nm，按高效液相色谱法进行测定。
八)连翘苷
以乙腈-水(23∶77)为流动相，检测波长为277nm，按高效液相色谱法进行测定。
试验例2对小鼠流感病毒性肺炎的影响
取小鼠按体重随机分为4组，分别为感染对照组、正常对照组、市售样品组和实施例3组。市售双黄连制剂样品组和实施例3组腹腔注射样品，感染对照组和正常对照组均给予相同药液容积的注射用水。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始给药或水，每天2次，连续5天，第6天称取小鼠体重后固定，放血、解剖，摘取全肺称重，逐个计算肺指数值，并求出肺指数抑制率，结果见表4。肺组织用10％甲醛固定，乙醇系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度4-5μm，HE染色，普通光学显微镜观察肺组织形态学变化。按炎症细胞浸润程度分级标准，对细胞进行计分，并进行统计学处理，进行组间t检验比较，结果见表5。
表4双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症(肺指数)的影响(n＝10)
| 组别 | 剂量(g/kg含生药) | 肺指数值(x±s) | 抑制率(％) |
| 感染对照组 | -- | 1.59±0.14 | -- |
| 正常对照组 | -- | 1.02±0.09 | -- |
| 市售样品组 | 20 | 1.38±0.11 | 13.27 |
| 实施例3组 | 20 | 1.36±0.20 | 13.85 |
表5双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症(病毒观察)的影响(n＝10)
| 组别 | 剂量(g/kg含生药) | 肺指数值(x±s) | 抑制率(％) |
| 感染对照组 | -- | 2.68±0.22 | -- |
| 正常对照组 | -- | 0.09±0.16 | -- |
| 市售样品组 | 20 | 1.76±0.23 | 31.06 |
| 组别 | 剂量(g/kg含生药) | 肺指数值(x±s) | 抑制率(％) |
| 实施例3组 | 20 | 1.65±0.15 | 32.35 |
由表4和表5结果可见，感染后小鼠肺指数值明显增大，实施例3组样品和市售组样品在本试验条件下的剂量范围内对流感病毒感染小鼠引起的肺炎有明显的抑制作用，肺指数值明显降低，肺组织病变程度明显减轻。且在相同剂量条件下，实施例3组的作用稍强于市售组。
试验例3止咳作用比较
取小鼠30只随机分为3组，用药组按20ml/kg体重腹腔注射药液，空白对照组给予同体积的注射用水。连续给药5天，一天一次，末次给药1小时后，利用超声雾化器喷雾26％氨水3秒，观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期(即停止喷雾到咳嗽的时间)和2分钟内小鼠咳嗽次数(以其腹肌收缩、张大嘴和听到咳声为准)，结果见表6。
表6双黄连注射液对氨水所致小鼠咳嗽的影响
| 组别 | 剂量(g/kg含生药) | 潜伏期 | 咳嗽次数 |
| 空白对照组 | -- | 4.7±1.6 | 32.4±7.1 |
| 市售样品组 | 20 | 8.6±2.0 | 21.6±5.3 |
| 实施例3组 | 20 | 9.1±1.8 | 20.2±5.6 |
从表6可见，2个用药组均可显著延长氨水所致小鼠咳嗽潜伏期，还可明显减少小鼠咳嗽次数。且实施例3组的镇咳作用略好于市售组。
试验例4过敏试验对比研究
样品：实施例3样品、市售双黄连注射液
方法：取体重250-300g豚鼠24只，随机分为四组，每组6只。阴性对照组：腹腔注射0.9％氯化钠注射液；阳性对照组：腹腔注射5％新鲜蛋清溶液。实施例3组：腹腔注射实施例3样品；市售组：腹腔注射市售双黄连注射液。给药剂量均为0.5ml/只。隔日一次，共三次。首次给药后14天，21天，每组随机取2只，实施例3组和市售组分别由耳缘静脉注射实施例3样品和市售双黄连注射液；阴性对照组注射0.9％氯化钠注射液，阳性对照组注射5％新鲜蛋清溶液。给药剂量均为1.0ml/只。给药后立即观察动物有无喷嚏、搔鼻、干咳或咳嗽、颤抖、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡的过敏反应，观察时间为15分钟。过敏反应分级见表7。
表7过敏反应分级及结果判定方法
结果：注射0.9％氯化钠注射液的阴性对照组的豚鼠过敏反应级数均为0，无过敏反应；注射5％蛋清的阳性对照组豚鼠出现喷嚏、搔鼻、干呕或咳嗽、抽搐、颤抖、呼吸困难、大小便失禁、休克等过敏反应，且皆于15min内死亡，过敏反应级数为四级，试验条件成立。注射实施例3样品的6只豚鼠均无过敏反应，过敏反应级数均为0。注射市售双黄连注射液的6只豚鼠中有2只豚鼠出现轻微抓鼻、竖毛现象，过敏反应级数为1。表明实施例3样品的安全性高于市售双黄连注射液。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种双黄连药物组合物，其特征在于，其先由金银花和连翘混合提取得银翘提取物，然后再与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成，金银花、连翘和黄芩的重量比为1∶2∶1；所述药物组合物中含20-40％总黄酮、5-20％总皂苷、20-30％总有机酸、8-18％糖类、0.2-2％总氨基酸、0.35-1.0％连翘苷。
2.根据权利要求1所述的双黄连药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含25-35％总黄酮、10-15％总皂苷、25-30％总有机酸、10-15％糖类、0.6-1％总氨基酸、0.4-0.7％连翘苷。
3.根据权利要求1或2所述的双黄连药物组合物，其特征在于，黄芩苷占总黄酮的60-100％，总有机酸中绿原酸和咖啡酸占2.0-5.0％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的双黄连药物组合物，其特征在于，黄芩苷占总黄酮的85-98％，总有机酸中绿原酸和咖啡酸占3.0-4.5％。
5.根据权利要求1-4任意一项所述双黄连药物组合物，其特征在于，所述药物组合物与药学上可接受的载体制备成注射液、冻干粉针剂、口服液、片剂、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、分散片、滴丸、泡腾片或软胶囊。
6.根据权利要求5所述双黄连药物组合物，其特征在于，所述注射液中黄芩苷含量为6.5-8.5mg/ml，连翘苷含量为0.14-0.21mg/ml，绿原酸和咖啡酸含量为0.19-0.28mg/ml，总氨基酸含量为0.1-0.3mg/ml。
7.制备权利要求1-6任意一项所述双黄连药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取1重量份金银花，2重量份连翘，加6-8倍原料量的水浸渍30分钟后，煎煮2次，每次1-2小时，合并滤液，浓缩至70-80℃测定相对密度为1.20-1.25的清膏，放冷至40℃时缓缓加入乙醇使含醇量达75％，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入浓缩膏重量的3-4倍量水，调节pH值至7.0，充分搅拌并加热至沸腾，静置48小时，滤取上清液，浓缩至70-80℃测定相对密度为1.10-1.15，放冷至40℃后进行二次醇沉，醇沉浓度为85％，静置12小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，得银翘提取物；
2)取1重量份黄芩加4-6倍量水煎煮2-3次，每次1-2小时，合并滤液，用2mol/L盐酸调节pH值至1.0-2.0，在80℃保温30分钟至1小时，静置12-24小时，滤过，沉淀加6-8重量份水，搅拌，用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.0，并加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸调pH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗涤至pH值至4.0，60℃以下干燥得黄芩提取物；
3)取黄芩提取物加水，加热并用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0使溶解，滤过，并取银翘提取物加水，溶解过滤，合并两种滤液；
4)将滤液上XDA-5和D101的混合树脂柱，以水、氯化钠和磷酸盐的缓冲液、梯度乙醇进行洗脱，鉴定和定量分析各流分，进行收集，按照各组合物有效成分比例合并各流分。
8.根据权利要求7所述双黄连药物组合物的制备方法，其特征在于，步骤4)的滤液先以水进行洗脱，收集流出液和洗脱液，得糖类流分；然后以氯化钠和磷酸盐缓冲液洗脱获得总氨基酸流分；用水冲洗树脂柱至中性后以10-15％的乙醇洗脱得总有机酸流分；再以50-70％乙醇洗脱得总黄酮流分；最后以60-70％乙醇进行洗脱，得总皂苷和连翘苷流分。
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