CN101474260A - 一种双黄连液体制剂及其含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及一种双黄连液体制剂及其含量测定方法。双黄连液体制剂主要含有黄芩苷、连翘苷、绿原酸等，其不良反应主要表现在过敏性休克、皮肤潮红、皮疹等。本发明提供了一种双黄连液体制剂，其中含有适量的绿原酸、黄芩苷和连翘苷等有效成分，不仅具有理想的治疗效果，同时还降低了过敏反应的发生。本发明还提供了一种双黄连液体制剂有效成分的检测方法。使用本发明的检测方法，只需要使用一种流动相，就可以同时检测黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素等五种有效成分的含量。该方法不仅显著提高了检测效率，而且还有效地降低了检测成本。

Description

一种双黄连液体制剂及其含量测定方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种双黄连液体制剂及其含量测定方法。

背景技术

双黄连液体制剂为金银花、连翘和黄芩经提取精制而得，主要含有黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷、汉黄芩素等。现代药理研究证明，双黄连液体制剂具有抗菌、抗病毒、解热等作用，可以清热解毒，清宣风热，适用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛等病症。临床上被广泛用于治疗病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。然而，随着双黄连液体制剂在临床上的广泛应用，其不良反应的报道也屡见不鲜。双黄连液体制剂的不良反应主要表现在过敏性休克、皮肤潮红、皮疹等。

因此，需要研究解决双黄连液体制剂在使用过程中引起的过敏问题，从而确定更加安全的双黄连液体制剂的配方。

另外，为了保证双黄连液体制剂的质量，还需要提供更加高效的有效成分含量检测方法。目前广泛使用的方法是《中国药典》2005年版一部记载的方法。该方法采用高效液相色谱法分别测定绿原酸、连翘苷和黄芩苷含量，且在每一种成分的测定中，使用不同的色谱条件。例如，在检测黄芩苷时，使用的流动相是甲醇-水-冰醋酸(50:50:1)；使用的检测波长为274nm；并要求按黄芩苷峰计算，色谱柱的理论塔板数不低于1500。再如在检测绿原酸时，使用的流动相是甲醇-水-冰醋酸(20:80:1)；使用的检测波长为324nm；并要求按绿原酸峰计算，色谱柱的理论塔板数不低于6000。另外，在检测连翘苷时，使用的流动相是乙腈-水(25:75)；使用的检测波长为278nm；并要求按连翘苷峰计算，色谱柱的理论塔板数不低于6000。

由此可见，现有技术中为了检测绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量，使用了3套不同的色谱条件，这显然增加了检测工作量，延长了检测时间，增加了检测成本。另外，现有技术中的检测方法通常只检测黄芩苷、连翘苷和绿原酸的含量，而不检测另外两种有效成分木犀草苷和汉黄芩素的含量。

发明内容

在双黄连液体制剂所含的有效成分中，绿原酸既是抗病毒、抗菌的有效成分，也是可疑的致敏原性物质，进入机体后可能会导致过敏反应。另外，黄芩和连翘提取物中的皂苷成分在大剂量应用的情况下，也易引起过敏反应。为了尽量避免和减少双黄连液体制剂引起的过敏反应，需要控制其中的绿原酸、黄芩苷和连翘苷的含量。

因此，本发明的一个目的是提供一种有效成分配比更加合理的双黄连液体制剂。

本发明的另一个目的是提供一种可以同时检测双黄连液体制剂中多种有效成分含量的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.1-1.0mg/ml、黄芩苷6.0-12.0mg/ml、绿原酸0.4-1.0mg/ml。

根据本发明的一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中含有连翘苷0.1-0.8mg/ml、黄芩苷6.0-10.0mg/ml、绿原酸0.4-1.0mg/ml。该实施方案提供的双黄连液体制剂为一种注射液。

根据本发明的另一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中含有连翘苷0.3-1.0mg/ml、黄芩苷8.0-12.0mg/ml、绿原酸0.6-1.0mg/ml。该实施方案提供的双黄连液体制剂为一种口服液。

根据本发明的又一种优选实施方案，本发明的双黄连液体制剂中还含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、汉黄芩素0.05-0.2mg/ml。

一种双黄连液体制剂的含量测定方法，该方法使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于2000，以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸溶液为流动相B，检测波长为270-290nm，其中包括柱平衡、上样、洗脱等步骤，在洗脱步骤中，流动相A的体积百分比逐渐递增，先用体积百分比为27％的A相和73％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；然后用体积百分比为30％的A相和70％的B相作为流动相洗脱1-3个柱体积；接着用体积百分比为60％的A相和40％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；再用体积百分比为90％的A相和10％的B相作为流动相洗脱3-5个柱体积。

本发明提供的双黄连液体制剂含有适量的绿原酸、黄芩苷和连翘苷，不仅具有理想的治疗效果，而且还同时降低了过敏反应的发生。根据本发明的检测方法，只需要使用一种流动相，就可以同时检测黄芩苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素等五种有效成分的含量。该方法不仅显著提高了检测效率，而且还有效地降低了检测成本。

具体实施方式

实施例1

1)金银花提取物的制备

称取金银花，加水温浸2-3次，过滤，浓缩，醇沉，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，加入膏重2-6倍量的纯化水，轻轻搅拌，静置，取上清液过滤，滤液浓缩后再次进行醇沉，静置，取上清液过滤，浓缩，得金银花提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含绿原酸15.22mg/g，木犀草苷0.38mg/g。

2)连翘提取物的制备

称取连翘，加水煎煮3次，合并药液，后续步骤同金银花温浸后步骤，得连翘提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含连翘苷4.05mg/g。

3)黄芩提取物的制备

取黄芩饮片，加水煎煮2次，每次2小时，过滤，合并滤液，调pH值，静置，滤过，沉淀加水调pH值溶解，再加等量乙醇，搅拌，过滤，调pH值，滤过，沉淀用乙醇洗至中性，回收乙醇，离心，精制得黄芩提取物。

采用高效液相色谱法检测，测得提取物中含黄芩苷72.16mg/g，含汉黄芩素1.07mg/g。

实施例2

用实施例1中得到的3种提取物配制如下配方：

注射液的配制(每支注射液的装量为10ml)

1)配方1：绿原酸0.4mg/ml，黄芩苷6.0mg/ml，连翘苷0.1mg/ml，汉黄芩素0.09mg/ml，木犀草苷0.01mg/ml。

2)配方2：绿原酸1.0mg/ml，黄芩苷10.0mg/ml，连翘苷0.8mg/ml，汉黄芩素0.15mg/ml，木犀草苷0.024mg/ml。

3)配方3：绿原酸1.5mg/ml，黄芩苷9.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml，汉黄芩素0.13mg/ml，木犀草苷0.04mg/ml。

4)配方4：绿原酸2.0mg/ml，黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.5mg/ml，汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷0.05mg/ml。

口服液的配制(每支口服液的装量为10ml)

5)配方5：绿原酸0.6mg/ml，黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml，汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷0.015mg/ml。

6)配方6：绿原酸1.0mg/ml，黄芩苷12.0mg/ml，连翘苷1.0mg/ml，汉黄芩素0.18mg/ml，木犀草苷0.024mg/ml。

7)配方7：绿原酸1.5mg/ml，黄芩苷11.0mg/ml，连翘苷0.5mg/ml，汉黄芩素0.16mg/ml，木犀草苷0.04mg/ml。

8)配方8：绿原酸2.0mg/ml，黄芩苷9.0mg/ml，连翘苷0.8mg/ml，汉黄芩素0.13mg/ml，木犀草苷0.05mg/ml。

实施例3

双黄连液体制剂对小鼠流感病毒感染的保护作用

药物：本发明的双黄连注射液(配方1，新双黄连1)：绿原酸0.4mg/ml，黄芩苷6.0mg/ml，连翘苷0.1mg/ml，汉黄芩素0.09mg/ml，木犀草苷0.01mg/ml。

本发明的双黄连口服液(配方5，新双黄连2)：绿原酸0.6mg/ml，黄芩苷8.0mg/ml，连翘苷0.3mg/ml，汉黄芩素0.12mg/ml，木犀草苷0.015mg/ml。

市售双黄连注射液：绿原酸1.3mg/ml，黄芩苷7.2mg/ml，连翘苷0.04mg/ml，汉黄芩素0.02mg/ml，木犀草苷0.003mg/ml。。

市售双黄连口服液：绿原酸1.1mg/ml，黄芩苷8.4mg/ml，连翘苷0.4mg/ml，汉黄芩素0.04mg/ml，木犀草苷0.002mg/ml。

动物：ICR封闭群小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半

病毒株：甲型流行性感冒病毒鼠肺适应株FM1

方法：1)病毒滴度测定

将FM1接种于9-11d胚龄鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚，35℃孵育72h，连续传代2次，收获鸡胚尿囊液。用血凝实验测定混合的尿囊液中FM1的血凝效价。混合尿囊液病毒滴度为1280Hμ/ml。病毒液分装，保存-80℃备用。

2)病毒毒力(LD50)测定

ICR小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。用Hank’s液将FM1病毒液自原液浓度起做10倍梯度稀释，稀释倍数分别为1、10、10²、10³、10⁴，用乙醚对小鼠进行浅麻醉。每一稀释度病毒滴鼻感染一组小鼠，0.03ml/只，正常对照组用生理盐水滴鼻，0.03ml/只。小鼠感染病毒后连续饲养观察7d，逐日记录小鼠死亡数及活动情况。当正常对照组小鼠无异常，全部存活时，按Bliss法计算FM1对ICR小鼠的LD50及其95％可信区间。

3)小鼠病毒性肺炎造模

采用10×LD50的病毒量滴鼻感染ICR小鼠。

4)死亡保护率和生命延长率测定

ICR小鼠40只，随机分为4组：两组给药组(新双黄连1组、市售双黄连注射液组)、肺炎模型组和正常对照组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其他组小鼠浅麻醉状态下滴鼻感染10×LD50FM1，0.03ml/只。两组给药组分别注射新的双黄连液体制剂、市售双黄连液体制剂0.2ml/20g，肺炎模型组和正常对照组小鼠注射0.2ml/20g生理盐水。1次/d，连续给药7d。逐日观察记录各组小鼠发病死亡数，统计各组小鼠存活时间，计算小鼠生命延长率和小鼠死亡保护率。

生命延长率(％)＝(实验组存活时间-模型组存活时间)/模型组存活时间×100％

死亡保护率(％)＝(模型组死亡率-实验组死亡率)/模型组死亡率×100％

5)肺指数测定

小鼠造模、分组同上。灌胃给予新双黄连2、市售双黄连口服液或生理盐水。给药7d期间，立即称量死亡小鼠的体重和肺脏重量。给药7d后，断颈处死仍然存活的小鼠，称量体重和肺脏重量。计算肺指数和肺炎抑制率。

肺指数＝肺脏重量/体重×100％

抑制率(％)＝(模型组肺指数-实验组肺指数)/模型组肺指数×100％

6)病毒感染小鼠肺部组织中流感病毒含量的测定

将上述实验小鼠的肺脏称重，按每0.1g肺组织加1ml的比例加入生理盐水，在组织匀浆器中研磨制成匀浆液，1500rpm/10min离心，取上清液，用血凝实验测定流感病毒的滴度(血凝单位Hμ/g)。

结果：1)双黄连注射液对流感病毒性肺炎小鼠的保护作用

流感病毒FM1给小鼠滴鼻后，连续观察7d，FM1感染的肺炎小鼠死亡发生在感染后的第3-5天。模型组小鼠在第3、4、5天分别死亡4、4、2只，死亡率100％。两组给药组对流感病毒性肺炎小鼠的死亡保护率均为80％，新双黄连1组的生命延长率为65.7％，市售双黄连注射液组的生命延长率为66.2％，两组间无显著差异，但与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明两组给药组均能降低流感病毒性FM1肺炎小鼠的死亡率，延长存活时间，两组给药组对流感病毒的保护作用相当。结果详见表1。

表1 双黄连注射液对流感病毒性肺炎小鼠的死亡保护作用

 

组别	剂量(ml/20g)	例数(只)	死亡数(只)	死亡保护率(％)	存活时间(d)	生命延长率(％)
							正常对照组		10	10
肺炎模型组		10	10		3.6±0.3
							新双黄连1组	0.2	10	10	80	5.9±0.6	65.7
市售组	0.2	10	10	80	5.9±0.8	66.2

2)双黄连口服液对流感病毒性肺炎小鼠肺部流感病毒FM1滴度的影响

模型组的肺指数是正常组的2.5倍，新双黄连2组的肺指数是正常组的1.77倍，市售双黄连口服液组的肺指数是正常组的1.75倍，两组给药组与模型组比较P<0.01；正常组小鼠的病毒滴度为0，模型组的病毒滴度为2011Hμ/g，两组给药组的病毒滴度与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，但两组间无显著性差异。结果详见表2。

表2 双黄连口服液对流感病毒性肺炎小鼠肺部的影响

 

组别	剂量(ml/20g)	例数(只)	肺指数	病毒滴度(Hμ/g)	抑制指数
						正常对照组		10	1.16±0.2
肺炎模型组		10	2.9±0.3	2011±502
						新双黄连2组	0.2	10	2.03±0.2	670±132	0.51
市售组	0.2	10	2.05±0.1	668±145	0.50

实施例4

过敏反应试验比较

取实施例2中的配方1、2、5和6，按过敏反应检查法进行试验，结果小鼠无明显反应，表明上述配方的双黄连液体制剂不会致过敏反应。而选择配方3、4、7和8进行试验，各组小鼠均有不同程度的过敏反应，表现为轻微抓鼻、颤抖、竖毛等，表明绿原酸含量在1.0mg/ml以上的双黄连液体制剂有产生过敏现象的可能。

按现行标准对新双黄连液体制剂进行检验，各项均符合要求，另对其进行异常毒性、降压物质、过敏反应、树脂、重金属、有害元素和指纹图谱检查，也符合相关要求。

实施例5

1)仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪Agilent 1200，色谱柱：AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6×150mm 5μ。

对照品：黄芩苷(批号：110715-200514)，连翘苷(批号：110821-200610)，绿原酸(批号：110753-200413)，汉黄芩素(批号：111514-200403)，木犀草苷(批号：111720-200503)，上述对照品均购自中国药品生物制品检定所。

样品：配方1、2、3

试剂：乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2)色谱条件与洗脱程序

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相；检测波长为278nm；流速为1.0ml/min；柱温25℃；理论板数按绿原酸峰计算，应不低于2000。

洗脱程序：在洗脱步骤中，流动相A的体积百分比逐渐递增，先用体积百分比为27％的A相和73％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；然后用体积百分比为30％的A相和70％的B相作为流动相洗脱1-3个柱体积；接着用体积百分比为60％的A相和40％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；再用体积百分比为90％的A相和10％的B相作为流动相洗脱3-5个柱体积。

3)供试品溶液的制备

精密吸取双黄连液体制剂1.0ml，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

4)对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷对照品适量，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为20μg/ml、240μg/ml、7μg/ml、1.6μg/ml和0.3μg/ml的混合对照品溶液。

5)线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表3。

表3 绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷的线性回归方程

 

组分	回归方程	r	线性范围(μg)
				黄芩苷	Y＝-2166591+3870320X	0.9999	0.48-4.80
连翘苷	Y＝-9801+5637830X	0.9999	0.014-0.14
				绿原酸	Y＝982150+9913130X	0.9999	0.04-0.40
汉黄芩素	Y＝145021+6301853X	0.9998	0.0032-0.032
				木犀草苷	Y＝-63452+2564216X	0.9997	0.0004-0.004

6)精密度试验

精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷混合对照品溶液注入液相色谱仪，重复进样5次，每次20μl。绿原酸峰面积RSD＝0.96％，黄芩苷峰面积RSD＝0.81％，连翘苷峰面积RSD＝0.64％，汉黄芩素峰面积RSD＝0.58％，木犀草苷峰面积RSD＝0.76％。结果表明，所选方法精密度良好。

7)稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样，测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷的峰面积，结果绿原酸峰面积RSD＝1.55％，黄芩苷峰面积RSD＝1.96％，连翘苷峰面积RSD＝1.74％，汉黄芩素峰面积RSD＝2.01％，木犀草苷峰面积RSD＝1.68％。表明样品溶液在24h内稳定。

8)重复性试验

取同一样品，按供试品溶液制备方法分别制备5份样品溶液，按含量测定方法分别测定，记录峰面积，结果绿原酸RSD＝1.20％，黄芩苷RSD＝1.34％，连翘苷RSD＝1.06％，汉黄芩素RSD＝1.28％，木犀草苷RSD＝1.49％，表明方法重现性良好。

9)专属性试验

按处方比例及制备工艺，分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按含量测定方法进行测定，结果阴性对照品溶液在供试品溶液和混合对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷保留时间相应位置上均无吸收峰出现，表明阴性对照品无干扰。

10)准确度试验

精密量取同一样品0.4ml各6份，分别置于50ml容量瓶中，每瓶均加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷对照品适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤。按含量测定方法进行测定，结果绿原酸平均回收率为98.5％，RSD为1.04％；黄芩苷平均回收率为99.43％，RSD为1.36％；连翘苷平均回收率为99.67％，RSD为1.03％；汉黄芩素平均回收率为98.02％，RSD为1.81％；木犀草苷平均回收率为99.28％，RSD为1.16％。

11)含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备方法分别进行处理得供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件和洗脱程序进行检测，用外标法计算样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素和木犀草苷的含量，结果见表4。

表4 配方1、2、3中各有效成分的含量测定结果

 

批号	绿原酸(mg/ml)	黄芩苷(mg/ml)	连翘苷(mg/ml)	汉黄芩素(mg/ml)	木犀草苷(mg/ml)
						配方1	0.406	6.04	0.103	0.092	0.013
配方2	0.998	10.06	0.796	0.147	0.024
						配方3	1.512	9.04	0.315	0.133	0.041

Claims (9)

1.一种双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.1-1.0mg/ml、黄芩苷6.0-12.0mg/ml、绿原酸0.4-1.0mg/ml。

2.如权利要求1所述的双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.1-0.8mg/ml、黄芩苷6.0-10.0mg/ml。

3.如权利要求1所述的双黄连液体制剂，其中含有连翘苷0.3-1.0mg/ml、黄芩苷8.0-12.0mg/ml、绿原酸0.6-1.0mg/ml。

4.如权利要求1至3任一权利要求所述的双黄连液体制剂，其中还含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、汉黄芩素0.05-0.2mg/ml。

5.如权利要求2所述的双黄连液体制剂，该制剂为一种注射液。

6.如权利要求3所述的双黄连液体制剂，该制剂为一种口服液。

7.一种双黄连液体制剂的含量测定方法，使用高效液相色谱作为检测系统，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于2000，以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸溶液为流动相B，检测波长为270-290nm，其中包括柱平衡、上样、洗脱等步骤，在洗脱步骤中，流动相A的体积百分比逐渐递增，先用体积百分比为27％的A相和73％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；然后用体积百分比为30％的A相和70％的B相作为流动相洗脱1-3个柱体积；接着用体积百分比为60％的A相和40％的B相作为流动相洗脱2-4个柱体积；再用体积百分比为90％的A相和10％的B相作为流动相洗脱3-5个柱体积。

8.如权利要求7所述的含量测定方法，其中检测对象为连翘苷、黄芩苷和绿原酸的含量。

9.如权利要求7所述的含量测定方法，其中检测对象为连翘苷、黄芩苷、绿原酸、木犀草苷和汉黄芩素的含量。