CN107632075A - 金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定方法及其hplc指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，所述三种成分为绿原酸、黄芩苷、连翘苷，该方法包括待测样品前处理后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，对10批样品的含量测定结果表明，本发明所采用的色谱条件分离效果好，出峰时间短，检测结果专属性强、重现性好，准确度高。同时，本发明还提供了金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，共有10个共有峰，标定了其中4个，能更加全面地反映中药复方的内在质量，从而在生产过程中可有效的指导投料、真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。

Description

金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定方法及其HPLC指纹图谱 构建方法

技术领域

本发明涉及金柴抗感胶囊多种成分的含量测定方法及其HPLC指纹图谱构建方法，属于药物分析领域。

背景技术

CN 102526355 A公开了一种抗病毒治疗流感、感冒中药复方制剂，它由金银花、大青叶、连翘、柴胡、黄芩、桔梗、薄荷脑等中药制成，具有解热抗炎止咳作用。目前对该中药的质量控制主要是通过检测绿原酸的含量，没有对其它成分进行检测，也无全面评价产品质量的方法，难以严格地控制产品质量。申请人在研究中发现，金柴抗感胶囊中除了含有绿原酸，还含有黄芩苷、连翘苷、柴胡皂苷、木犀草苷等多种成分，这些成分中很多是药效活性成分，如果能严格控制这些成分的含量，将有利于提高产品质量，进而提高药效。

所述三种成分的化学结构式如下：

将多种成分含量测定与构建HPLC指纹图谱相结合，是中药质量控制的发展趋势，目前已有文献报道通过多种成分控制抗感冒类中药的质量标准，如CN 105758978 A中公开了测定感冒止咳糖浆中五种成分含量的方法，且其中的某些标准物质与本发明相同。但是，因中药处方复杂，物质种类繁多，各种物质之间相互干扰，即使是处方或工艺的一点微小调整，高效液相色谱图往往也会表现出很大的差异，导致检测结果不准确。因此，高效液相和HPLC指纹图谱的检测方法和条件与药物的处方和工艺密切相关，而现有技术没有关于同时检测金柴抗感胶囊中多种成分含量的报导。

发明内容

本发明的目的是针对金柴抗感胶囊含量测定指标单一，无法真实、全面控制其质量的缺陷，提供一种同时检测绿原酸、黄芩苷、连翘苷三种成分含量的方法，同时构建了一种金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的方法。

所述金柴抗感胶囊记载于CN 102526355 A的专利文献中，它由以下重量份数的中药材制成：

本发明提供的方法包括将待测样品提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250-300nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈和磷酸水溶液组成的混合液，采用梯度洗脱，柱温为30～40℃，理论板数按绿原酸峰计不低于1500。

优选地，所述待测样品提取的方法是：取金柴抗感胶囊内容物，研细，取0.1g，精密称定，置50mL容量瓶中，加50％甲醇40mL，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。采用该提取方法，能明显减少杂质峰，且保留时间在24min、50min和55min左右的目标峰的分离度和峰形更好，HPLC图谱的基线更加平稳。

优选地，所述磷酸水溶液的质量浓度为0.05～0.15％，最佳为0.1％。采用该浓度的磷酸水溶液作为流动相组分，不仅色谱峰的分离效果更好，而且峰形更佳。

优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中磷酸水溶液的体积比分别为：0～25min，磷酸水溶液90～96％；25～26min，磷酸水溶液96～75％；26～60min，磷酸水溶液75～83％。采用该洗脱程序，出峰时间最合适，色谱峰的分离效果和峰形更佳。

优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为277nm。采用该检测波长，图谱基线不会发生漂移，而且所显示的三个特征峰峰宽、峰高最适宜，分离效果更好。

优选地，所述柱温为35℃。在此条件下，出峰时间更合适，而且目标峰峰形更好，杂峰更少。

本发明提取方法中所使用的50％甲醇，均指体积分数，即100ml甲醇水溶液中，含有甲醇50ml。

本发明还提供了一种金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，该方法包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：将待测样品提取后作为供试品溶液；

2)混合对照品溶液的制备：制备绿原酸、黄芩苷、木犀草苷、连翘苷的混合对照品溶液；

3)分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液5～20μl，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250～300nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为甲醇和磷酸水溶液组成的混合液，采用梯度洗脱，柱温为30～40℃，理论板数按绿原酸峰计不低于1500；

4)分别记录供试品溶液和混合对照品溶液的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，将供试品溶液和混合对照品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析，

所述供试品溶液HPLC色谱图中有10个共有特征峰，其中峰1为绿原酸，峰4为木犀草苷，峰5为连翘苷，峰6为黄芩苷。

优选地，所述待测样品的提取方法是：取金柴抗感胶囊内容物，研细，取0.4g，精密称定，置25mL容量瓶中，加50％甲醇20mL，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

优选地，所述混合对照品溶液中，绿原酸、黄芩苷、木犀草苷、连翘苷的浓度分别为39.08μg/mL、70.96μg/mL、0.50mg/mL、6.23μg/mL。

优选地，所述磷酸水溶液的质量浓度为0.2％。

优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中磷酸水溶液的体积比分别为：0～8min，磷酸水溶液24～32％；8～10min，磷酸水溶液32～34％；10～50min，磷酸水溶液34～85％。

优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为277nm。

优选地，所述柱温为35℃。

本发明的有益效果是：采用本发明提供的方法能同时检测出金柴抗感胶囊中三种物质的含量，检测效率高，速度快，费用低，所采用的色谱条件分离效果好，出峰时间短，检测结果专属性强，重现性好，准确度高。同时，本发明构建的金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱共有特征峰10个，标定了其中4个，该HPLC指纹图谱能比较全面的反映中药所包含的化学信息，全面反映中药复方的内在质量。从而在生产过程中可有效的指导投料、严格规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，与其它检测方法相比具有操作方便、快捷等优点。

附图说明

图1是三种标准品混合溶液得到的高效液相色谱图。

图2是按实施例1中液相条件得到的样品高效液相色谱图。

图3是绿原酸阴性对照样品得到的高效液相色谱图。

图4是黄芩苷阴性对照样品得到的高效液相色谱图。

图5是连翘苷阴性对照样品得到的高效液相色谱图。

图6是13批金柴抗感胶囊样品得到的指纹图谱图。

图7是由13批金柴抗感胶囊样品指纹图谱图得到的对照指纹图谱图。

图8是13批金柴抗感胶囊样品和混合对照品得到的指纹图谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细地说明。各实施例中的试验对象金柴抗感胶囊均按CN 102526355 A中的方法进行制备，由武汉双龙药业有限公司提供。

实施例1样品测定

步骤1混合对照品溶液的配制

分别取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成约0.977mg/mL的溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成1.774mg/mL的溶液；取连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.156mg/mL的溶液，分别吸取上述对照品溶液各1mL置同一25mL的棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得含39.08μg/mL绿原酸对照品，含70.96μg/mL黄芩苷对照品，含6.23μg/mL连翘苷对照品的混合对照品溶液。

步骤2样品溶液的制备

取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.1g，精密称定，置50mL容量瓶中，加50％甲醇约40mL，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤3含量测定

分别精密吸取混合对照品溶液与样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为277nm，柱温35℃，流速1mL/min，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。

表1梯度洗脱流动相配比表

根据以上条件得到标准品和样品色谱图见附图1、附图2。

步骤4计算结果

C_i样＝(A_i样/A_i对)*C_i对

W_i％＝(C_i对*A_i样*50)/(A_i对*W_样*1000)*100％

C_i对为各特定物质对照品溶液的浓度(mg/ml)

A_i对为各特定物质对照品溶液的峰面积

A_i样为各特定物质峰面积

W_样为样品称样量(g)

根据以上算法得该样品中绿原酸含量为15.90mg/g，黄芩苷含量为29.81mg/g，连翘苷含量为2.14mg/g。

实施例2磷酸浓度选择

除磷酸含量比例按下表2变化外，其它色谱条件按实施例1方法不变，以同一样品进行含量测定，以各次实验含量测定结果的RSD为考察指标对其进行考察。结果及其分析分别见表，表明0.05％-0.15％磷酸浓度条件下该方法均稳定可行。

表2不同磷酸浓度考察结果

实施例3方法验证

1.线性

分别精密量取实施例1中混合标准品各1mL、1mL、1mL、1mL、2mL置100mL、50mL、25mL、10mL、10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得五个浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述五个浓度的对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。分别以三者的峰面积(A)为纵坐标(Y)，以其进样量(μg)为横坐标(X)，按最小二乘法进行线性回归，结果见下表3。

表3三种对照品线性关系的考察

试验结果表明：绿原酸对照品在0.0977μg～1.954μg范围内，黄芩苷对照品在0.1774μg～3.548μg范围内，连翘苷对照品在0.0156μg～0.3113μg范围内，其进样量(μg)与峰面积呈良好的线性关系。

2.专属性

先按照本样品相同提取路线与工艺路线制备绿原酸、黄芩苷、连翘苷阴性对照样品，再按实施例1中相同方法处理各阴性对照样品，分别精密吸取连翘苷、绿原酸和黄芩苷阴性对照样溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录液相色谱图(见附图1-5)。由液相色谱图可知，在此色谱条件下绿原酸、黄芩苷、连翘苷与其它组分能达到基线分离，理论板数按绿原酸峰计算均不低于1500，且绿原酸、黄芩苷和连翘苷阴性样品在与绿原酸、黄芩苷和连翘苷对照品相应位置上无吸收峰出现。

3.重复性

取装量差异项下的本品内容物研细，称取6份，每份约0.1g，分别按实施列1中样品的配制方法制备样品，再分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见下表4。

表4重复性试验结果

试验结果表明：测得6份样品中绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量的RSD分别为0.14％，0.53％，1.78％，表明本方法的重复性良好。

4.准确度

采用加样回收率试验法，取已知含绿原酸15.91mg/g，含黄芩苷28.74mg/g，含连翘苷2.11mg/g)的样品6份，每份约0.05g，精密称定，置50mL容量瓶中，分别精密加入1.065mg/mL(绿原酸对照品10.65mg加50％甲醇使溶解并稀释至10mL，摇匀，即得)的绿原酸对照品溶液1mL，精密加入1.324mg/mL(黄芩苷对照品13.24mg加甲醇使溶解并稀释至10mL，摇匀，即得)的黄芩苷对照品溶液1mL，精密加入93.99μg/mL(连翘苷对照品9.71mg(含量按96.8％计)加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得)的连翘苷对照品溶液1mL，照实施例1中样品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表5。

表5三种物质回收率试验结果

试验结果表明：各RSD<2,该方法回收率良好。

实施例4十批次样品测定

按实施例1相同的方法，对十批样品进行含量测定，结果见表6。

表6 10批样品含量测定结果

(注：每粒0.5g)

实施例5HPLC指纹图谱的构建

步骤1供试品溶液的制备

取本品约0.4g，研细，精密称定，置25ml量瓶中，加50％甲醇约20ml，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

步骤2对照品溶液的制备

取绿原酸、黄芩苷、木犀草苷、连翘苷对照品适量，置同一25mL的棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得39.08μg/mL绿原酸对照品，70.96μg/mL的黄芩苷对照品，6.23μg/mL的连翘苷对照品，0.50mg/mL的木犀草苷对照品的混合对照品溶液。

步骤3进样测定

分别精密吸取混合对照品溶液与样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表7中的规定进行梯度洗脱；检测波长为277nm，柱温35℃，流速1mL/min，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。

表7梯度洗脱流动相配比表

步骤4对照指纹图谱构建

根据上述供试品测定方法，制备13批次供试品，进样测定，得到13个批次HPLC色谱图(见附图6)，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723版本)，以中位数法建立对照指纹图谱，生成由10个共有峰构成的对照指纹图谱(见附图7)，通过标准品标定其中峰1为绿原酸，峰4为木犀草苷，峰5为连翘苷，峰6为黄芩苷(见附图8)。各供试品指纹图谱相似度见下表8。

表8各供试品与对照指纹图谱相似度一览表

Claims (10)

1.一种金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，所述金柴抗感胶囊由金银花，大青叶，连翘，柴胡，黄芩，桔梗，薄荷脑七味中药原料制成，其特征在于：所述三种成分为绿原酸、黄芩苷、连翘苷，该检测方法包括将待测样品提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250～300nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈和磷酸水溶液组成的混合液，采用梯度洗脱，柱温为30～40℃，理论板数按绿原酸峰计不低于1500。

2.如权利要求1所述的金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，其特征在于，所述待测样品提取的方法是：取金柴抗感胶囊内容物，研细，取0.1g，精密称定，置50mL容量瓶中，加50％甲醇40mL，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3.如权利要求1所述的金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的质量浓度为0.05～0.15％。

4.如权利要求1所述的金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，其特征在于：所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中磷酸水溶液的体积比分别为：0～25min，磷酸水溶液90～96％；25～26min，磷酸水溶液96～75％；26～60min，磷酸水溶液75～83％。

5.如权利要求1所述的金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，其特征在于：所述紫外检测器的设定检测波长为277nm。

6.如权利要求1所述的金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定的方法，其特征在于：所述柱温为35℃。

7.一种金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，所述金柴抗感胶囊由金银花，大青叶，连翘，柴胡，黄芩，桔梗，薄荷脑七味中药原料制成，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：将待测样品提取后作为供试品溶液；

2)混合对照品溶液的制备：制备绿原酸、黄芩苷、木犀草苷、连翘苷的混合对照品溶液；

3)分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液5～20μl，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250～300nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为甲醇和磷酸水溶液组成的混合液，采用梯度洗脱，柱温为30～40℃，理论板数按绿原酸峰计不低于1500；

4)分别记录供试品溶液和混合对照品溶液的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，将供试品溶液和混合对照品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析，

所述供试品溶液HPLC色谱图中有10个共有特征峰，其中峰1为绿原酸，峰4为木犀草苷，峰5为连翘苷，峰6为黄芩苷。

8.如权利要求7所述的金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述待测样品的提取方法是：取金柴抗感胶囊内容物，研细，取0.4g，精密称定，置25mL容量瓶中，加50％甲醇20mL，超声处理20分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

9.如权利要求7所述的金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的质量浓度为0.2％。

10.如权利要求7所述的金柴抗感胶囊HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中磷酸水溶液的体积比分别为：0～8min，磷酸水溶液24～32％；8～10min，磷酸水溶液32～34％；10～50min，磷酸水溶液34～85％。