CN105467023B - 一种uplc测定穿心莲药材指纹图谱及四种二萜内酯的方法 - Google Patents
一种uplc测定穿心莲药材指纹图谱及四种二萜内酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种超高效液相色谱法测定穿心莲药材指纹图谱和穿心莲四种二萜内酯的含量测定方法。制备穿心莲药材供试品溶液，将供试品注入超高效液相色谱仪，在本发明特定的色谱条件下采用梯度洗脱，得到穿心莲药材指纹图谱和穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯的含量。综合其指纹图谱和四种二萜内酯类成分含量测定数据，为判断穿心莲药材真伪、保证穿心莲药材的内在质量、考察稳定性和一致性提供依据，并且在保证穿心莲药材临床的合理应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种穿心莲药材的超高效液相指纹图谱及四种二萜内酯的检测方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees.为爵床科(Acanthaceae)穿心莲属AndrographisWall.exNees.植物，又名一见喜、苦草、四方草、印度草等，主产于广东、福建等地，干燥地上部分作为药用。《中国药典》2010年版一部记载其性寒、味苦，具有清热解毒、凉血、消肿之功效，被广泛用于治疗细菌性痢疾、急性扁桃体炎、尿路感染、流行性感冒和毒蛇咬伤等症。
由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可以全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
穿心莲药材的真伪、内在质量对于后期制剂的工艺规范化控制和临床用药的有效性、安全性和稳定性都具有非常重要的意义，所以寻找到一种比较好的穿心莲药材的鉴别和穿心莲提取物含量的测定方法是极其具有价值的，而且采取多成分指标同时测定，也是保证药材质量和确切疗效行之有效的方法。首先，本发明从鉴别穿心莲药材的方法入手，利用超高效液相色谱法(UPLC)建立穿心莲药材的指纹图谱；并且同时测定了穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯四个穿心莲主要二萜内酯类成分的含量。本发明通过对超高效液相色谱法的提取溶剂、提取时间、提取方式、色谱柱、流动相、梯度洗脱程序以及检测波长等色谱条件进行多方面考察，找到了一种更加准确、快速、灵敏度高、重复性好的鉴定穿心莲药材以及有效成分含量测定的方法。
目前，现有技术中有对穿心莲提取物进行指纹图谱研究的报道，但采用4种参比物，最终只鉴定出7个共有峰，操作相对复杂，而精密度较差。本发明人 有针对性的对这些缺点进行了研究，建立了一种新的标准指纹图谱，利用该图谱对穿心莲药材进行质量监督，以确保产品质量。采用本发明的方法，提取时间短，不需减压干燥，可防止有效成分变性。且色谱峰形和分离度得到了极大的改善。与现有文献选择了7个指纹峰比较，本发明中选取了更多的指纹峰，使得药材质量控制的准确性得到了很大的提高。
发明内容
本发明提供一种穿心莲超高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
1)供试品溶液制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，既得；
2)获得色谱图：
配制穿心莲内酯溶液作为参照物，将供试品溶液和穿心莲内酯溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)生成对照指纹图谱
选择合格的多批穿心莲样品的指纹图谱，以穿心莲内酯峰为参比峰，得到27个共有峰的图谱，用软件，例如“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”(文献：张宇，孙国祥，焦宝明等。冠心苏合丸高效液相色谱数字化定量指纹图谱研究[J].中南药学，2013,11(1).)，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱。
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为247-251nm；
其中梯度洗脱程序如下所示：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min， 61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
优选的本发明所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入20-200倍量(重量体积比)60-80％甲醇-水溶液超声提取20-60min，超声后，放置至室温，用60-80％甲醇-水溶液据体积定容，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2)以穿心莲内酯作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
精密称取穿心莲内酯对照品适量，加60-80％甲醇-水溶解制成0.5～1.5mg/ml的溶液，即得；
3)标准对照指纹图谱的确定，方法如下：
将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
多批穿心莲样品的指纹图谱中共有27个峰为共有峰，计算27个共有指纹峰的相对保留时间和相对保留时间的RSD值，将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，其中，与穿心莲内酯对照品峰保留时间相同的色谱峰为17号峰；
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9的混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm；
其中梯度洗脱程序如下所示：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
最优选的，本发明所述的标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
其中步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水溶液据体积定容，用0.22μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2)以穿心莲内酯作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
精密称取穿心莲内酯对照品适量，加80％甲醇-水溶解制成1mg/ml的溶液，即得。
本发明还提供一种穿心莲的超高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品色谱图的制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为247-251nm；
其中梯度洗脱程序如下所示：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
优选的，本发明指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品色谱图的制备：
精密称定穿心莲药材粉末，加入20-200倍量(重量体积比)60-80％甲醇-水溶液超声提取20-60min，超声后，放置至室温，用60-80％甲醇-水溶液据体积定容，微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度：相似度为0.90以上为合格，相似度为0.95以上为相符。
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm；
其中优选的梯度洗脱程序如下所示：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
最优选的，本发明所述的指纹图谱检测方法，其中，
步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水溶液据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
本发明进一步提供一种超高效液相色谱法测定穿心莲四种二萜内酯类成分含量的方法，该方法包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，既得；
2)标准对照溶液的制备
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品用甲醇水溶液配制成含穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的混合对照品储备液。
3)获得色谱图：
将供试品溶液和标准对照溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的含量；
其中色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为222-226nm。
其中梯度洗脱程序如下所示：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
优选的，本发明测定穿心莲四种二萜内酯类成分含量的方法，该方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入20-200倍量(重量体积比)的60-80％甲醇-水溶液超声提取10-60min，超声后，放置至室温，用60-80％甲醇-水据体积定容，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2)对照品溶液的制备：
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品适量于25ml容量瓶中，用60-80％甲醇-水配制成含穿心莲内酯1000～1500mg/ml，新穿心莲内酯180～220mg/ml，去氧穿心莲内酯180～220mg/ml，脱水穿心莲内酯450～550mg/ml的混合对照品储备液。
3)获得色谱图：
将供试品溶液和标准对照溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心 莲内酯的含量；
其中色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1:9的混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为224nm。
其中优选的梯度洗脱程序如下所示：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
最优选的，本发明测定穿心莲四种二萜内酯类成分含量的方法，其中，
步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入50倍量(重量体积比)的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2)对照品溶液的制备：
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品适量于25ml容量瓶中，用80％甲醇-水配制成含穿心莲内酯1199mg/ml，新穿心莲内酯199mg/ml，去氧穿心莲内酯191mg/ml，脱水穿心莲内酯459mg/ml的混合对照品储备液。
本发明优选的实验方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：
对照品溶液的制备：
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品适量于25ml容量瓶中，用80％甲醇配制成含穿心莲内酯1199mg/ml，新穿心莲内酯199mg/ml，去氧穿心莲内酯191mg/ml，脱水穿心莲内酯459mg/ml的混合对照品储备液。
1、穿心莲药材指纹图谱测定方法学考察
(1)系统适用性试验
取供试品溶液和对照品溶液(5mL对照品储备液加80％甲醇定容至10mL)，采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B；流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm，记录色谱图，并确定共有峰，见图1。比较PDA谱图确定供试品UPLC图中17号峰为穿心莲内酯峰。以17号峰计算，理论塔板数267482，USP分离度1.80，拖尾因子1.01，说明方法的系统适用性良好。
(2)精密度试验
取相同穿心莲药材溶液，采用系统适用性试验中同样的色谱条件连续进样6次，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜2％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
(3)重复性试验
取相同穿心莲药材6份，精密称定，制备供试品溶液，采用系统适用性试验中同样的色谱条件进样进行检测，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜2％，符合指纹图谱技术要求。
(4)稳定性试验
取相同穿心莲供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，24h进样，采用系统适用性试验中同样的色谱条件，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜2％，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2、穿心莲四种二萜内酯类成分含量测定方法学考察
(1)系统适用性
取混合对照品和供试品溶液，采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min， 69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B；流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为224nm，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间，理论塔板数＞50000。供试品样品在224nm下UPLC图，见图2。
(2)线性关系考察
精密供试品溶液和混合对照品溶液各12.5ml，6.25ml，3ml，1.5ml，0.75ml，0.325ml，0.15ml，0.075ml置25ml容量瓶中，加80％甲醇精密稀释至刻度，得到8个不同浓度级别的对照品溶液，按照上述系统适用性所述色谱条件进样测定，以穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程。结果见表1。
表1 四种二萜内酯类成分线性回归方程
(3)加样回收率实验
精密称取9份已知含量的相同穿心莲药材，250mg每份，按照样品中待测成分含量的50％，100％，150％定量加入适宜的混合对照品溶液，制备供试品溶液，得到3种不同质量浓度的溶液各3份，按与系统适用性相同的色谱条件进行测定，计算回收率和RSD值。结果表明，穿心莲内酯的平均回收率为99.37％，RSD值为2.78％；新穿心莲内酯的平均回收率为101.48％，RSD值为2.74％；去氧穿心莲内酯的平均回收率为104.12％，RSD值为1.85％；脱水穿心莲内酯的平均回收率为98.42％，RSD值为3.12％。
(4)重复性试验
精密吸取上述对照品储备液5ml、1ml、0.35ml，分别用80％甲醇定容至10ml，获得浓度不同的3份混合对照品溶液，每份按照与系统适用性相同的色谱条件连续进样3次，测得穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的RSD值均＜1％，说明仪器的精密度良好。
(5)中间精密度
连续3天，每天按照重复性试验项下方法制备3份不同浓度的混合对照品溶液，连续进样3针，测得穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的RSD<2％，说明仪器的日间精密度良好。
(6)稳定性试验
精密对照品储备液5ml于10ml容量瓶中，用80％甲醇定容，分别于0，2，4，6，8，12，24h进样分析，结果穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的RSD分别为2.4％，2.4％，2.0％和1.3％，表明该溶液在24h内稳定性良好。
3、供试品提取条件的筛选
(1)提取方式考察
采用加热回流，超声提取和浸泡过夜三种提取方式处理穿心莲药材，结果如图3所示。结果表明，超声提取的峰个数多且峰形较好，并且超声提取操作简便，因此选择超声提取作为提取方式。
(2)提取溶剂及比例考察
选择甲醇、乙醇和水作为提取溶剂对提取效果进行了考察，结果如图4中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ所示。结果表明，甲醇作为提取溶剂时峰形好且峰个数适中，因此选择甲醇作为提取溶剂。
接下来对提取溶剂的比例进行了考察，选择100％甲醇，80％甲醇-水，60％甲醇-水，40％甲醇-水和20％甲醇-水作为提取溶剂对提取效果进行了考察，结果如图4中Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ所示。结果表明，80％甲醇-水提取的峰形及各峰分离度较好。
(3)提取溶剂用量的考察
取穿心莲药材约500mg，分别用10ml，25ml，50ml和100ml的80％甲醇- 水作为提取溶剂对提取效果进行了考察，结果如图5所示，结果表明，采用25ml溶剂提取的各特征峰紫外响应大都在0.2-0.7之间，且峰形较好，所以选取25ml80％甲醇-水对药材进行提取。
(4)提取时间的考察
分别考察了超声提取10min，20min，40min和60min对穿心莲药材提取效果的影响，结果如图6所示，结果表明，超声时间提高对峰高和峰形没有明显的影响，选择20min作为药材提取时间。
4、色谱条件的选择
(1)色谱柱选择
考察三种不同型号色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS C18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters公司)；ACQUITY UPLC BEHC18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters公司)。结果如图7所示，结果表明，BEH C18柱分离出的色谱峰数目多且不脱尾，分离度高。
(2)流动相的选择
由于穿心莲药材的化学成分复杂，要在同一色谱条件下达到良好分离选择梯度洗脱系统。
①流动相-A水相的选择
A相单纯使用二纯水时，分离效果不佳，曾尝试过甲醇-水和乙腈-水系统，分离效果也不佳，又在两相中均加入不同浓度的甲酸、乙酸和磷酸来改善分离度，发现加入甲酸优于乙酸和磷酸。所以尝试加入不同浓度的甲酸来改善分离度，分别考察了0.1％甲酸、0.2％甲酸和0.3％的甲酸，结果如图8所示，结果表明，水相加入0.3％甲酸时峰形较好。
②流动相-B有机相的选择
单纯使用乙腈时，分离效果不佳，尝试了混合有机相，在B相中加入一定比例的甲醇时，分离效果得到极大改善。固定流动相A为0.3％甲酸水考察流动相B，流动相B分别采用乙腈、10％甲醇乙腈、20％甲醇乙腈和30％甲醇乙腈，结果如图9所示，结果表明，乙腈-0.3％甲酸水：峰形差，无法达到基线分离；10％甲醇乙腈-0.3％甲酸水：分离度显著提高，峰形尖锐；20％甲醇乙腈-0.3％甲酸水：增加B相中甲醇比例由10％至20％，对峰形和分离度无显著影响；30％ 甲醇乙腈-0.3％甲酸水：增加甲醇比例至30％后，峰形变差，无法分离。所以为保证分离效果，B相中甲醇比例应当控制在10％～20％之间，所以流动相B采用甲醇：乙腈＝1：9～2：8比较适合，但是甲醇：乙腈＝1：9为最优比例。
(3)检测波长的选择
取穿心莲药材样品溶液，分别在以上色谱条件下进样，用PDA检测器对样品进行200～400nm全波长扫描，比较各波长下色谱图：在249nm处，色谱峰个数较多，分离度好，响应合理，因此选定249nm为指纹图谱的测定波长；在224nm处，4种内酯类成分的响应高，峰形对称，因此选择224nm为4种内酯类成分的含量测定波长。
(4)耐用性实验
Plackett-Burman试验(文献：SaratBabuImandi,SitaKumariKaranam,andHanumanthaRaoGarapati.Use of Plackett-Burman design for rapid screening ofnitrogen and carbon sources for the production of lipase in solid statefermentation by Yarrowialipolytica from mustard oil cake(Brassica napus).BrazJ Microbiol.2013,44(3):915–921.)是用来确定众因子相对于响应变量的影响而采用的试验设计方法，对每个因子取两水平(±1)来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。Pareto图(文献：Dhuria RS,Bhatti R,Bhatti MS,etal.Experimental design optimization for electrochemical removal ofgentamicin:toxicity evaluation and degradation pathway.WaterSci Technol.2013,67(9):2017-2024.)是柱状图，按事件发生的频率排序而成，它显示由于各种原因引起的缺陷数量或不一致的排列顺序，是找出影响响应变量的主要因素的方法。
选取流动相pH值，流动相整体比例，波长，柱温，流速，进样量6个因素考察方法的耐用性。耐用性考察采用Plackett-Burman实验设计，通过12次实验，以样品中4种内酯类成分的含量测定结果为响应值，考察了6个因素的变动对分析结果的影响，因素水平和实验设计见表2。
表2 Plackett-Burman试验因素水平表
将穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量测定结果数据标准化处理后，使用minitab软件对实验结果进行了统计分析，得到6种因素的标准化效应pareto图，各因素按照对结果影响程度大小降序排列，见图10。
结果表明，6个因素对穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量测定结果的影响都不显著(α＞0.05)，说明方法的耐用性良好。
依据本结果，所以选择流动相A为0.2％-0.4％(优选为：0.3％)甲酸水溶液；进样量为1-3μL(优选为：2μL)；色谱柱温度20℃-30℃(优选为：25℃)；以穿心莲内酯为参照物，内酯类成分含量测定波长为222-226nm(优选为：224nm)。
本发明的有益效果：
1)本发明采用的穿心莲药材提取方法缩短了药材的提取时间，并且提取时不需要减压干燥，防止有效成分变性。
2)本发明选择的流动相为混合有机相，经验证分离效果更好、峰形也更好。
3)本发明采用的穿心莲药材指纹图谱测定方法，选取了27个共有指纹峰，与现有技术相比较，不仅可以通过药材入药部位相似度是否符合要求而评价穿心莲；而且能够区分不同产地和不同部位穿心莲药材的差异。
4)本发明建立的超高效液相色谱法测定穿心莲的指纹图谱，通过色谱指纹图谱可以全面反映穿心莲的化学成分及各特征性有效成分峰面积的相对比例，进而反映穿心莲药材的内在质量，为穿心莲药材判断真伪、考察稳定性和一致性提供依据。同时，本发明对穿心莲药材中的四个主要二萜内酯类活性成分同时进行含量测定，对于评价穿心莲药材的优劣，保证穿心莲药材临床的合理应用具有重要意义。本发明所建立的质量评价方法快速准确、灵敏度高、重复性好,既能用于穿心莲药材真伪的鉴别，又能用于其质量优劣的评价。
附图说明
图1穿心莲药材典型UPLC指纹
图2 224 nm下混合对照品和穿心莲样品UPLC图(A.混合对照品；B.穿心莲样品；1.穿心莲内酯；2.新穿心莲内酯；3.去氧穿心莲内酯；4.脱水穿心莲内酯。)
图3不同提取方式处理穿心莲药材的考察图(Ⅰ为加热回流提取，Ⅱ为超声提取，Ⅲ为浸泡过夜)
图4采用不同提取溶剂及比例处理穿心莲药材的考察图(Ⅰ为100％甲醇，Ⅱ为100％水，Ⅲ为100％乙醇，Ⅳ为80％甲醇-水，Ⅴ为60％甲醇-水，Ⅶ为40％甲醇-水，Ⅶ为20％甲醇-水)
图5采用不同提取溶剂用量处理穿心莲药材的考察图(Ⅰ为10ml提取溶剂，Ⅱ为25ml提取溶剂，Ⅲ为50ml提取溶剂，Ⅳ为100ml提取溶剂)
图6采用不同提取时间处理穿心莲药材的考察图(Ⅰ超声10min，Ⅱ超声20min，Ⅲ超声40min，Ⅳ超声60min)
图7不同色谱柱对穿心莲药材分离效果的影响
图8流动相-A水相的选择(Ⅰ为A相不加甲酸，Ⅱ为A相加0.1％甲酸，Ⅲ为A相加0.2％甲酸，Ⅳ为A相加0.3％的甲酸)
图9流动相-B有机相的选择(Ⅰ乙腈-0.3％甲酸水；Ⅱ10％甲醇乙腈-0.3％甲酸水；Ⅲ20％甲醇乙腈-0.3％甲酸；Ⅳ30％甲醇乙腈-0.3％甲酸)
图10 Plackett-Burman试验6种因素标准化效应pareto图
图11 23批穿心莲药材UPLC指纹图谱和标准对照指纹图谱
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
Acquity UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower3色谱工作站)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS105型十万分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MilliporeSimplicity超纯水系统。
乙腈、甲醇(色谱级，Merck)；甲酸(色谱级，天津光复精细化工研究所)；穿心莲内酯对照品(批号：201007)，脱水穿心莲内酯对照品(批号：201007) 购于中国食品药品检定研究院；新穿心莲内酯对照品(批号：AD728N，含量98.18％)，去氧穿心莲内酯对照品(批号：AD159D，含量99.18％)购于天津一方科技公司。
穿心莲药材采购自广东、广西、福建等地药材供应商，经上海中医药大学侴桂新教授鉴定为穿心莲Andrographispaniculata(Burm.F.)Nees，实验前粉碎成穿心莲药材粉末。
各样品编号和信息见表3。
表3 23批穿心莲药材信息
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入25mL 80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm。
步骤3：穿心莲药材指纹图谱测定
取表3中的23批穿心莲药材样品，按照步骤1制备供试品溶液，采用步骤2的色谱条件进行检测，得到23批穿心莲药材UPLC指纹图谱，将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，图谱如图11所示。
以17号峰(穿心莲内酯)为参比峰，计算27个共有指纹峰的相对保留时间及相对保留时间RSD值，结果如表4所示。
表4 27个共有指纹峰的相对保留时间及相对保留时间RSD值
计算23批样品与对照图谱的相似度，分别为0.586，0.591，0.987，0.989，0.995，0.951，0.982，0.957，0.954，0.976，0.990，0.945，0.994，0.876，0.553，0.998，0.990，0.999，0.934，0.839，0.978，0.999，0.974其中S1，S2，S15的相似度低，说明穿心莲杆部位各成分含量比例与全草和叶部位有差别。
实施例2
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入25mL 80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。流动相A为0.3％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为224nm。
步骤3：穿心莲四种二萜内酯类成分含量测定
取表3中的23批穿心莲药材样品精密称取，按照步骤1制备供试品溶液， 采用步骤2的色谱条件测定穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯的含量，结果见表5。
表5 23批穿心莲药材4种二萜内酯类成分含量测定结果
实施例3
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入10mL 60％甲醇-水溶液超声提取40min，超声后，放置至室温，用60％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，88％→80％B；2～3min，80％B；3～5min，80％→79％B；5～7min，79％→78％B；7～7.5min，78％→72％B；7.5～8min，72％B；8～9min，72％→68B；9～11min，68→63B；11～12min，63→61B；12～13min，61B；13～15min，61→38％B；15～17min，38％→23％B；17～19min，23％→88％B；19～21min，88％B。流动相A为0.2％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝2：8混合溶液；进样量为1μL；色谱柱温度20℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm。
步骤3：穿心莲药材指纹图谱测定
将步骤1制备的供试品溶液，采用步骤2的色谱条件进行检测，得到穿心莲药材UPLC指纹图谱，将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱。
实施例4
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入100mL 60％甲醇-水溶液超声提取10min，超声后，放置至室温，用60％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，82％→74％B；2～3min，74％B；3～5min，74％→73％B；5～7min，73％→72％B；7～7.5min，72％→66％B；7.5～8min，66％B；8～9min，66％→62％B；9～11min，62％→57％B；11～12min，57％→55％B；12～13min，55％B；13～15min，55％→32％B；15～17min，32％→17％B；17～19min，17％→82％B；19～21min，82％B。
流动相A为0.4％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9混合溶液；进 样量为3μL；色谱柱温度30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm。
步骤3：穿心莲药材指纹图谱测定
将步骤1制备的供试品溶液，采用步骤2的色谱条件进行检测，得到穿心莲药材UPLC指纹图谱，将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱。
实施例5
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入50mL 80％甲醇-水溶液超声提取60min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，88％→80％B；2～3min，80％B；3～5min，80％→79％B；5～7min，79％→78％B；7～7.5min，78％→72％B；7.5～8min，72％B；8～9min，72％→68B；9～11min，68→63B；11～12min，63→61B；12～13min，61B；13～15min，61→38％B；15～17min，38％→23％B；17～19min，23％→88％B；19～21min，88％B。流动相A为0.3％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝2：8；进样量为3μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为224nm。
步骤3：穿心莲四种二萜内酯类成分含量测定
将步骤1制备的供试品溶液，采用步骤2的色谱条件测定穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯的含量。
实施例6
步骤1：供试品溶液的制备
取穿心莲药材粉末500mg，精密称定。加入25mL 60％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用60％甲醇-水据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2：色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2min，82％→74％B；2～3min，74％B；3～5min，74％→73％B； 5～7min，73％→72％B；7～7.5min，72％→66％B；7.5～8min，66％B；8～9min，66％→62％B；9～11min，62％→57％B；11～12min，57％→55％B；12～13min，55％B；13～15min，55％→32％B；15～17min，32％→17％B；17～19min，17％→82％B；19～21min，82％B。流动相A为0.2％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9；进样量为1μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为224nm。
步骤3：穿心莲四种二萜内酯类成分含量测定
将步骤1制备的供试品溶液，采用步骤2的色谱条件测定穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯的含量。
Claims (9)
1.一种穿心莲超高效液相标准对照指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，即得；
2)获得色谱图：
配制穿心莲内酯溶液作为参照物，将供试品溶液和穿心莲内酯溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)生成对照指纹图谱：
选择合格的多批穿心莲样品的指纹图谱，以穿心莲内酯峰为参比峰，得到27个共有峰的图谱，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱；
其中色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8的混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为247-251nm；其中梯度洗脱程序如下：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
2.根据权利要求1所述的标准对照指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为20-200倍量的60％～80％甲醇-水溶液超声提取20-60min，超声后，放置至室温，用60％～80％甲醇-水溶液据体积定容，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2)获得色谱图，方法如下：
精密称取穿心莲内酯对照品适量，加60％～80％甲醇-水溶解制成0.5～1.5mg/ml的溶液，即得，将供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)生成对照指纹图谱，方法如下：
将多批穿心莲样品的指纹图谱中27个共有峰，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，其中，与穿心莲内酯对照品峰保留时间相同的色谱峰为17号峰；
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9的混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm；其中梯度洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
3.根据权利要求2所述的标准对照指纹图谱的建立方法：
其中，
步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水溶液据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤2)获得色谱图，方法如下：
精密称取穿心莲内酯对照品适量，加80％甲醇-水溶解制成1mg/ml的溶液，即得，将供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图。
4.一种穿心莲超高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品色谱图的制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；
2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
将待测样品的色谱图按平均值法进行计算，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8的混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为247-251nm；其中梯度洗脱程序如下：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
5.根据权利要求4的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品色谱图的制备：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为20-200倍量60-80％甲醇-水溶液超声提取10-60min，超声后，放置至室温，用60-80％甲醇-水溶液据体积定容，微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
2)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度，相似度为0.90以上为合格，相似度为0.95以上为相符；
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9的混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；以穿心莲内酯为参照物，检测波长为249nm；其中梯度洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
6.根据权利要求5的指纹图谱检测方法，其特征在于，
其中步骤1)待测样品色谱图的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水溶液据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
7.一种超高效液相色谱法测定穿心莲四种二萜内酯类成分含量的方法，该方法包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：
取穿心莲，采用甲醇水溶液进行提取，再加入甲醇水溶液调整溶液浓度，滤过，取滤液，即得；
2)标准对照溶液的制备
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品用甲醇水溶液配制成含穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的混合对照品储备液；
3)获得色谱图：
将供试品溶液和标准对照溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的含量；
其中色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.2％-0.4％甲酸水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9～2：8的混合溶液；进样量为1-3μL；色谱柱温度20℃-30℃；检测波长为222-226nm；其中梯度洗脱程序如下所示：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
8.根据权利要求7的方法，该方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为20-200倍量60-80％甲醇-水溶液超声提取10-60min，超声后，放置至室温，用60-80％甲醇-水溶液据体积定容，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品，用60-80％甲醇-水溶液配制成含穿心莲内酯1000～1500mg/ml，新穿心莲内酯180～220mg/ml，去氧穿心莲内酯180～220mg/ml，脱水穿心莲内酯450～550mg/ml的混合对照品储备液；
3)获得色谱图：
将供试品溶液和标准对照溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的含量；
其中，色谱条件如下：采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱，填料粒径1.7μm，色谱柱内径2.1mm，长100mm；梯度洗脱；流动相A为0.3％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇：乙腈＝1：9的混合溶液；进样量为2μL；色谱柱温度25℃；检测波长为224nm；其中梯度洗脱程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。
9.根据权利要求8的方法，其中，
步骤1)供试品溶液的制备，方法如下：
精密称定穿心莲药材粉末，加入重量体积比为50倍量的80％甲醇-水溶液超声提取20min，超声后，放置至室温，用80％甲醇-水溶液据体积定容，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备，方法如下：
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品，用80％甲醇-水溶液配制成含穿心莲内酯1199mg/ml，新穿心莲内酯199mg/ml，去氧穿心莲内酯191mg/ml，脱水穿心莲内酯459mg/ml的混合对照品储备液。
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