CN102335211A - 穿心莲提取物及其化学成份在制备治疗病理性血管新生疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了穿心莲提取物或穿心莲二萜内酯类化合物及其衍生物在制备防治病理性血管新生疾病的药物中的应用。本发明发现穿心莲具有调控血管新生的作用，适用于常常出现在慢性炎症与纤维化、肿瘤生长与转移、肥胖、糖尿病视网膜疾病、糖尿病肾病、银屑病、风湿性关节炎、子宫内膜异位症等病理性血管新生的治疗，可用于制备抗病理性血管新生的药物，实现了中药穿心莲作为制备治疗病理性血管新生药物的应用，开拓了中药穿心莲应用范围和药物价值，为中医药学的发展作出创造性贡献。

Description

穿心莲提取物及其化学成份在制备治疗病理性血管新生疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种具有调控血管新生作用的穿心莲提取物及其化学成份的医药新用途。 

背景技术

血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管网，是机体严格控制的一个多因素、级联、整体、动态的过程。在病理因素作用下，促血管生成因子异常表达，打破了机体对血管形成的动态调控平衡，原来静止的血管内皮细胞将迅速增生，新生血管异常形成，常常出现在慢性炎症与纤维化、肿瘤生长与转移、肥胖、糖尿病视网膜疾病、糖尿病肾病、银屑病、风湿性关节炎、子宫内膜异位症等疾病中。 

穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrograpis panniculata Nees的全草或叶，主产于中国、印度和部分南亚地区。味苦，性寒，归肺、胃、肝经。功效清热解毒，凉血消肿。古代常用于治疗感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤等。穿心莲的主要成分有内酯、甾醇、多种黄酮类化合物、生物碱，还有少量蛋白质和维生素等，其活性成分主要是以穿心莲内酯为代表的二萜内酯类化合物及其葡萄糖苷衍生物。国内外研究表明，穿心莲内酯及其衍生物对中毒性肝损害的抵抗活性，利胆活性，对机体非特异免疫功能的调节作用，抗HIV活性，对心、脑缺血的保护作用，抗生育作用均有良好的活性。近年来，在抗肿瘤方面的研究更突显出了穿心莲内酯的作用，对胃癌、肝癌、肺癌、乳癌、恶性葡萄胎及绒毛膜上皮癌等均具有良好的抗肿瘤作用。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提出穿心莲提取物及其化学成份的医药新用途。 

通过体内体外实验研究，发明人首次发现穿心莲提取物及其化学成份能够显著性地抑 制血管内皮生长因子诱导的血管新生，其中穿心莲内酯类化合物，尤其是穿心莲内酯活性最强，并阐明其分子机制。穿心莲内酯首次被确认为潜在性的血管内皮生长因子抑制剂，可以作为治疗病理性血管新生疾病的候选者。 

本发明的穿心莲提取物的制备过程并无特别之处。将中药穿心莲叶打粉，用水、20％～95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、汽油或石油醚回流提取，加入常见药用辅料制成任何一种药学上所说的剂型，优选浸膏、流浸膏、酒剂、酊剂、口服液、丸剂、散剂、滴丸、片剂或胶囊剂。 

本发明的穿心莲提取物具有防治病理性血管新生疾病的作用很可能与如下物质的作用密切相关：穿心莲中的二萜内酯类物质，尤其是穿心莲内酯、异穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、8-甲基穿心莲内酯苷元、新穿心莲内酯苷元以及它们的衍生物。 

随后的药效实验将证明，穿心莲提取物及穿心莲中的二萜内酯类化合物可治疗糖尿病视网膜病、肿瘤、风湿性关节炎、子宫内膜异位症、糖尿病肾病、银屑病等多种病理性血管新生疾病。穿心莲是药食兼用的纯天然的植物提取物，具有高效的调控血管新生作用并治疗病理性血管新生疾病。 

附图说明

图1是穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞ERK1/2磷酸化的影响图。 

图2是穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞p38磷酸化的影响图。 

图3是穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞JNK/SAPK磷酸化的影响图。 

图4是穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞VEGFR2磷酸化的影响图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。 

实施例1(穿心莲提取物抑制血管内皮生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs的生长、迁移和管腔形成) 

本发明首先考察穿心莲提取物对VEGF诱导HUVECs生长、迁移和管腔形成的影响。 

1.1实验材料： 

1.1.1.新生儿脐带 

由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。 

1.1.2.药物及其制备 

穿心莲水提物：采用穿心莲叶粗粉，用10倍量水提取三次，每次3h，滤液合并后减压浓缩至穿心莲生药计浓度2g/mL，即得穿心莲水提物。 

I型胶原酶、肝素、明胶和溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二甲苯基四氮唑(MTT)购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)、Matrigel、M199培养液、0.25％胰蛋白酶和促内皮细胞生长添加物(ECGS)购自美国Invitrogen公司。血管内皮生长因子(VEGF)购自美国PeproTech公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 

1.2实验方法： 

1.2.1人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养 

无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集 沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。 

1.2.2药物抑制细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

1.2.3药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，加入待测药物15分钟后，加入生长因子(VEGF或bFGF)与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

1.2.4迁移实验 

Transwell小室用0.1％明胶包被1h后，取出晾干，将消化好的人脐静脉内皮细胞用无血清培液洗3次，稀释为4×10⁵/ml，于上室加入100ul(4×10⁴cells/well)细胞悬液。下室加入600μl的无血清培液，并加入VEGF(10ng/ml)，穿膜8小时。吸去上下室培液，以4℃ 4％多聚甲醛室温固定30min，用棉签擦去内室上层未迁移细胞，0.1％结晶紫常温染色10min。以PBS漂洗多余染。显微镜下拍照并计数，最后用10％乙酸100ul/孔抽提10min，用酶标仪600nm下测定OD值。 

1.2.5管腔形成实验 

96孔板每孔铺上冷的液体基质胶30μl，在37℃下固化45分钟。每孔加100μl细胞悬液(1×10⁴cells/well)同时加不同浓度的药物或对照，孵育4小时。用倒置差像显微镜记录图像，计算完整的管腔形成数。 

1.2.6统计学处理 

实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为具有统计学显著性差异标准。 

1.3实验结果 

1.3.1穿心莲提取物对HUVEC人脐静脉内皮细胞静息期和血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖影响 

由表1可见，穿心莲提取物于0-17.5μg/ml，对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖无影响，说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞毒性。穿心莲提取物于3.5μg/ml时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性 

表1穿心莲提取物对人脐静脉内皮细胞HUVECs静息期和血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖影响(n＝15) 

与溶媒组比较，^**P＜0.01；^***P＜0.001； 

1.3.2穿心莲提取物对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs迁移的影响。 

由表2可见，穿心莲提取物于0-17.5μg/ml，穿心莲提取物于1.75μg/ml时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的迁移，并呈剂量依赖性。 

表2穿心莲提取物对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs迁移的影响(n＝6) 

与溶媒组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***P＜0.001； 

1.3.3穿心莲提取物对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs管腔形成的影响。 

由表3可见，穿心莲提取物于0-17.5μg/ml，穿心莲提取物于0.7μg/ml时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的管腔形成，并呈剂量依赖性。 

表3穿心莲提取物对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs管腔形成的影响(n＝9) 

与溶媒组比较，^*P＜0.05；^***P＜0.001； 

实施例2(穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的人脐静脉内皮细胞的生长、迁移和管腔形成的影响)。 

在确定了穿心莲提取物具有较强的抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs生长、迁移和管腔形成的作用，本发明进一步考察了穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的人脐静脉内皮细胞的生长、迁移和管腔形成的影响 

2.1实验材料： 

2.1.1新生儿脐带 

由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20em左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。 

2.1.2药物 

穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物从穿心莲叶中分离提取的单体化合物，均由上海中医药大学中药研究所提供，其结构主要经¹HNMR和¹³CNMR鉴定，纯度98％以上(结构如式1所示)。 

2.1.3试剂 

I型胶原酶、肝素、明胶和溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二甲苯基四氮唑(MTT)购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)、Matrigel、M199培养液、0.25％胰蛋白酶和促内皮细胞生长添加物(ECGS)购自美国Invitrogen公司。血管内皮生长因子(VEGF)购自美国PeproTech公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 

2.2实验方法： 

2.2.1药物配制 

穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物用二甲基亚枫(DMSO)溶解，配成母液浓度为0.1mol/L，母液均用一次性灭菌滤器(0.22μM)过滤灭菌。加药时用无血清M199培养基配制浓度：25μM，使DMSO在培养中总浓度不超过0.1％。 

2.2.2人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养 

无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。 

2.2.3药物抑制细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

2.2.4药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞 贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，加入待测药物15分钟后，加入生长因子(VEGF或bFGF)与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

2.2.5迁移实验 

Transwell小室用0.1％明胶包被1h后，取出晾干，将消化好的人脐静脉内皮细胞用无血清培液洗3次，稀释为4×10⁵/ml，于上室加入100ul(4×10⁴cells/well)细胞悬液。下室加入600μl的无血清培液，并加入VEGF(10ng/ml)，穿膜8小时。吸去上下室培液，以4℃4％多聚甲醛室温固定30min，用棉签擦去内室上层未迁移细胞，0.1％结晶紫常温染色10min。以PBS漂洗多余染。显微镜下拍照并计数，最后用10％乙酸100ul/孔抽提10min，用酶标仪600nm下测定OD值。 

2.2.6管腔形成实验 

96孔板每孔铺上冷的液体基质胶30μl，在37℃下固化45分钟。每孔加100μl细胞悬液(1×10⁴cells/well)同时加不同浓度的药物或对照，孵育4小时。用倒置差像显微镜记录图像，计算完整的管腔形成数。 

2.2.7统计学处理 

实验数据均用平均值土标准误表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为具有统计学显著性差异标准。 

2.3实验结果： 

2.3.1穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)静息期和血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖影响。 

由表4可见，中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、14- 去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯苷元、8-甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于25μM时，均对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖无影响，说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞毒性，但同时能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的增殖。 

表4穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对HUVECs静息期和VEGF诱导期生长抑制率(％)的影响 

与溶媒组比较，^***P＜0.001； 

2.3.2穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞迁移的影响。 

由表5可见，中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯苷元、8-甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于25μM时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的迁移。 

表5穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对VEGF诱导HUVECs迁移抑制率(％)的影响 

与溶媒组比较，^***P＜0.001； 

2.3.3穿心莲植物中二萜内酯类化合物对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响。 

由表6可见，中药穿心莲中二萜内酯类化合物新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯苷元、8-甲基穿心莲内酯苷元和穿心莲内酯于25μM时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的管腔形成。 

表6穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物对VEGF诱导HUVECs管腔形成抑制率(％)的影响 

与溶媒组比较，^***P＜0.001； 

实施例3(穿心莲内酯抑制血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的人脐静脉内皮细胞的生长、迁移和管腔形成的药效药理试验)。 

在确定了穿心莲植物中二萜内酯类代表化合物均具有较强的抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs生长、迁移和管腔形成的作用，本发明进一步考察了穿心莲内酯不同浓度对血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的人脐静脉内皮细胞的生长、迁移和管腔形成的影响。 

3.1实验材料： 

3.1.1新生儿脐带 

由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。 

3.1.2药物 

穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物，均由上海中医药大学中药研究所提供，其结构主要经¹HNMR和¹³CNMR鉴定，纯度98％以上(结构如式1所示)。 

3.1.3试剂 

I型胶原酶、肝素、明胶和溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二甲苯基四氮唑(MTT)购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)、Matrigel、M199培养液、0.25％胰蛋白酶和促内皮细胞生长添加物(ECGS)购自美国Invitrogen公司。血管内皮生长因子(VEGF)购自美国PeproTech公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 

3.2实验方法： 

3.2.1药物配制 

穿心莲内酯用二甲基亚枫(DMSO)溶解，配成母液浓度为0.1mol/L，母液均用一次性灭菌滤器(0.22μM)过滤灭菌。加药时用无血清M199培养基配制所需的5个浓度，使DMSO在培养中总浓度不超过0.1％。 

3.2.2人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养 

无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素， 于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。 

3.2.3药物抑制细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时加入待测药物与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

3.2.4药物抑制生长因子诱导细胞增殖实验 

取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液，按一定的浓度铺入96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，加入待测药物15分钟后，加入生长因子(VEGF或bFGF)与细胞共孵48小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)置培养箱反应4小时，加入50μl三联剂(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCL)于培养箱中充分溶解12小时以上，最后在OD570/630nm处测定吸光值。细胞存活率(％)＝给药组OD(570nm-630nm)/对照组OD(570nm-630nm)×100％，对照组加含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。 

3.2.5迁移实验 

Transwell小室用0.1％明胶包被1h后，取出晾干，将消化好的人脐静脉内皮细胞用无血清培液洗3次，稀释为4×10⁵/ml，于上室加入100ul(4×10⁴cells/well)细胞悬液。下室加入600μl的无血清培液，并加入VEGF(10ng/ml)，穿膜8小时。吸去上下室培液，以4℃4％多聚甲醛室温固定30min，用棉签擦去内室上层未迁移细胞，0.1％结晶紫常温染色10min。以PBS漂洗多余染。显微镜下拍照并计数，最后用10％乙酸100ul/孔抽 提10min，用酶标仪600nm下测定OD值。 

3.2.6管腔形成实验 

96孔板每孔铺上冷的液体基质胶30μl，在37℃下固化45分钟。每孔加100μl细胞悬液(1×10⁴cells/well)同时加不同浓度的药物或对照，孵育4小时。用倒置差像显微镜记录图像，计算完整的管腔形成数。 

3.2.7统计学处理 

实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为具有统计学显著性差异标准。 

3.3实验结果： 

3.3.1穿心莲内酯(Andro)对人脐静脉内皮细胞静息期和血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖影响。 

由表7可见，穿心莲内酯于0-25μM，对静息期人脐静脉内皮细胞的增殖无影响，说明对人脐静脉内皮细胞无明显的细胞毒性。由图3可见，穿心莲内酯于10μM时，能够显著性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性 

表7穿心莲内酯对人脐静脉内皮细胞HUVECs静息期和血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖影响(n＝15) 

与溶媒组比较，^**P＜0.01；^***P＜0.001； 

3.3.2.穿心莲内酯(Andro)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞迁 移的影响。 

由表8可见，穿心莲内酯于2.5μM时，能够明显性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性。 

表8穿心莲提取物对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs迁移的影响(n＝6) 

与溶媒组比较，^**P＜0.01；^***P＜0.001； 

3.3.3.穿心莲内酯(Andro)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响。 

由表9可见，穿心莲内酯于2.5μM时，能够明显性地抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性。 

表9穿心莲内酯对血管生长因子VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs管腔形成的影响(n＝6) 

与溶媒组比较，^***P＜0.001； 

实施例4(穿心莲内酯抗血管新生活性的分子机制实验) 

在确定了穿心莲植物中穿心莲内酯具有较强的抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs生长、迁移和管腔形成的作用，本发明进一步考察了穿心莲内酯抗血管新生活性的分子机制 

4.1实验材料： 

4.1.1新生儿脐带 

由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。 

4.1.2药物 

穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物，均由上海中医药大学中药研究所提供，其结构主要经¹HNMR和¹³CNMR鉴定，纯度98％以上(结构如式1所示)。 

式1穿心莲内酯结构式 

4.1.3试剂 

胎牛血清(FBS)、M199培养液、0.25％胰蛋白酶和促内皮细胞生长添加物(ECGS)购自美国Invitrogen公司。血管内皮生长因子(VEGF)购自美国PeproTech公司。ERK1/2磷酸化蛋白、ERK1/2总蛋白、p38磷酸化蛋白、p38总蛋白、JNK/SAPK磷酸化蛋白、 JNK/SAPK总蛋白、VEGFR2磷酸化蛋白、VEGFR2总蛋白、山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购自Cell Signaling Technology公司，硝酸纤维素膜和预染的标准蛋白分子购自BioRad公司，化学发光检测系统购自Amersham Pharmacia Biotech生物技术公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 

4.2实验方法： 

4.2.1蛋白电泳实验方法 

贴壁的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)换成1％FBS后，加不同浓度的穿心莲内酯6h后，加VEGF(50ng/ml)作用5min后，收集细胞用裂解液(50mM Tris(Ph 7.5)，1mM EDTA，150mM NaCl，20mM NaF，0.5％NP-40，10％glycerol，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，10μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin，10μg/mL pepstatin A)来进行裂解，调整成等浓度等体积的样本。将制备好的样本用SDS-PAGE胶进行电泳。转膜后上待检测的一抗，4℃摇床过夜后，上相应的二抗。ECL显色后，用X光片曝光成像。为了重复利用蛋白印记，我们用Stripping buffer(62.5mM Tris(Ph 6.7)，20％SDS and 0.1M 2-mercaptoethanol)于50℃水浴30分钟，将上过的一抗去除掉，再重新上新的一抗。 

4.3实验结果： 

4.3.1穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导人脐静脉内皮细胞的MAPK磷酸化的影响。 

由图2-4可见，穿心莲内酯能够于10μM时明显地抑制VEGF诱导的ERK1/2磷酸化，呈剂量依赖性，同时，于5μM时明显地抑制VEGF诱导的JNK/SAPK磷酸化，呈剂量依赖性但对VEGF诱导的p38磷酸化无影响。 

4.3.2.穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的VEGFR2磷酸化的影响 

由图4可见，穿心莲内酯能够于5μM时明显地抑制VEGF诱导的VEGFR2磷酸化，并呈剂量依赖性。 

实施例5(穿心莲提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物抑制血管内皮生长因子VEGF诱导小鼠体内血管新生的药效药理试验。) 

通过体外实验发现穿心莲提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物具有明显的抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs生长、迁移和管腔形成，进一步首次考察了穿心莲提取物和穿心莲植物中二萜内酯类化合物抑制血管内皮生长因子VEGF诱导小鼠体内血管新生。 

5.1实验材料： 

5.1.1动物 

C57小鼠，雄性，6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号：SCXK(沪2007-0005)。小鼠饲养温度(22±1)℃，相对湿度(65±10)％，照明时间每天12h。 

5.1.2药物 

穿心莲水提物：采用穿心莲叶粗粉，用10倍量水提取三次，每次3h，滤液合并后减压浓缩至穿心莲生药计浓度2g/mL，即得穿心莲水提物。 

穿心莲内酯是从穿心莲叶中分离提取的单体化合物，均由上海中医药大学中药研究所提供，其结构主要经¹HNMR和¹³CNMR鉴定，纯度98％以上(结构如式1所示)。 

5.1.3试剂 

肝素购自美国Sigma公司。Matrigel购自美国Invitrogen公司。血管内皮生长因子(VEGF)购自美国PeproTech公司。实验中所用其它试剂均为国产分析纯。 

5.2实验方法： 

5.2.1小鼠体内血管新生实验 

取VEGF(10ng/ml)、肝素(30U/ml)和受试药物与冰浴中的Matrigel 500μl混匀，皮下注射于C57BL/6小鼠腹中线。7d后，断颈处死小鼠，手术切开腹部皮肤，取出Matrigel种植体，生理盐水清洗3次，拍照。将matrigel冻干，用0.1％Trito-X裂解1h后，离心14000g，15min后，吸取上清于405nm处读值，根据血红蛋白标准曲线，测各Matrigel中血红蛋白含量。 

5.3实验结果： 

5.3.1穿心莲提取物和穿心莲内酯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导小鼠体内血管新生的影响 

由表10可见，穿心莲提取物和穿心莲内酯均能够显著性地抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导小鼠体内新生血管量及血红蛋白量，并呈浓度依赖性。 

表10穿心莲提取物和穿心莲内酯抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导小鼠体内的血管新生 

与溶媒组比较，^＊P＜0.05；^＊＊P＜0.01；^＊＊＊P＜0.001 

实施例6(流浸膏剂的制备) 

取穿心莲各500g，打粉，用75％乙醇作溶剂，浸渍48h，缓缓渗漉，收集初漉液425mL，另器保存；继续渗漉，到渗漉液接近无色为止，收集续漉液，在55℃浓缩至稠膏状，加入初漉液425mL混匀，用70％乙醇稀释至500mL，静置3d，滤过，即得。 

实施例7(片剂的制备) 

取穿心莲500g，打粉，过100目筛。喷入适量75％乙醇，加入17.5％微晶纤维素，其中内加7.5％微晶纤维素和20％淀粉，制成颗粒，干燥，外加10％微晶纤维素和1％的硬脂酸镁，混匀压片。 

实施例8(滴丸剂的制备) 

取穿心莲500g，打粉，用75％乙醇回流提取3次，每次2h，回收乙醇得浸膏，以PGE4000为基质，与药物的比例为1∶1.5，二甲基硅油为冷凝剂，滴制。 

实施例9(胶囊剂的制备) 

取穿心莲500g，打粉，用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，回收乙酸乙酯得浸膏，干燥，粉碎，过100目筛，加入5％硬脂酸镁，混匀装入硬胶囊。 

Claims (6)

1.穿心莲提取物或穿心莲二萜内酯类化合物及其衍生物在制备防治病理性血管新生疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，穿心莲提取物为中药穿心莲的全粉混悬液，或中药穿心莲的水提取物、20％～95％乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物、汽油或石油醚提取物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是，穿心莲提取物为任何一种药学上所说的剂型。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征是，穿心莲提取物为浸膏、流浸膏、酒剂、酊剂、口服液、丸剂、散剂、滴丸、片剂或胶囊剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征是，穿心莲二萜内酯类化合物为穿心莲内酯、异穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、8-甲基穿心莲内酯苷元或新穿心莲内酯苷元。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征是，病理性血管新生疾病为糖尿病视网膜病、肿瘤、风湿性关节炎、子宫内膜异位症、糖尿病肾病或银屑病。

Images