CN109846896A - 常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类双糖链常春藤皂苷化合物在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用。这类化合物通过直接抑制炎症因子和黏附分子的吸附，调节NF‑κB信号通路等多种途径减轻内皮细胞的炎性损伤，对血管内皮细胞炎性损伤起到保护作用。该类双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用属于首次公开，而且原料来源丰富、制备方法成熟，在与血管内皮细胞损伤相关的急性肺损伤、肾损伤、脓毒症、动脉粥样硬化和糖尿病血管并发症等治疗药物开发中具有良好价值。

Description

常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一类双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用。

背景技术

血管内皮细胞(VEC)，是覆盖在血管壁和血流之间的一层有选择性渗透性屏障，能合成和分泌调节凝血-纤溶系统的物质、调节血管张力的因子以及细胞因子等，在血管形成、创伤愈合及炎症反应中起重要作用(Endemann DH,et al.Endothelial dysfunction.JAm Soc Nephrol.2004，15(8):1983–92.)，是抵御外来入侵第一层屏障的重要部分。当它感应到外来刺激时，合成和释放出多种因子，以调节和发挥如止血、细胞生长、血管收缩和舒张、炎症过程等功能。在炎症过程中，内皮细胞的表型被激活，进一步释放血管假性血友病因子、选择素、促炎细胞因子和黏附分子等，血浆蛋白的血管通透性增加，促炎细胞因子、趋化因子表达上升，调黏附分子增多，血管内皮细胞对功能调节稳态被打破。在促炎因子及其他刺激因素的长期作用下，血管内皮细胞会出现炎性损伤，表现为炎症因子包括细胞间粘附分子(ICAM-1)、血管内皮粘附分子(VCAM-1)、P-选择素(P-selectin)、E-选择素(E-selectin)、白细胞介素IL-6等的释放。血管内皮细胞损伤导致了血管内皮细胞功能障碍，多种与血管功能密切相关的代谢紊乱(JamwalS.,etal.,endothelium dysfunction:aconservative target in metabolic disorders.Inflamm.Res.2018.)均与血管内皮细胞损伤有密切关联。目前，VEC受损已被视为创伤、休克、感染、心血管疾病、肿瘤和急性肺损伤、脓毒症、全身炎症反应综合征等多种疾病和综合征发生、发展的共同病理基础。因而，保护血管内皮细胞，是预防和治疗多种与血管内皮细胞功能障碍密切相关疾病的一个重要途径。

内毒素、病毒、抗原、抗体复合物、高血糖、高血脂、补体等不同来源的各种因素，都可诱导血管内皮细胞损伤。正是基于这些血管内皮细胞损伤的诱发因素，在体外开展血管内皮细胞损伤活性筛选，然后通过进一步的动物体内实验验证对血管内皮细胞功能障碍相关的病症的治疗效果，可以建立筛选血管内皮细胞功能保护活性成分的基本方案。例如有采用内毒素LPS诱导血管内皮细胞损伤的；也有采用特异性补体激活产生补体激活产物(孙黔云等.补体旁路激活导致内皮细胞活化和损伤，中国药理学通报，2012,28(7)：925-929.)诱导微血管内皮细胞炎症相关信号通路JAK2、p38MAPK和NF-κB先后出现活化高峰，黏附分子、炎症介质、纤溶凝血相关分子的表达上调，NO下调，内皮细胞功能受到损伤(李红玲等.补体旁路激活产物刺激内皮细胞NF-κB、p38MAPK、JAK2通路活化及抑制剂的干预研究，中国细胞生物学学报，2013，35(6)：836-841.)；或是采用高血糖或高血脂条件下的氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)进行诱导激活血管内皮细胞，作为糖尿病或高血脂条件下的血管内皮细胞损伤条件等，都可作为血管内皮细胞损伤保护活性成分的体外筛选方法。而在动物模型中，多种因素诱导的炎性损伤，如补体激活诱导或LPS诱导动物产生炎性损伤，都与这些诱导因子导致的血管内皮细胞损伤直接相关，可以作为血管内皮炎性损伤保护剂的体内药理实验筛选方法。

从天然产物中寻找具有血管内皮细胞损伤有保护作用的分子，是制备用于治疗与血管内皮细胞损伤相关病症药物的重要途径。中医药通过多靶点、多途径，以抗氧化应激、调脂、抗炎等方面干预血管内皮损伤效果显著。如从中药中发现了的具有改善血管内皮细胞功能和防治糖尿病血管病变的川芎嗪(王树风等，川芎嗪对2型糖尿病患者血管内皮细胞作用的研究，临床医药实践，2009,18(5)：340-341.)、葛根素(Teng Y,etal.，Protectiveeffect of pueracin on diabetic retinophathy in rats,Mol Biol Rep,2009,36(5)：1129-1133)、人参皂苷Rg3(罗贤令等，人参皂苷Rg3对高糖下视网膜血管内皮细胞增殖和ICAM-1表达的影响，国际眼科杂志，2009,9(10)：1865-1867.)、枸杞多糖(刘萍等，枸杞多糖对糖尿病大鼠肾脏PKC-b II及IV型胶原表达的影响，中国医药药学杂志，2008,28(13)：1544-1547.)、二苯乙烯苷(李彩蓉等，二苯乙烯苷对糖尿病大鼠血脂和炎症因子的调节作用，时珍国医国药杂志，2010,21(9)：2243-2244.)、丹参酮IIA在高糖因素诱导下均表现有血管内皮的保护作用(胡海燕等.ATP敏感钾通道在丹参酮IIA对抗高糖诱导血管内皮功能损伤中的作用，中国老年学杂志，2015，35(1)：174-176.)等，对小鼠急性肾损伤有保护作用的积雪草酸(朱丽华等，积雪草酸预处理对脓毒症小鼠急性肾损伤的影响及机制，山东医药，2017,57(30)：10-13.)和对内皮细胞炎性损伤保护作用的绿原酸(孙黔云等，基于血管内皮炎性损伤的炎症性病症防治药物及其应用，CN108635345A)等。

三萜皂苷是天然产物中重要的一类成分，有五环三萜、四环三萜等不同结构骨架类型的三萜皂苷。常春藤皂苷元为齐墩果酸的衍生物，是常见的五环三萜化合物。常春藤皂苷元可以在3-羟基和28-酯基位置同时或部分糖苷化，形成双糖链或单糖链常春藤皂苷化合物，其中双糖链皂苷，由于糖基数目多，水溶性较大。双糖链常春藤皂苷，在多种植物中均有分布，并表现出不同的药理活性，如抗炎、抗肿瘤、神经保护、心肌细胞保护、抗氧化等多种活性，但尚未有其基于血管内皮细胞保护药理作用的相关研究。从川续断和山银花(黄褐毛忍冬和灰毡毛忍冬)中分离得到的主要成分Asperosaponin VI，Decaisoside E，Dipsacoside B，Fulvotomentoside B，Macranthoidin A，Macranthoidin B，其结构式为：

其中，R1和R2如下表1所示，

表1六个双糖链常春藤皂苷的化学结构式

这几个双糖链常春藤皂苷具有含量高、来源丰富等特征，它们都具有相同的皂苷元，并在3-羟基和28-酯基上均与糖链相连。这些化合物对血管内皮细胞炎性损伤的保护作用未见有报道。

发明内容

本发明基于从血管内皮细胞炎性损伤保护的角度出发，目的在于提供一类双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用，是该类化合物的新用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用。其中药物可制成胶囊剂、口服液、注射剂、片剂、颗粒剂、栓剂或滴丸剂等剂型。

前述的双糖链常春藤皂苷在制备防治肺损伤药物中的应用。

前述的双糖链常春藤皂苷在制备防治肾损伤药物中的应用。

前述的双糖链常春藤皂苷在制备防治脓毒症药物中的应用。

前述的双糖链常春藤皂苷在制备防治糖尿病血管并发症药物中的应用。

前述的双糖链常春藤皂苷在制备防治动脉粥样硬化药物中的应用。

前述的双糖链常春藤皂苷中，所述的常春藤皂苷的皂苷元为常春藤皂苷元hederagenin。

进一步的，前述的双糖链常春藤皂苷中，其中双糖链常春藤皂苷的糖基分别连接在常春藤皂苷元的3-羟基和28-酯基上。

进一步的，前述的双糖链常春藤皂苷中，所述双糖链常春藤皂苷元的3-羟基上连接的糖基为α-L-Arabinopyranosyl、α-L-Rhamnopyranosyl(1→2)-L-Arabino-pyranosyl、β-D-Xylopyranosyl(1→3)-α-L-Rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-Arabinopyranosyl、β-D-Glucopyranosyl(1→3)-α-L-Rhamnopyranosyl(1→2)-L-Arabinopyranosyl或β-D-Glucopyranosyl(1→4)-β-D-Glucopyranosyl(1→3)-a-L-Rha(1→2)-L-Arabinopyranosyl，所述常春藤皂苷元的28-酯基上连接的糖基为β-D-Glucopyranosyl(1→6)-β-D-Glucopyranosyl或β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-Glucopyraosyl。

进一步的，前述的双糖链常春藤皂苷中，所述双糖链常春藤皂苷为AsperosaponinVI，Decaisoside E，Dipsacoside B，Fulvotomentoside B，Macranthoidin A或Macranthoidin B中的一种或几种。

进一步的，前述的双糖链常春藤皂苷中，所述常春藤皂苷为Asperosaponin VI，Decaisoside E，Dipsacoside B，Fulvotomentoside B，Macranthoidin A或MacranthoidinB中的任意几种，以任意比例混合使用。

前述的双糖链常春藤皂苷的制备方法，是以川续断科植物川续断(Dipsacusasper)、忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides)或黄褐毛忍冬(Lonicerafulvotomentosa)中的一种或几种为原料采用现有技术提取得到的。

为验证本发明的效果，发明人进行了如下实验：

1、双糖链常春藤皂苷的溶血及细胞毒实验

1.1溶血实验：

取健康兔子血液20ml于20ml阿氏液中，缓慢晃动去纤维蛋白原(锥形瓶和玻璃珠提前已灭菌)。临用时，4℃，3000r，8min离心去掉阿氏液，加入0.9％NaCl溶液，轻轻混匀，同样条件下离心，重复2-3次，至血液上清透亮后，按红细胞比例加入0.9％NaCl溶液制成2％混悬液，皂苷样品用DMSO溶解，制成母液后再按需要梯度稀释样品至所需浓度。以0.9％NaCl作为阴性对照组，纯化水作为阳性对照组，依次加入红细胞悬液后混匀，立即至37℃水浴箱中孵育，3h后观察溶血反应，之后离心，取100μl上清液于96孔板中，412nm下检测，测定溶血率，结果如表2。

表2双糖链常春藤皂苷的溶血实验结果

结果显示，在300μg/mL的浓度范围内，六个皂苷都基本不表现出溶血性，当浓度增加到500μg/mL后，开始有一定的溶血作用。实验结果说明，这些双糖链常春藤皂苷可以在一定的浓度范围内用于制备注射剂型药物形式。

1.2细胞毒实验：

将人微血管内皮细胞(HMEC)以1x10⁴个/孔，接种于96孔板中，每孔100μl，分为正常生长组、不同浓度样品组，培养24h后换无血清培养基，加入不同浓度的皂苷样品：终浓度为500、300、100、50、10、1μg/ml，正常组加入上理盐水，终体积是100μl，继续培养24h后，MTT法检测其细胞活力。

结果如图1所示，500μg/mL浓度以内，六个皂苷对HMEC几乎不表现出细胞毒性。

2.双糖链常春藤皂苷的抗眼镜蛇毒因子(CVF)诱导血管内皮细胞损伤药理实验

2.1双糖链常春藤皂苷化合物对CAC刺激HMEC后细胞活力的影响：

参照文献[李朝胜,孙黔云，三种化学小分子对补体旁路激活致内皮细胞黏附分子表达的干预及机制研究.中国药理学通报，2015,31(10)：1421-6.]方法，先将正常人血清(NHS)和CVF按照一定的比例混合后，放入37℃水浴30min，制备成NHS的CVF激活产物(CAC)，然后将人微血管内皮细胞(HMEC)以1×10⁵cells·well^-1接种于96孔细胞培养板，培养24h后弃上清，给药组分别加入20μL含不同浓度样品，正常对照组和模型组加入20μL生理盐水，培养2h后，模型组和给药组加入60μLCAC，各孔培养体系总体积为200μL，继续培养24h后，采用MTT法检测每组细胞存活率。

图2结果显示，6个皂苷化合物对由于CAC刺激HMEC导致细胞损伤有保护作用，可以显著地提高细胞活力。其中Asperosaponin VI，Decaisoside E，Macranthoidin A等提高细胞活力的程度最为显著，且表现出明显的量效关系。

2.2双糖链常春藤皂苷化合物对CAC刺激HMEC后细胞内黏附因子和炎症因子的影响：

按2.1中细胞活力影响实验中相同的方法分组后，培养24h后，取上清液，离心，样品分装后，放入-80℃冻存备用。按照试剂盒说明测定ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-1和TNF-α。

如图3显示，CAC刺激HMEC后，细胞内黏附因子ICAM-1、VCAM-1，选择素E-selectin和炎症因子IL-6、IL-1、TNF-α都显著上调，给予双糖链常春藤皂苷后，可以显著下调这些炎症因子水平，说明可以降低血管内皮细胞内的炎性反应，从而到达细胞保护作用。

2.3双糖链常春藤皂苷化合物对CAC刺激HMEC后细胞内表达NF-κB的影响：

取1μL重组质粒(1ng)加入到100μL感受态DH5α悬液中，混匀，冰水浴30min后，42℃水浴90s，取出，再冰水浴3min，然后加入900μLLB培养基，置于37℃振荡培养45min，取菌液100μL均匀涂布于筛选平板上，置37℃培养过夜，挑用白色菌落进行扩增，按说明书抽提质粒。HMEC细胞以1×10⁵cells·well-1接种于96孔板，培养24h后弃上清，用无血清1640培养基洗2次，然后加入90μL含血清1640培养基，按Lipofecter脂质体转染试剂说明书进行转染。具体如下：将一定量NF-κB表达质粒和内参质粒以及脂质体试剂与无血清RPMI 1640培养基混匀，(20-25)℃孵育20min。然后每孔加入该转染混合液10μL，转染20h后去除上清，药物组分别加入样品，正常对照组和模型组加入生理盐水，37℃，5％CO₂培养箱中孵育2h后弃30μL上清，加入30μLCAC，使各孔培养体系总体积为100μL，同时设置CVF与INHS的孵育物作对照，继续培养4h按双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测萤光强度，通过计算得到各组的相对核转录活性。

如图4结果说明，CAC刺激HMEC后，细胞内NF-κB的相对核转录水平提高，显示其炎症反应出现，加入皂苷分子后，化合物1～6都能够对内皮细胞因补体旁路激活产物引起的NF-κBp65磷酸化都表现出一定的抑制作用(P<0.05)NF-κB相对核转录水平降低，说明可以通过NF-κB途径抑制炎性反应程度。

以上实验结果显示，6个双糖链常春藤皂苷都能改善CVF诱导损伤的血管内皮细胞活力，并对炎症介质因子具有显著的抑制作用，降低黏附因子水平，说明这些化合物可以保护血管内皮细胞炎性损伤，同时提示可能与NF-κB通路调节有关。

3.双糖链常春藤皂苷的抗LPS诱导血管内皮细胞损伤药理实验

将HMEC按1×10⁵个细胞·mL^-1的密度接种于96孔板上，置37℃、5％CO₂培养箱中孵育，培养24h后，换无血清RPMI-1640培养液继续孵育24h，将细胞分为正常对照组和LPS损伤组。正常对照组：加入无血清1640培养基；LPS损伤组：加入含LPS终浓度为300mg·L^-1的无血清1640培养基，每一浓度设5个平行孔，作用时间为12，24，48h，实验重复4次。MTT法检测细胞存活率。HMEC融合生长成单层后，0.1mol·L^-1的PBS漂洗2次，用0.25％胰蛋白酶消化分离，以1×10⁵个细胞·mL^-1接种于96孔板，随机分为空白对照组、模型组(LPS)、药物组，每个浓度均设5个复孔，实验重复4次。在含10％胎牛血清的1640完全培养基中培养24h，然后用含无血清的RPMI 1640继续培养24h。预先加入上述终浓度的药品培养细胞24h后，将LPS加入模型组和药物各组，LPS刺激细胞48h，MTT测定细胞活力。

如图5结果显示，与模型组对比，双糖链常春藤皂苷分子对LPS诱导HMEC细胞的损伤具有显著的保护作用。

4.双糖链常春藤皂苷的抗Ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤药理实验

Ox-LDL的制备：将提前准备的LDL放入透析袋内，加入浓度为10μmol/L的CuSO₄，放置在4℃环境24h以进行透析并氧化为Ox-LDL。放置24h后，加入100μmol/L的EDTA以终止反应，并经超滤除菌后，置于4℃环境下保存备用。本实验中共分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组5组。对照组的培养基为常规DMEM液+5％血清，其他组的培养基为常规DMEM液+5％血清+100mg/L Qx-LDL并在随机化条件下进行，将分组后的培养细胞接种于24孔板，在细胞生长至90％融合后进行实验干预处理。以上五组均进行24h的培养，MTT法检测细胞活力。

如图6结果显示，经Ox-LDL处理后，模型组血管内皮细胞生存活性明显低于空白对照组，皂苷低、中、高剂量组血管内皮细胞生存活性均高于模型组，且血管内皮细胞生存活性随皂苷浓度升高而升高。

5.双糖链常春藤皂苷和双糖链常春藤皂苷混合物(黄褐毛忍冬总皂苷，TSF)的抗急性肺损伤药理实验

采用尾静脉注射35μg/kg的CVF特异性激活补体替代途径，诱导小鼠急性肺损伤(孙黔云等，基于血管内皮炎性损伤的炎症性病症防治药物及其应用，CN108635345A)。设立空白对照组(0.2％CMCNa对照)、模型组、阳性药物对照组(吡咯烷二硫基甲酸盐，PDTC组)、高剂量组(300mg/kg)、低剂量组(100mg/kg)，共5组，每组12只，灌胃给药。各组小鼠预防给药7天，于第7天给药1h后，再给予CVF诱导急性炎症。1h后摘眼球取血离心制备血清，分装于-80℃冻存；取血后脱颈处死小鼠进行支气管肺泡灌洗得支气管肺泡灌洗液(BALF)，BALF取上清液分装，-80℃冻存备用。取右肺称重后，将右肺上叶置于-80℃冻存，用于MPO测定，具体方法按照试剂盒说明书进行。右肺中叶称湿重，然后以70℃烘烤48h至恒重，根据公式：(湿重-干重)/湿重100％，计算肺含水量。右肺下叶置于10％甲醛溶液中固定，行病理切片检查。取-80℃冻存的小鼠血清、BALF上清液测定指标ICAM-1，P-selectin，TNF-α，IL-6等。

本实验中，CVF作为特定的激活补体旁路途径的工具药，通过特异性地激活小鼠补体旁路途径，导致急性肺损伤。ALI小鼠肺组织相关指标与正常组对比，BALF细胞数目及MPO含量显著升高。与模型组对比，阳性对照组和给药组治疗后，均可以显著减少BALF细胞数目、降低MPO含量。给药后各小组肺含水量无明显变化，如表3所示。

表3双糖链皂苷及其混合物对急性肺损伤模型小鼠肺组织相关指标的影响(n＝8,M±SD)

#：与正常组对比，P＜0.01，*：与模型组对比，P＜0.01。

而炎症指标检测结果如图7和图8显示，双糖链常春藤皂苷化合物Asperosaponin、Decaisoside E及含Decaisoside E、Dipsacoside B和Fulvotomentoside B三种双糖链常春藤皂苷混合物的黄褐毛忍冬总皂苷提取物，对替代途径特异性激活剂的小鼠急性肺损伤表现出的炎症指标具有显著的改善作用，特别是显著改善与血管内皮细胞功能密切相关的ICAM-1，VCAM-1，P-selectin等指标说明能这些双糖链常春藤皂苷在体内改善血管内皮细胞的损伤。同时，病理切片结果显示，正常组织结构正常，少见炎性细胞浸润；模型组可见肺间质增宽，肺泡轻度扩张，普遍可见炎性细胞浸润，而双糖链常春藤皂苷及其化合物TSF给药组及阳性药物PDTC组的炎性细胞浸润明显减轻，如附图9所示。

已知在急性肺损伤、脓毒症、缺血再灌注损伤、烧(创)伤、全身炎症反应综合征、糖尿病等疾病中，补体旁路激活导致内皮细胞发生炎症反应和损伤是上述诸多相关病征发病中的重要共性机制。基于其它病征与急性肺损伤在上述方面的共性病理基础，双糖链常春藤皂苷同样可以应用于这些相关病征的防治。

6.双糖链常春藤皂苷抗LPS诱导肾损伤药理实验

将体重为18～22g的BALB/C小鼠随机分为7组，每组10只，分别为空白对照组、模型组(LPS10mg·Kg^-1)、阳性对照组(地塞米松5mg·Kg^-1)、给药组(200mg·Kg^-1)。在LPS造模前3小时给与药品治疗，造模后3小时、6小时再给与阳性对照药和药品进行治疗，治疗3小时后眼球取血。将取出的小鼠全血室温静置2小时后，3500rpm离心15min，取上清液200μL利用血生化分析仪检测与肾损伤相关的血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平。

急性肾小球肾炎、肾盂肾炎、肾衰竭等肾脏疾病中，肾功能受损导致血清中尿素均升高。实验结果如图10显示，与空白组对比，模型组小鼠血清中，血清尿素氮和肌酐水平显著升高，双糖链皂苷及皂苷混合物给药后，给药组都在不同程度上降低了血清中尿素氮和肌酐水平，说明皂苷分子对LPS诱导的急性肾损伤有治疗效果。

本发明提供了双糖链常春藤皂苷化合物在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用。这类化合物可能通过调节NF-κB信号通路等多种途径，减轻血管内皮细胞的炎性反应，对血管内皮细胞炎性损伤起到保护作用。本发明的双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用属于首次公开，而且原料来源丰富、制备方法成熟，在与血管内皮细胞损伤相关的急性肺损伤、肾损伤、动脉粥样硬化和糖尿病血管并发症等防治药物开发中具有良好的价值。

附图说明

图1为双糖链常春藤皂苷细胞毒实验结果；

图2为双糖链常春藤皂苷对CVF诱导损伤的血管内皮细胞活力的影响；

图3为双糖链常春藤皂苷对CVF诱导损伤的血管内皮细胞炎症因子的影响(A，黏附因子ICAM-1；B，黏附因子VCAM-1；C，E选择素；D，TNF-α；E，炎症介质IL-6)；

图4为双糖链常春藤皂苷对CVF诱导损伤的血管内皮细胞中NF-κBp65磷酸化作用的影响；

图5为双糖链常春藤皂苷对LPS诱导损伤的血管内皮细胞活力的影响；

图6为双糖链常春藤皂苷对Ox-LDL诱导损伤的血管内皮细胞活力的影响；

图7为双糖链常春藤皂苷和双糖链常春藤皂苷混合物对急性肺损伤小鼠血清中ICAM-1，P-selectin，TNF-α，IL-6等参数的影响；

图8为双糖链常春藤皂苷和双糖链常春藤皂苷混合物对急性肺损伤小鼠BALF上清液中ICAM-1，P-selectin，TNF-α，IL-6等参数的影响；

图9为双糖链常春藤皂苷和双糖链常春藤皂苷混合物对急性肺损伤小鼠给药前后肺组织病理切片的影响：正常组(A)、模型组(B)、阳性对照PDTC组(C)、TSF(D)，Asperosaponin VI组(E)和Decaisoside E(F)；

图10为双糖链常春藤皂苷和双糖链常春藤皂苷混合物对LPS诱导急性肾损伤小鼠血清中BUN、Cr水平的影响。

具体实施方式

实施例1

双糖链常春藤皂苷的制备

川续断干燥根10kg，粉碎后，用95％乙醇提取(25L×2)，合并两次提取液，减压浓缩，得浸膏。浸膏分散于5L水中，过滤，滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色较浅为止，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到川续断总皂苷。取川续断总皂苷上正相硅胶色谱柱，氯仿-甲醇-水体系梯度洗脱，得到纯化合物1。经ESI-MS和¹³C-NMR数据与文献数据对比，鉴定为川续断皂苷VI(Asperosaponin VI)。

Asperosaponin VI：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z927.3([M-H]^-)；¹³C-NMR(d₅-pyridine)：δ_C13.5，16.1，17.6，18.2，23.3，23.5，23.6，26.1，26.1，28.1，30.7，32.5，32.5，33.1，33.7，36.5，38.8，39.8，41.5，42.2，43.5，46.2，46.9，47.8，48.2，62.4，64.6，67.1，69.5，69.6，70.6，71.5，73.1，73.8，74.8，75.2，77.9，78.1，78.4，78.5，81.5，95.8，105.2，106.8，122.9，144.2，176.5。

实施例2

双糖链常春藤皂苷的制备

灰毡毛忍冬干燥花蕾5kg，粉碎后，用95％乙醇提取(25L×2)，合并两次提取液，减压浓缩，得浸膏。浸膏分散于5L水中，过滤，滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色较浅为止，然后用50％甲醇洗脱2个柱体积后，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到灰毡毛总皂苷。取灰毡毛忍冬总皂苷100g，上正相硅胶色谱柱，氯仿-甲醇-水体系梯度洗脱，得到纯化合物1和2，经ESI-MS和¹³C-NMR数据与文献数据对比，分别鉴定为灰毡毛忍冬皂苷A和灰毡毛忍冬皂苷B。

macranthoidin A(1)：白色无定形粉末，ESI-MS:m/z1235.6([M-H]^-)，¹³C-NMR(d₅-pyridine)：δ_C14.5，16.4，17.8，18.5，18.6，23.5，23.5，23.8，26.3，26.4，28.2，30.8，32.2，33.1，33.3，34.5，37.1，39.1，39.5，41.3，42.1，44.1，46.4，47.3，47.6，48.3，62.4，62.5，64.1，66.5，69.2，69.8，70.0，71.1，71.2，71.6，71.8，73.1，75.1，75.2，75.3，75.4，75.8，78.0，78.2，78.4，78.4，78.6，78.8，81.3，83.1，95.7，101.5，104.9，105.5，106.5，123.2，144.2，176.5。

macranthoidin B(2)：白色无定形粉末，ESI-MS:m/z1397.5([M-H]^-)，¹³C-NMR:δ_C15.1，17.9，19.1，19.1，19.1，24.8，25.1，25.5，27.2，27.9，29.4，32.3，33.8，34.1，34.5，35.5，38.3，40.8，41.4，42.9，43.2，45.1，47，47.8，49.2，49.7，63.2，63.9，64.1，65.8，66.5，70.5，70.8，70.9，71.1，72.6，73.2，73.2，74.2，75.1，76.1，76.1，76.2，76.3，76.9，78.1，78.2，79.7，79.7，79.8，79.8，80.1，80.2，82.1，82.5，84.5，97.2，102.6，106.2，106.3，106.5，107.8，124.2，145.9，177.9.

实施例3

双糖链常春藤皂苷的制备

黄褐毛忍冬干燥花蕾5kg，粉碎后，用95％乙醇提取(25L×2)，合并两次提取液，减压浓缩，得浸膏。浸膏分散于5L水中，过滤，滤液上预处理过的AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色较浅为止，然后用40％甲醇洗脱2个柱体积后，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到黄褐毛总皂苷(TSF)。取黄褐毛忍冬总皂苷100g，上正相硅胶色谱柱，氯仿-甲醇-水体系梯度洗脱，得到纯化合物1-3，经ESI-MS和¹³C-NMR数据与文献数据对比，分别鉴定为川续断皂苷乙(Dipsacoside B)，Decaisoside E和黄褐毛忍冬皂苷乙(Fulvotomentoside B)。

Dipsacoside B(1)：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z1073.4([M-H]^-),¹³C-NMR(d₅-pyridine):δ_C14.2，16.3，17.5，18.2，18.3，23.5，23.7，23.8，26.2，26.3，28.3，30.8，32.8，33.1，33.2，34.1，36.9，39.2，40，41.6，42.2，44.3，46.4，47.1，47.8，48.4，62.7，64.1，66.1，69.2，69.7，69.7，71.1，71.6，72.1，72.7，74，74，74.5，75.2，75.7，78.1，78.4，78.5，78.8，81.3，95.2，101.5，104.6，105.3，123.4，144.2，176.6。

Decaisoside E(2)：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z1205.3([M-H]^-),¹³C-NMR(d₅-pyridine)：δ_C14.2，16.3，17.5，18.2，18.3，23.5，23.7，23.8，26.2，26.3，28.3，30.8，32.5，32.8，33.1，34.1，36.9，39.2，40，41.6，42.2，43.5，46.4，47.1，47.8，48.4，62.7，64.1，66.4，66.9，67.5，69.2，69.7，69.7，71.2，71.2，71.6，72.1，73.0，74.0，74.7，75.0，75.2，75.7，77.9，78.0，78.3，78.4，78.9，81.3，83，95.2，101.4，104.6，105.3，107.6，123.4，144.2，176.6。

Fulvotomentoside B(3)：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z1175.4([M-H]^-),¹³C-NMR(d₅-pyridine):δ_C14.2，16.2，17.5，18.1，18.3，23.5，23.6，23.8，26.3，26.3，28.3，30.8，32.5，32.8，33.1，34.1，36.9，39.1，39.9，41.6，42.2，43.5，46.4，47.2，47.7，48.5，64.1，66.4，67.0，67.4，69.2，69.6，69.7，71.0，71.1，71.2，72.1，73.1，73.9，74.7，75.0，75.1，75.6，77.8，78.0，78.3，78.8，81.2，83.0，95.2，101.4，104.6，105.6，107.6，123.4，144.2，176.7。

以分离到的化合物为标准品，HPLC方法测定黄褐毛忍冬总皂苷(TSF)中的Dipsacoside B，Decaisoside E和Fulvotomentoside B含量，分别为：12.6％，58.5％，8.5％。

使用时，可将实施例1～3所得产品单独使用或按照任意配比混合使用，制成胶囊剂、口服液、注射剂、片剂、颗粒剂、栓剂或滴丸剂等剂型。

Claims (9)

1.双糖链常春藤皂苷在制备抗血管内皮细胞炎性损伤药物中的应用。

2.双糖链常春藤皂苷在制备防治急性肺损伤药物中的应用。

3.双糖链常春藤皂苷在制备防治肾损伤药物中的应用。

4.双糖链常春藤皂苷在制备防治脓毒症药物中的应用。

5.双糖链常春藤皂苷在制备防治糖尿病血管并发症药物中的应用。

6.双糖链常春藤皂苷在制备防治动脉粥样硬化药物中的应用。

7.权利要求1～6任一所述的双糖链常春藤皂苷，其特征在于，所述的双糖链常春藤皂苷的皂苷元为常春藤皂苷元hederagenin，常春藤皂苷元的3-羟基和28-酯基上同时连接有糖链。

8.根据权利要求7所述的常春藤皂苷，其特征在于，所述常春藤皂苷为AsperosaponinVI，Decaisoside E，Dipsacoside B，Fulvotomentoside B，Macranthoidin A或Macranthoidin B中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的常春藤皂苷，其特征在于，所述常春藤皂苷为AsperosaponinVI，Decaisoside E，Dipsacoside B，Fulvotomentoside B，Macranthoidin A或Macranthoidin B中的任意几种，以任意比例混合使用。