CN102755343A - 胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胡萝卜苷在制药及保健品中的新用途，具体地说是胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物及保健品中的应用。胡萝卜苷是植物甾醇衍生物，为谷甾醇-3-O-葡萄糖苷，广泛存在于植物中，其提取、分离和含量检测过程都很简便。有研究称本品可促进成骨样细胞增殖，保护人微血管内皮细胞，还具降糖活性。本发明以原代培养的神经干细胞和老年小鼠为材料，观察胡萝卜苷对神经干细胞的作用。通过离体和整体实验，证实胡萝卜苷具有促进神经干细胞增殖的作用：离体实验中，胡萝卜苷剂量10μmol/L~100μmol/L均能促进神经干细胞增殖；整体实验中，10mg/kg的剂量能促进老年小鼠神经干细胞的增殖。

Description

胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用

技术领域    

本发明涉及医药领域的药物/保健品的应用，具体地说是涉及胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物/保健品中的应用。

背景技术    

1. 胡萝卜苷的来源及理化性质    胡萝卜苷别名：西托糖苷、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷；英文名称： Daucosterol。分子量： 576.85。

胡萝卜苷是重要的植物甾醇衍生物，广泛分布于自然界, 存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中。可用乙醇加热回流提取，经硅胶柱层析或大孔树脂柱层析分离获得。本品为白色粉末，在避光干燥低温处保存，可溶于吡啶、DMSO、热的甲醇、乙醇等，不溶于石油醚、氯仿、水等溶剂，可用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定含量^[1]（[1]闫雪生，徐新刚，黄敏。HPLC-ELSD 测定柏子仁箱中的胡萝卜苷. 全国中药创新与研究论坛· 论文集）。

胡萝卜苷的药理学研究进展

关于胡萝卜苷药理学研究的报道并不多，其在生物、医学方面的价值有待进一步挖掘。有文献报道胡萝卜苷对成骨样细胞的增殖具有显著的促进作用^[2]（[2]孟彦彬1, 孙 盛2, 高 巍。牛膝中对成骨样细胞UMR106有促进增殖作用的活性成分研究。时珍国医国药，2007，18（12）：2947-2948。）：浓度为1. 2 × 10^- 6 mg /m l时, 其促进成骨样细胞增殖的作用最强, 3次实验的最高增殖率平均为45%。另有研究表明胡萝卜苷可预防和治疗氧化低密度脂蛋白对人微血管内皮细胞造成的损伤：胡萝卜苷剂量0. 39~ 12. 5μg/mL时，有保护作用；剂量6. 25~ 12. 5μg/mL时时，具有很强的修复作用^[3]（[3]何秋艳，翁新楚。山楂活性成分对氧化低密度脂蛋白损伤人微血管内皮细胞的防治作用。上海大学学报( 自然科学版)，2007， 13（6）：751-756。）。此外，胡萝卜苷亦是食用仙人掌中降糖活性的成分之一^[4]（[4]谷江霞, 窦德强。食用仙人掌降糖活性成分研究。中国现代中药，2007，19（111）：15-16）。

．与胡萝卜苷相关的发明专利

3.1   一种胡萝卜苷植物杀螨剂及其用途（申请(专利)号: CN201110140348.7）：发明提供了一种以胡萝卜苷为主要原料，再加入溶剂、增溶剂和乳化剂等辅料制成的杀螨水乳剂，是一种对人畜安全、环境友好型的和谐农药，对生态环境长远发展、人类的健康和病害的综合治理都具有深远的意义。

3.2    一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法（申请(专利)号: CN201010004245.3）：发明涉及一种从柏子仁中提取柏子仁油及胡萝卜苷的方法，采用以下步骤：取柏子仁，粉碎，用石油醚提取2次，得柏子仁油；提取柏子油后的柏子仁，挥尽石油醚，用乙醇提取2次，合并滤液；合并后的滤液回收乙醇至

浸膏状，加入占浸膏1-4重量倍的柱层析硅胶，搅拌均匀，置干燥箱中，干燥，放冷，得柱层硅胶拌和物；                                                

取占浸膏4-8重量倍的柱层析硅胶，用石油醚湿法装柱，将柱层硅胶拌和物加入层析柱中，用体积比为1∶1的石油醚-醋酸乙酯洗脱，洗脱至流出液近无色，改用醋酸乙酯洗脱，合并醋酸乙酯洗脱液，回收醋酸乙酯，得胡萝卜苷粗分离物。该发明胡萝卜苷制备工艺方法简便，所用提取、洗脱溶剂毒性低，得到的胡萝卜苷纯度高，杂质少，易于精制，适于规模化制备或生产。

3.3   蒲葵的抗肿瘤提取物及其制备方法及应用（申请(专利)号: CN200510036625.4）：发明涉及一种蒲葵的体外抗肿瘤提取物，其化学成分为薯蓣皂苷元；β－谷甾醇；豆甾酮；β－胡萝卜苷；正二十六醇等，其提取方法是将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎，用乙醇浸提过滤分离出固相和液相，液相蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A，过滤分离出的固相，水提，浓缩，合并醇提浸提膏和水提浓缩液，分别用乙酸乙酯和石油醚提取再用硅胶柱重结晶得出单体化合物，经药理学验证，蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株的生长有抑制作用。

3.4   棉叶蓼乙醇提取物及其制备方法和用途（申请(专利)号: CN200610011169.2）：发明公开了一种蓼科植物棉毛酸膜叶蓼(棉叶蓼)的乙醇提取物及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：取棉叶蓼2.5－5.0kg，粉碎后用60－80％乙醇回流提取2－3次，合并滤液，减压浓缩得2200－4400ml滤液，离心，上清液用乙酸乙酯萃取2－3次，合并萃取液，减压浓缩成干粉，行硅胶柱层析，用TLC展开剂洗脱制得粗品棉叶蓼乙醇提取物。本发明棉叶蓼乙醇提取物含有：黄酮类成分：包括槲皮素、金丝桃苷、棉叶蓼黄酮A；酚酸类成分：包括香豆酸、没食子酸、原儿茶酸；甾醇类成分：包括β－谷甾醇、胡萝卜苷。本发明的棉叶蓼乙醇提取物在抗癌、治疗菌痢、肠炎、治疗湿疹、治疗蛇咬伤等疾病时疗效显著。

3.5  烟株根际碱性土壤有机调节剂（申请(专利)号: CN200710180577.5）：一种烟株根际碱性土壤有机调节剂，其特征是由紫叶酢浆草、优质腐熟芝麻饼、草炭等多种有机成分组成，成分配比为：低温烘干的紫叶酢浆草10％～55％，优质腐熟芝麻饼20％～55％，草炭10％～40％。粉碎后充分混匀混合制成。本发明的优点在于：通过调节烟株根际碱性土壤质量，达到降低碱性植烟土壤pH值的作用，在一定程度上较易实现；该产品安全、生态；其中酢浆草显示较强酸性，能有效降低碱性植烟土壤的pH值，其化学成分含β－谷淄醇、胡萝卜苷、草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸等，许多小分子有机酸对于改善植烟土壤的有效钾及烟叶香气，对烟叶品质的提升较为有利；腐熟芝麻饼对增加烟叶香气较为有利；草炭对改善土壤有机质及土壤物理性状有明显作用。

3.6  一种分离芫花条化学成分的方法（申请(专利)号: CN200910015861.6）：发明提供一种分离芫花条化学成分的方法，其用硅胶柱色谱法对瑞香科植物芫花枝条的乙醇提取物经石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇深度萃取，进行化学成分的分离。室温萃取，节约能源并可避免萃取过程中有效成分的破坏；分离得比较彻底，共获得15种化合物；采用理化及波谱分析方法，分别鉴定为：(1)十八碳酸单甘油酯、(2)邻苯二甲酸二丁酯、 (3)棕榈酸、(4)β-谷甾醇、(5)咖啡酸十八烷酯、(6)咖啡酸正二十烷酯、(7)山奈酚、 (8)西瑞香素、(9)芹菜素、(10)紫丁香树脂醇、(11)木犀草素、(12)β-胡萝卜苷、(13) 刺五加苷B、(14)松脂醇二葡萄糖苷、(15)二氢刺五加苷B。其中，化合物(1)、(2)、(3)、 (6)、(10)、(13)、(14)和(15)为首次分离得到。3.7  预防或治疗帕金森病的药物组合物及其制备方法（申请(专利)号: CN200910135572.X）：发明公开了一种预防或治疗帕金森病的药物组合物及其制备方法。该药物组合物由刺五加苷B，刺五加苷D，丁香树脂酚双葡萄糖苷和胡萝卜苷组成。本发明确定了上述4种组分的最佳剂量水平范围，在此基础上采用了正交

试验筛选出了上述4种活性成分之间的最佳配伍比例。实验结果表明，将刺五加苷B，刺五加苷D，丁香树脂酚双葡萄糖苷和胡萝卜苷按照1∶2∶8∶8的重量配伍而成的药物组合物能显著提高PC12细胞存活率，对多巴胺能神经细胞损伤具有显著的保护作用。本发明所提供的刺五加有效成分化学成分简单明确，在生产中易进行于质量控制。本发明药物组合物可以用来制备疗效好，安全可靠的预防和治疗帕金森病的药物。

3.8  从亚麻根中制备脑苷脂类化合物的方法（申请(专利)号: CN200510068282.X）：发明公开了一种新的制备脑苷脂类化合物的方法，具体说，即从亚麻通过提取、分离和重结晶，制备脑苷脂类化合物β－胡萝卜苷、化合物1和化合物2。

神经干细胞的研究概况

神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。Mckay于1997年在《Science》杂志上将神经干细胞的概念总结为：具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。各种成年哺乳动物脑内都存有神经干细胞，其具有长期自我更新能力。包括人类在内的各种成年哺乳动物脑组织终生都有新神经元生成，新神经元主要诞生于海马齿状回和室管膜下区，然后迁移至目的。这些新生神经元在迁移过程中逐渐成熟，行使生理功能。

神经干细胞具有以下特点：①自我更新：具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式，从而保持干细胞库稳定。②多向分化潜能：可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。③低免疫源性：是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别。④组织融合性好：可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活。⑤分裂的慢周期性：绝大多数干细胞处于G0期，细胞增殖缓慢。 

神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用，是修复和代替受损脑组织的有效方法，能重建部分环路和功能。另一方面，随着机体衰老，神经干细胞的数量和质量都呈下降趋势，其增殖能力和活性随着年龄的增长而降低，大脑细胞的稳态更新受到破坏，新生的细胞无法及时替代衰老的细胞，神经功能下降而步向衰老。神经干细胞的活性和增殖能力与神经再生的需求两者之间的矛盾决定了大脑的衰老进程。

由于绝大多数神经干细胞处于G0期，细胞增殖缓慢，从而限制其修复功能的发挥。如果药物分子能促进神经干细胞增殖，则能增强其修复功能，乃至延缓大脑衰老。能促进神经干细胞增殖的物质有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子(EGF)等细胞因子；有睾酮、脱氢表雄酮、胰岛素样生长因子、红细胞生成素、甲状腺激素等激素类物质；亦有人参皂苷Rg1、黄芪甲苷、淫羊藿苷、知母皂苷等小分子药物。上述能促进神经干细胞增殖的物质，其应用具有局限性：大分子物质难以透过血脑屏障，摄入过多外源性激素易导致内源性激素释放紊乱，而小分子药物来源有限，价格昂贵，长期服用可能有一定的不良反应。因而，价廉易得、低毒高效的“神经干细胞促生长剂”蕴藏着巨大的医疗和保健价值。

本发明人发现胡萝卜苷能促进神经干细胞增殖，作用显著，安全性好。鉴于胡萝卜苷来源广泛、提取方便，价廉易得的特点，使其开发成为“神经干细胞促生长剂” 将带来显著的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供胡萝卜苷在医疗和保健品中的新用途，即胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用，及其在制备促进神经干细胞增殖保健品中的应用。

本发明通过离体和整体实验，证实胡萝卜苷具有促进神经干细胞增殖的作用。具体实验如下：

1.    离体实验

1.1 实验动物

怀孕14-16天的SD孕大鼠10只，由浙江省实验动物中心提供,合格证号：SCXK（浙）2008-0033. 

1. 2 主要试剂及试剂配制：

Neuralbasal培养基（GIBCO公司产品,Lot 1094141）、Ｂ27培养基添加剂(GIBCO公司产品,Lot 1159693)；大鼠b-FGF及EGF（Pepro TECH公司产品, EGF：Lot 0906390-1 H2911；b-FGF： Lot 1305CY12）小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体、TRITC（罗丹明）标记的羊抗小鼠IgG抗体、Brdu及其抗体 (武汉博士德生物技术有限公司产品)；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；胡萝卜苷，由南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室提供，纯度≥98%；

解剖液:D-hank^,s,(pH7.2-7.4)：NaCl8.0g，Na₂HP0₄·12H₂O0.132g，KH₂P O ₄0.06g，KCl0.4g， NaHCO ₃0.35g, 用去离子水配成1000ml溶液；

0.125%胰酶：0.125g胰酶溶解于100ml D-hank^,s中；

种植培养基:由90%DMEM培养基和10%胎牛血清(杭州四季青生物工程公司产品)配制；

无血清培养基:由97%neuralbasal培养基、2%Ｂ27培养基添加剂以及终浓度为20μg/L的b-FGF和EGF配制而成解剖液、胰酶、培养液皆过滤除菌，4⁰C保存备用。

主要仪器及器材

SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司):CO₂细胞培养箱(SANYO,日本);荧光倒置显微镜(OLYMPUS,日本)；低速自动平衡离心机(LDZ5-2型,北京医用离心机厂)；酶标仪（BIO-RAD,USA）6孔和96孔细胞培养板(Corning,USA)； 200目尼龙筛网（罩在100ml的小烧杯上，用胶布粘牢），弯头无齿镊，直径为12mm的弯头滴管；50ml盐水瓶；直径为10cm的表面皿 ，皆经15磅30min高温高压灭菌。

实验方法

1.4.1 神经干细胞的分散、种植和培养

具体操作过程如下:1.孕鼠用10%水合氯醛麻醉，全身用碘伏消毒，无菌条件下剖腹，取出胎鼠；2.用弯头镊撕开胎鼠头皮和颅骨,暴露两侧大脑半球,用弯头无齿镊小心分开颞叶皮层,暴露并取出海马回,置解剖液中；3.将海马组织块用解剖液清洗,转入装有约海马组织体重20倍体积的胰酶的盐水瓶中，用光滑的弯头滴管反复吹打至组织块完全消失，液体呈浑浊状；4.将液体用等体积的种植培养基终止消化，过200目尼龙筛网；5.1500ｇ/r离心12min，倾去上清液，用种植培养基使细胞重悬，以1×10⁶个/ ml的密度将细胞种植在6孔培养板中，每孔加2mL；7.置37℃,5%饱和湿度CO₂培养箱内培养。第2天将培养液全部换成无血清培养液，以后用无血清培养液每隔2ｄ换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待出现肉眼可见的大量成簇生长的细胞球时，用1mL枪头吸取细胞球，移至新的6孔培养板中培养，如此过程重复三遍，以纯化神经干细胞，此时可传代。用3~5代的细胞进行实验。

神经干细胞的鉴定 (阳性细胞标记物为nestin)

方法和步骤依次为：①用于鉴定的神经干细胞用PBS轻洗2次，继而滴加4%多聚甲醛固定30min,再用蒸馏水洗两遍②滴加0.25%Triton, 浸泡15 min, PBS洗3次③滴加5%BSA封闭液，室温浸泡20 min，甩去多余液体，不洗④滴加小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体（1：400）4℃过夜，PBS洗3次⑤滴加TRITC（罗丹明）标记的羊抗小鼠IgG抗体（1：50），室温浸泡20 min，PBS洗3次⑥在荧光显微镜下观察并拍照。阳性细胞呈现橙红色荧光。阳性细胞的纯度≥90%。

细胞增殖实验

1.4.3.1  CCK-8实验

原理：CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS或WST -1高。由于CCK-8溶液相当稳定，并且对细胞没有毒性，可直接加入到细胞样品中长时间孵育。原理是WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)在电子耦合试剂1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成橙黄色水溶性的formazan，后者与活细胞数量成正比。

方法：神经干细胞以1×10⁴个/ ml的密度种植在96孔培养板中，每孔加0.2mL。细胞分成9组，分别为对照组、胡萝卜苷100μM组、胡萝卜苷80μM组、胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组、胡萝卜苷5μM组、胡萝卜苷2.5μM组，胡萝卜苷1.25μM组、每组设6个复孔。对照组正常培养，不作处理；其余各组给予胡萝卜苷，其终浓度分别为100μmol/L、80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L。另设空白对照孔：在无细胞的孔中加等量无血清培养基以及CCK-8。然后置37℃，5% CO₂培养箱内培养60h，之后向各孔中加入20 μl的CCK-8溶液， 37℃下孵育2h，用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度（OD值）。测试孔的实际OD值=各测试孔的OD值-空白对照孔OD值。细胞增殖率% =（处理组平均OD值-对照组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。

统计方法  应用SPSS16.0进行统计分析，首先进行方差齐性检验，方差齐用单因素方差分析（One-Way ANOVA）中提供的Bonferroni检验；不齐则用在Equal Variance Not Assumed选项中提供的Tamhane^,s T2进行分析。所得数据均用      表示。

实验结果   见表1.

  表1       各组神经干细胞OD值及细胞增殖率

                                                       （         ，n=6）

组别                       OD值                        细胞增殖率% 

对照组                   0.47±.079                          ——

胡萝卜苷100μM组              0.88±0.10★★                      87.23%

胡萝卜苷80μM组               0.92±0.16★★                      95.74%

胡萝卜苷40μM组               0.84±0.12★★                      78.72%

胡萝卜苷20μM组               0.72±0.11★                        53.19%

胡萝卜苷10μM组             0.70±0.14★                                48.94%

胡萝卜苷5μM组              0.68±0.12                         44.68%

胡萝卜苷2.5μM组             0.67±0.10                        42.55%

胡萝卜苷1.25μM组            0.67±0.07                        42.55%

★表示与正常组比较有显著性差异；△表示与模型组比较有显著性差异，P<0.05。

★★表示与正常组比较有非常显著性差异；△△表示与模型组比较有非常显著性差异，P<0.01。

结果表明，胡萝卜苷剂量10μmol/L~100μmol/L均能促进神经干细胞增殖，其中100μmol/L、80μmol/L、40μmol/L剂量组与对照组相比，差异非常显著；80μmol/L及其以下剂量显示一定的量效关系；5μmol/L以下剂量组与对照组相比无显著差异，但有促增殖的趋势。

标记免疫细胞化学染色实验

原理： Brdu即5-溴-2脱氧尿核苷。在细胞培养过程中，加入Brdu，当细胞的DNA复制时，Brdu可作为核苷酸前体物专一取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成DNA链中，主要标记DNA处于合成期的细胞。            Brdu是细胞增殖的标记物，采用Brdu免疫组化检测是目前国际公认的检测脑内增殖细胞数目的方法，Brdu阳性数目越多，增殖越明显。

方法：神经干细胞培养方法及种板同上。细胞分成对照组、胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组，每组3个复孔。对照组正常培养，不作处理；其余各组给予胡萝卜苷，其终浓度分别为40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L。在加药培养24h后于培养液中加入Brdu，终浓度10μg/ml，避光条件下继续培养72h，然后取细胞作免疫细胞化学染色：①细胞用PBS轻洗2次，继而滴加4%多聚甲醛固定30min,再用蒸馏水洗两遍②滴加30%H₂O₂和甲醇的混合液（比例为1：50），室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶③加2N Hcl 37℃ 孵育30min 进行细胞DNA、RNA解链; 再加入0. 1M 硼酸钠10min; ④滴加0.25%Triton, 浸泡15 min, PBS洗3次⑤滴加5%BSA封闭液，室温浸泡20 min，甩去多余液体，不洗；⑥滴加小鼠Brdu单克隆抗体（1：400）4℃过夜，PBS洗3次；⑦滴加羊抗小鼠IgG抗体，室温浸泡20 min，PBS洗3次；⑧滴加SABC，室温浸泡20 min，PBS洗4次；⑨DAB显色，镜下控制反应时间（15min），苏木素轻度复染，自来水冲洗⑩在显微镜下观察并拍照。被染成棕褐色为阳性细胞,整个细胞被染成淡蓝色的为阴性细胞。设阳性对照孔，根据文献，选择淫羊藿苷为阳性对照药物，终浓度为20μmol/L；另设阴性对照孔，不加入一抗孵育，其余操作步骤相同。

结果：见附图1，胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组的阳性细胞明显多于正常对照组。

 

2. 整体实验

2.1   动物、分组及处理

   老年小鼠（11月龄）20只，雌雄各半，分为空白对照组、胡萝卜苷组，每组10只。空白对照组予生理盐水灌胃，胡萝卜苷组予10mg/kg胡萝卜苷灌胃，每天一次，持续30天。

双标记以及激光共聚焦显微镜拍照

原理：Nestin是神经干细胞的标记物，Brdu是细胞增殖的标记物，两者共标记的细胞即为新生的神经干细胞。

方法：在动物处死前3天，给予小鼠腹腔注射Brdu，50mg/kg，每12h注射1次，连续注射3天。结束后12h腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，用生理盐水冲洗血管后，以4%多聚甲醛进行心脏灌注，迅速固定并取出大脑，置4%冷冻的多聚甲醛中继续固定48h。然后置20%，30%的蔗糖高渗液中脱水。之后用冰冻切片机进行切片，再进行免疫荧光化学双染色（过程同前述Brdu标记-抗Brdu免疫细胞化学染色，但一抗分别为小鼠抗Brdu抗体和兔抗小鼠 nestin，二抗分别为FITC标记的羊抗小鼠IgG和cy3标记的羊抗兔IgG ），用激光共聚焦显微镜观察及拍照，Brdu- nestin双标记的细胞呈黄色，记录新生的神经干细胞数量。

统计方法  应用SPSS16.0进行统计处理，新生的神经干细胞数量用独立样本T检验进行分析，所得数据用       表示。

实验结果   见表2。

表2           各组新生的神经干细胞数量

                                                       （         ，n=10）

组别                 新生的神经干细胞数量                      

对照组                        9.40±3.81                          

胡萝卜苷组                     19.80±3.65★★                      

★★表示与对照组比较有非常显著性差异，P<0.01。

    

结果显示，给予胡萝卜苷的老年小鼠，其新生的神经干细胞数量远多于对照组，差异非常显著。

 

3.讨论  上述离体和整体实验均证明胡萝卜苷能促进神经干细胞的增殖：离体实验中，胡萝卜苷在一定剂量范围呈现量效关系；整体实验同时证明了胡萝卜苷在老年机体中亦有助于维持神经干细胞的增殖能力，这对于老年机体中大脑细胞的稳态更新以及延缓大脑衰老进程均具有重要意义。

基于胡萝卜苷对神经干细胞具有促进增殖作用，以及其来源广泛，提取、分离、检测过程简便等特性，胡萝卜苷开发利用成为“神经干细胞促生长剂”的前景颇为乐观。

 

四   附图说明

图1. 神经干细胞中Brdu阳性细胞（倒置显微镜观察）

A．阴性对照组（400×）；       B．阳性对照组（400×）；      C．正常对照组（400×）；

D．胡萝卜苷10μM组（400×）；E．胡萝卜苷20μM组（400×）；F． 胡萝卜苷40μM组（400×）

五、具体实施方式

具体实施与发明内容中的离体、整体实验相同。

实施例1.离体实验

1.1 实验动物

怀孕14-16天的SD孕大鼠10只，由浙江省实验动物中心提供,合格证号：SCXK（浙）2008-0033. 

1. 2 主要试剂及试剂配制：

Neuralbasal培养基（GIBCO公司产品,Lot 1094141）、Ｂ27培养基添加剂(GIBCO公司产品,Lot 1159693)；大鼠b-FGF及EGF（Pepro TECH公司产品, EGF：Lot 0906390-1 H2911；b-FGF： Lot 1305CY12）小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体、TRITC（罗丹明）标记的羊抗小鼠IgG抗体、Brdu及其抗体 (武汉博士德生物技术有限公司产品)；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；胡萝卜苷，由南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室提供，纯度≥98%；

解剖液:D-hank^,s,(pH7.2-7.4)：NaCl8.0g，Na₂HP0₄·12H₂O0.132g，KH₂P O ₄0.06g，KCl0.4g， NaHCO ₃0.35g, 用去离子水配成1000ml溶液；

0.125%胰酶：0.125g胰酶溶解于100ml D-hank^,s中；

种植培养基:由90%DMEM培养基和10%胎牛血清(杭州四季青生物工程公司产品)配制；

无血清培养基:由97%neuralbasal培养基、2%Ｂ27培养基添加剂以及终浓度为20μg/L的b-FGF和EGF配制而成解剖液、胰酶、培养液皆过滤除菌，4⁰C保存备用。

主要仪器及器材

SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司):CO₂细胞培养箱(SANYO,日本);荧光倒置显微镜(OLYMPUS,日本)；低速自动平衡离心机(LDZ5-2型,北京医用离心机厂)；酶标仪（BIO-RAD,USA）6孔和96孔细胞培养板(Corning,USA) 200目尼龙筛网（罩在100ml的小烧杯上，用胶布粘牢），弯头无齿镊，直径为12mm的弯头滴管；50ml盐水瓶；直径为10cm的表面皿 ，皆经15磅30min高温高压灭菌。

实验方法

1.4.1 神经干细胞的分散、种植和培养

具体操作过程如下:1.孕鼠用10%水合氯醛麻醉，全身用碘伏消毒，无菌条件下剖腹，取出胎鼠；2.用弯头镊撕开胎鼠头皮和颅骨,暴露两侧大脑半球,用弯头无齿镊小心分开颞叶皮层,暴露并取出海马回,置解剖液中；3.将海马组织块用解剖液清洗,转入装有约海马组织体重20倍体积的胰酶的盐水瓶中，用光滑的弯头滴管反复吹打至组织块完全消失，液体呈浑浊状；4.将液体用等体积的种植培养基终止消化，过200目尼龙筛网；5.1500ｇ/r离心12min，倾去上清液，用种植培养基使细胞聚集体重悬，以1×10⁶个/ ml的密度将细胞种植在6孔培养板中，每孔加2mL；7.置37℃,5%饱和湿度CO₂培养箱内培养。第2天将培养液全部换成无血清培养液，以后用无血清培养液每隔2ｄ换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待出现肉眼可见的大量成簇生长的细胞球时，用1mL枪头吸取细胞球，移至新的6孔培养板中培养，如此过程重复三遍，以纯化神经干细胞，此时可传代。用3~5代的细胞进行实验。

细胞增殖实验

1.4.2.1  CCK-8实验

方法：神经干细胞以1×10⁴个/ ml的密度种植在96孔培养板中，每孔加0.2mL。细胞分成9组，分别为对照组、胡萝卜苷100μM组、胡萝卜苷80μM组、胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组、胡萝卜苷5μM组、胡萝卜苷2.5μM组，胡萝卜苷1.25μM组、每组设6个复孔。对照组正常培养，不作处理；其余各组给予胡萝卜苷，其终浓度分别为100μmol/L、80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L。另设空白对照孔：在无细胞的孔中加等量无血清培养基以及CCK-8。然后置37℃，5% CO₂培养箱内培养60h，之后向各孔中加入20 μl的CCK-8溶液， 37℃下孵育2h，用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度（OD值）。测试孔的实际OD值=各测试孔的OD值-空白对照孔OD值。细胞增殖率% =（处理组平均OD值-对照组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。

统计方法  应用SPSS16.0进行统计分析，首先进行方差齐性检验，方差齐用单因素方差分析（One-Way ANOVA）中提供的Bonferroni检验;不齐则用在Equal Variance Not Assumed选项中提供的Tamhane^,s T2进行分析。所得数据均用       表示。

实验结果   见表1.

  表1       各组神经干细胞OD值及细胞增殖率

                                                       （         ，n=6）

组别                       OD值                        细胞增殖率% 

对照组                   0.47±.079                          ——

胡萝卜苷100μM组              0.88±0.10★★                      87.23%

胡萝卜苷80μM组               0.92±0.16★★                      95.74%

胡萝卜苷40μM组               0.84±0.12★★                      78.72%

胡萝卜苷20μM组               0.72±0.11★                        53.19%

胡萝卜苷10μM组             0.70±0.14★                                48.94%

胡萝卜苷5μM组              0.68±0.12                         44.68%

胡萝卜苷2.5μM组             0.67±0.10                        42.55%

胡萝卜苷1.25μM组            0.67±0.07                        42.55%

★表示与正常组比较有显著性差异；△表示与模型组比较有显著性差异，P<0.05。

★★表示与正常组比较有非常显著性差异；△△表示与模型组比较有非常显著性差异，P<0.01。

结果表明，胡萝卜苷剂量10μmol/L~100μmol/L均能促进神经干细胞增殖，其中100μmol/L、80μmol/L、40μmol/L剂量组与对照组相比，差异非常显著；80μmol/L及其以下剂量显示一定的量效关系；5μmol/L以下剂量组与对照组相比无显著差异，但有促增殖的趋势。

标记免疫细胞化学染色实验

方法：神经干细胞培养方法及种板同上。细胞分成对照组、胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组，每组3个复孔。对照组正常培养，不作处理；其余各组给予胡萝卜苷，其终浓度分别为40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L。在加药培养24h后于培养液中加入Brdu，终浓度10μg/ml，避光条件下继续培养72h，然后取细胞作免疫细胞化学染色：①细胞用PBS轻洗2次，继而滴加4%多聚甲醛固定30min,再用蒸馏水洗两遍②滴加30%H₂O₂和甲醇的混合液（比例为1：50），室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶③加2N Hcl 37℃ 孵育30min 进行细胞DNA、RNA解链; 再加入0. 1M 硼酸钠10min; ④滴加0.25%Triton, 浸泡15 min, PBS洗3次⑤滴加5%BSA封闭液，室温浸泡20 min，甩去多余液体，不洗；⑥滴加小鼠Brdu单克隆抗体（1：400）4℃过夜，PBS洗3次；⑦滴加羊抗小鼠IgG抗体，室温浸泡20 min，PBS洗3次；⑧滴加SABC，室温浸泡20 min，PBS洗4次；⑨DAB显色，镜下控制反应时

间（15min），苏木素轻度复染，自来水冲洗⑩在显微镜下观察并拍照。被染成棕褐色为阳性细胞,整个细胞被染成淡蓝色的为阴性细胞。设阳性对照孔，根据文献，选择淫羊藿苷为阳性对照药物，终浓度为20μmol/L；另设阴性对照孔，不加入一抗孵育，其余操作步骤相同。

结果：胡萝卜苷40μM组、胡萝卜苷20μM组、胡萝卜苷10μM组的阳性细胞明显多于正常对照组。

实施例2.整体实验

2.1   动物、分组及处理

   老年小鼠（11月龄）20只，雌雄各半，分为空白对照组、胡萝卜苷组，每组10只。空白对照组予生理盐水灌胃，胡萝卜苷组予10mg/kg胡萝卜苷灌胃，每天一次，持续30天。

2.2   Brdu- nestin双标记以及激光共聚焦显微镜拍照

方法：在动物处死前3天，给予小鼠腹腔注射Brdu，50mg/kg，每12h注射1次，连续注射3天。结束后12h腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，用生理盐水冲洗血管后，以4%多聚甲醛进行心脏灌注，迅速固定并取出大脑，置4%冷冻的多聚甲醛中继续固定48h。然后置20%，30%的蔗糖高渗液中脱水。之后用冰冻切片机进行切片，再进行免疫荧光化学双染色（同前述Brdu标记-抗Brdu免疫细胞化学染色，但一抗分别为小鼠抗Brdu抗体和兔抗小鼠 nestin，二抗分别为FITC标记（绿色）的羊抗小鼠IgG和cy3标记（红色）的羊抗兔IgG ），用激光共聚焦显微镜观察及拍照，Brdu- nestin双标记的细胞呈黄色，记录新生的神经干细胞数量。

统计方法  应用SPSS16.0进行统计处理，新生的神经干细胞数量用独立样本T检验进行分析，所得数据用       表示。

实验结果   见表2。

表2           各组新生的神经干细胞数量

                                                       （         ，n=10）

组别                 新生的神经干细胞数量                      

对照组                        9.40±3.81                          

胡萝卜苷组                     19.80±3.65★★                      

★★表示与对照组比较有非常显著性差异，P<0.01。

    

结果显示，给予胡萝卜苷的老年小鼠，其新生的神经干细胞数量远多于对照组，差异非常显著。 

Claims (2)

1. 胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用。

2.胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖保健品中的应用。

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