CN101810812B - 高良姜有效部位在制备治疗白癜风的药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高良姜有效部位在制备治疗白癜风的药物的用途，是从植物高良姜根茎中提取有效部位总黄酮，然后将提取物总黄酮按常规制药方法制成胶囊、片剂、颗粒、或滴丸剂型使用。通过实验表明含高良姜素有效部位可以促进黑素细胞增殖，上调酪氨酸酶活性，增加黑素含量；抑制小鼠免疫系统作用；白癜风动物模型皮肤基底层黑色素细胞数、基底层含黑素颗粒细胞数显著增多，酪氨酸酶表达增强。为以植物高良姜根茎为原料制备治疗白癜风的药物提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体是从中药高良姜中提取含高良姜素的有效部位作为制备治疗白癜风的药物的用途。
背景技术
白癜风是三大世界性疑难性皮肤病之一，在世界各地均有发生，发病率约在1-2％。并且，全世界各地不断发病的报道均有继续上升趋势。白癜风是一种常见多发的后天性、原发性皮肤色素脱失症，非继发于其他皮肤病之后遗留的脱色素性病变，表现为局部或泛发性脱色素性病变。白癜风的危害性不仅仅是影响患者容貌，而且还给患者施以严重的心理压力和精神上的痛苦。因此，对本病的防治具有重要的意义。
白癜风发病机制复杂，病因还不完全清楚。由于白癜风的发病机制尚不清楚，因此对白癜风的治疗仅停留在治标的阶段。目前白癜风的药物治疗方法有皮质激素疗法，苯丙氨酸配合UVA疗法，补骨脂素联合UVA治疗和中药治疗。
高良姜为姜科植物高良姜(Alpinia officeinarumHance)的干燥根茎。具有温胃、祛风、散寒、行气、止痛的功效，临床常用于治疗脘腹寒痛、胃寒呕吐、消化不良、嗳气吞酸等病症，高良姜化学成份复杂，药理活性强，有较强的抗溃疡、抗腹泻、利胆、镇痛、抗炎、抗缺氧、抗凝、抗血栓形成等作用，但关于高良姜含高良姜素有效部位作为制备治疗白癜风的药物用途尚未见报道。
高良姜素通用名为galangin，化学名为3，5，7-三羟基黄酮，是中药高良姜中主要有效成分之一。高良姜中除此之外，还含有山奈酚，槲皮素等黄酮类成分。
高良姜药理作用多，但目前还没有对其在治疗白癜风方面的药理用途。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种含高良姜素有效部位作为制备治疗白癜风的药物的用途，是从植物高良姜根茎中提取总黄酮有效部位，然后将提取物总黄酮按常规制药方法制成胶囊、片剂、颗粒、或滴丸剂型，通过实验表明含高良姜素有效部位可以促进黑素细胞增殖，上调酪氨酸酶活性，增加黑素含量；抑制小鼠免疫系统作用；白癜风动物模型皮肤基底层黑色素细胞数、基底层含黑素颗粒细胞数显著增多，酪氨酸酶表达增强。为以植物高良姜根茎为原料制备治疗白癜风的药物提供了新的途径。
本发明所述的含高良姜素有效部位作为制备治疗白癜风的药物用途，是从植物高良姜根茎中提取含高良姜素有效部位，然后将提取物按常规制药方法制成胶囊、片剂、颗粒、或滴丸剂型，具体操作按下列步骤进行：
a、以植物高良姜根茎为原料，用50-95％浓度的乙醇进行3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度60-80℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％；
或将步骤a总粗提物用石油醚、乙酸乙酯或氯仿溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
本发明采用相关的药理学实验方法进行体内外药效学实验，说明含高良姜素有效部位在用于治疗白癜风方面的药物用途。
含高良姜素有效部位是指以干品重量计算含总黄酮大于50％，高良姜素的含量为20-99.8％，含高良姜素有效部位中总黄酮的测定方法：采用文献[林辉.中药高良姜总黄酮的含量测定.2001，12(6)：486]分光光度法测定。
高良姜素的测定方法：采用文献[李彩君，等.HPLC法测定高良姜中高良姜素的含量.2002，13(1)：41]高效液相色谱法测定。
本发明所述的含高良姜素有效部位作为制备治疗白癜风的药物用途，通过实验表明含高良姜素有效部位可以促进黑素细胞增殖，上调酪氨酸酶活性，增加黑素含量；抑制小鼠免疫系统作用；白癜风动物模型皮肤基底层黑色素细胞数、基底层含黑素颗粒细胞数显著增多，酪氨酸酶表达增强。
具体实施方式
实施例1
a、以植物高良姜根茎为原料，用50％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度60℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用体积百分比30％乙醇溶解，用聚酰胺柱吸附，再用体积百分比40％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
实施例2
a、以植物高良姜根茎为原料，用60％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度65℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用石油醚溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比40％乙醇溶解，用大孔树脂吸附，用体积百分比50％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％；
实施例3
a、以植物高良姜根茎为原料，用70％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度70℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用体积百分比50％乙醇溶解，用大孔树脂吸附，用体积百分比55％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
实施例4
a、以植物高良姜根茎为原料，用80％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度75℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用乙酸乙酯溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比55％乙醇溶解，用聚酰胺柱吸附，用体积百分比65％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
实施例5
a、以植物高良姜根茎为原料，用95％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度80℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用体积百分比60％乙醇溶解，用大孔树脂吸附，用体积百分比70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
实施例6
a、以植物高良姜根茎为原料，用95％浓度的乙醇进行提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度78℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用氯仿溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比60％乙醇溶解，用聚酰胺柱吸附，用体积百分比60％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，进一步采用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
实施例7
含高良姜素有效部位的体外药效学实验：
筛选模型：正常人黑素细胞，HaCat细胞
细胞培养方法：取正常儿童环切包皮，选用加入CT，bFGF，TPA的DMEM培养基常规原代培养一周，HaCat常规DMEM培养，共培养体系以黑素细胞∶HaCat细胞＝1∶3接种于96孔板，传代培养24h后，加入不同浓度的药物和对照，48h后进行测定分析相关指标。阳性对照药为8-mop(日本东京化成)，浓度为5ug/ml。
细胞增殖的测定使用MTT法；酪氨酸酶活性的测定使用多巴氧化法；黑素含量用NaOH法；结果见表1。
表1含高良姜素有效部位对黑素细胞、共培养体系细胞的影响
(x±S，n＝6)
[注]*为与正常对照组比较P＜0.05；**为与正常对照组比较P＜0.01。
含高良姜素有效部位对黑素细胞迁移功能的影响：
取transwell，在上表面涂布50ul人纤维连接蛋白(FN)(10ug/ml，)，在干燥的孵箱中干燥2h，在24孔培养板中加入600ulDMEM培养基(10％牛血清FBS)，将预处理过的Transwell放入孔中，药物处理过的细胞胰酶消化后用DMEM(不含FBS)稀释为1×105/ml，取200ul加入Transwell小室的上室放入培养箱培养18h，取出Transwell，用棉签擦去上室细胞和FN，缓冲液(PBS)洗2遍，将小室放入醋酸∶甲醇＝1∶3的固定液中固定30min，晾干，放入吉姆萨中染色10min，PBS洗涤3遍，晾干后将小室放在载玻片上，置于显微镜下观察细胞，换不同视野拍照，每组8张，细胞计数。结果见表2.
表2含高良姜素有效部位对黑素细胞迁移功能的影响(x±S，n＝8)
[注]*为与正常对照组比较P＜0.05；**为与正常对照组比较P＜0.01。
含高良姜素有效部位对黑素细胞粘附能力的影响：
96孔板，每孔20ulFN(5ug/ml)，室温晾干，将药物预处理过细胞制备成5×104/ml的细胞悬液，每孔100ul，每组6个重复孔培养1h，吸去上清，加入10％三氯乙酸50ul，4℃固定1h，蒸馏水冲洗5遍，晾干。2％结晶紫染色10min，蒸馏水冲洗晾干。每孔加入2％SDS100ul震荡5min，570nm测定OD值，结果见表3。
表3含高良姜素有效部位对黑素细胞粘附能力的影响(x±S，n＝6)
[注]*为与正常对照组比较P＜0.05；**为与正常对照组比较P＜0.01。
结果分析：结果表明含高良姜素有效部位可使黑素细胞增殖，酪氨酸酶活性提高，黑素含量增加；并以共培养体系更为明显；说明含高良姜素有效部位可通过刺激角质形成细胞分泌相关细胞因子作用于黑素细胞使得黑素合成增多。
实施例8
含高良姜素有效部位的体内药效学研究：
通过灌胃给药观察含高良姜素有效部位对黑色豚鼠皮肤基底层黑素细胞，酪氨酸酶活性表达的影响。
动物模型的建立：
黑色豚鼠背部每天涂抹5％氢醌，每次0.5ml，每天2次，涂抹30天；常规制作石蜡切片观察发现，黑色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞，基底层含黑素颗粒细胞，酪氨酸酶表达减弱。模型成功。8.2不同剂量的含高良姜素有效部位对黑色豚鼠皮肤增色作用
黑色豚鼠72只，随机分为6组；脱去背部黑色毛5cm×5cm，其中第1组涂抹生理盐水，其余5组采用等量5％氢醌脱色，连续涂抹30天。
I组(正常对照组)动物脱毛区涂抹生理盐水0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。而后每天灌胃生理盐水2ml，连续30天。
II组(模型组)动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。
IV组(阳性对照组)动物脱毛区涂抹氢醌5％0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。而后隔天灌胃8-甲氧沙林片0.93mg/只，连续30天。
V组(低剂量组)动物脱毛区涂抹氢醌5％0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。而后每天灌胃相当于高良姜生药0.186g/只，连续30天。
VI组(中剂量组)动物脱毛区涂抹氢醌5％0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。而后每天灌胃相当于高良姜生药0.930g/只，连续30天。
VII组(高剂量组)动物脱毛区涂抹氢醌5％0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。而后每天灌胃相当于高良姜生药1.860g/只，连续30天。
结果处理：给药结束后，处死动物，取皮肤组织，常规石蜡包埋，切片后分别进行Dopa-氧化酶染色、Lillie染色、DAB-H2O2染色以及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)常规染色，光镜下(400×)观察。
表皮黑素细胞的观察：
皮肤切片Dopa-氧化酶染色后置于光镜下观察，每个标本观察10个视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。SPSS12.0软件统计分析。结果见表4。
表4含高良姜素有效部位对豚鼠表皮黑素细胞数的影响(x±S，n＝10)
[注]△为与模型组比较P＜0.05；△△为与模型组比较P＜0.01。
含黑素颗粒的基底细胞计数：
皮肤切片Lillie染色后置于光镜下观察，每个标本观察10个视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。SPSS12.0软件统计分析。结果见表5。
表5含高良姜素有效部位对豚鼠表皮含黑素颗粒基底细胞数的影响
(x±S，n＝10)
[注]△为与模型组比较P＜0.05；△△为与模型组比较P＜0.01。
酪氨酸酶含量观察：
采用二级计分法对酪氨酸酶阳性表达情况进行判定，酪氨酸酶阳性产物定位于细胞的细胞质内，为黄色或棕黄色颗粒。阳性细胞计数＜5％为0分；5％-25％为1分；25％-50％为2分；50％-75％为3分；＞75％为4分。按染色强度分类：淡黄色1分；黄或深黄2分；褐或棕黄色3分。两者相加小于2分为阴性(-)，2-3分为阳性(+)，4-5分为中等阳性(2+)，6-7分为强阳性(3+)。各组动物皮肤之间的阳性率比较均采用Wilcoxon秩和检验，P≤0.05为差异有显著性差异。结果见表6。
表6含高良姜素有效部位对豚鼠表皮酪氨酸酶强度的影响(x)
[注]*为与模型组比较P＜0.05；**为与模型组比较P＜0.01。
黑素细胞刺激素(a-MSH)阳性表达数的观察：
采用二级计分法对a-MSH阳性表达情况进行判定，a-MSH阳性产物定位于黑素细胞胞浆和细胞外基质内细胞质内，以显微镜下黑素细胞胞浆或细胞外基质出现棕黄色颗粒状或团块状者为阳性。阳性细胞计数＜10％为0分；11％-40％为1分；41％-70％为2分；＞71％为3分。按着色深浅分类：淡黄色0分；黄或深黄1分；褐或棕黄色2分；深棕色为3分。两者相加小于2分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为阳性(2+)，6-7分为强阳性(3+)。各组动物皮肤之间的阳性率比较均采用Wilcoxon秩和检验，P≤0.05为差异有显著性差异。结果见表7。
表7含高良姜素有效部位对豚鼠表皮a-MSH阳性表达数的影响(x)
[注]*为与模型组比较P＜0.05；**为与模型组比较P＜0.01。
结果分析：通过上述实验表明含高良姜素有效部位能够通过活化黑素细胞，增强黑素合成，激活酪氨酸酶活性来达到色素恢复的作用。与此同时，含高良姜素有效部位对黑素细胞刺激素也具有明显的促进作用，这提示含高良姜素有效部位可能通过刺激分泌黑素细胞刺激素达到黑素细胞增殖并迁移至病灶区，从而治愈白癜风。
实施例9
不同剂量的含高良姜素有效部位对小鼠免疫调节作用：
MTT法考察含高良姜素有效部位对小鼠免疫功能的抑制作用
动物分组：共40只小鼠，随机分为4组，每组10只：对照组，含高良姜素有效部位高、中、低剂量三组。
脾细胞悬液制备：无菌条件下，剥离小鼠脾脏，PBS清洗，置于细胞过滤筛，研碎脾脏，RPMI-1640液冲洗，1000r/min离心10min，弃上清，再加入2ml0.83％NH4CL，静置3min，除去红细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用RPMI-1640培养液调节细胞浓度为(1-5)*106个/ml。
T、B淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100ul，药物组再加入100ul不同浓度的药物，药物+conA组加入100ul不同浓度的药物以及conA溶液(终浓度为5mg/ml)，conA对照组加入RPMI-1640培养液100ul以及conA溶液(终浓度为5mg/ml)，生长对照组加入RPMI-1640培养液100ul，每个浓度6个复孔，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养66h后，向每孔中加入10ul的MTT(浓度10mg/ml)，继续孵育4h，离心(1000rpm，10min)后，轻轻吸弃上清液，加入100ulDMSO，震荡5min，于酶标仪570nm处测定OD值。结果见表8。
表8含高良姜素有效部位对小鼠T、B淋巴细胞的影响(x±S，n＝6)
[注]*为与生长对照组比较P＜0.05；**为与生长对照组比较P＜0.01。
含高良姜素有效部位对小鼠免疫球蛋白的影响：
动物分组：共60只小鼠，随机分为6组，每组10只：正常对照组，模型组，阳性对照组，含高良姜素有效部位高、中、低剂量三组。
小鼠免疫功能低下模型的建立：
上述动物除正常对照组外，其余五组于实验开始日一次性予以腹腔注射环磷酸胺(300mg/kg)，诱导建立小鼠免疫功能低下模型。
诱导建立小鼠免疫功能低下模型后，按照如下方法进行给药观察，连续观察给药10天。
I组：正常对照组，每只小鼠每天灌胃生理盐水0.2ml；
II组：模型组，每只每天灌胃生理盐水0.2ml；
III组：阳性对照组，每只每天灌胃0.2％左旋咪唑1次，每次0.2ml；
IV组：高剂量组，每只小鼠每天灌胃含高良姜素有效部位80mg/只；
V组：中剂量组，每只小鼠每天灌胃含高良姜素有效部位40mg/只；
VI组：低剂量组，每只小鼠每天灌胃含高良姜素有效部位20mg/只。
对小鼠免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的影响：
各实验组小鼠末次用药后禁食，24h后处死动物，摘眼球取血，分离血清用于测定免疫球蛋白IgG、IgM、IgA(mg/L)。数据进采用SPSS统计软件行组间t检验。结果见表9。
表9高良姜对小鼠免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的影响(x±S，n＝4)
[注]*为与生长对照组比较P＜0.05；**为与生长对照组比较P＜0.01。
对小鼠胸腺系数及脾脏系数的影响：
各实验组小鼠末次用药后禁食，24h后处死动物，取脾脏以及胸腺，称重，计算脾脏、胸腺指数(mg/10g体重)。数据进行组间t检验。结果见表10。
表10含高良姜素有效部位对小鼠胸腺系数及脾脏系数的影响
(x±S，n＝10)
[注]*为与生长对照组比较P＜0.05；**为与生长对照组比较P＜0.01。
结果分析：通过结果可以看出，含高良姜素有效部位具有一定的免疫抑制作用。
实施例10
高良姜含高良姜素有效部位治疗白癜风临床疗效观察：
白癜风患者68例，男30例，女38例，年龄8-75岁，平均26.1岁；病程1-12月35例，1-5年18例，6-30年15例；临床分型：泛发型12例，散发性13例，局限型28例，节段性15例；临床分期：进展期42例，稳定期26例。随机分为两组，经统计学处理，两组无显著性差异(P＞0.05)。治疗组34例，给予含高良姜素有效部位的制剂；对照组34例，给予阳性对照药8-甲氧沙林片。
疗效判定标准
痊愈：白斑全部消退，恢复正常肤色；
显效：白斑部分消退或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积≥50％；
有效：白斑部分消退或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积10％-50％；
无效：白斑无变化或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积＜10％.
数据处理及统计方法，使用Epi Info version 6.04b软件Epitable过程作数据处理及分析。
结果：含高良姜素有效部位治疗白癜风34例临床疗效观察，治疗组34例，痊愈7例，显效10例，有效9例，无效8例，痊愈率20.59％，总有效率76.47％；对照组34例，痊愈8例，显效8例，有效11例，无效7例，痊愈率23.54％，总有效率79.41％。治疗组与对照组相比，无显著性差异(χ2＝0.81，P＝0.21)。结果见表11。
表11两组白癜风患者临床疗效观察
含高良姜素有效部位治疗白癜风不同患病年龄、病期和临床类型疗效比较结果治疗效果与治疗时间、发病年龄、病程及临床类型有关，治疗时间越长、年龄越小、病程越短、病情越轻，则疗效越好，结果见表12.
表12含高良姜素有效部位治疗不同病患
讨论：由以上结果，可以看出从高良姜根茎中制备含高良姜素有效部位制备成口服或外用制剂，临床上能够治疗白癜风，但是治疗效果与病程长短、治疗时间、发病年龄及临床分型有关，，且无明显副作用，其治疗白癜风患者痊愈率和总有效率与8-甲氧沙林片相比无显著性差异(P＞0.05)，提示含高良姜素有效部位治疗白癜风有效，可推广应用。
Claims (1)
1.一种含高良姜素有效部位作为制备治疗白癜风的药物的用途，其特征在于从植物高良姜根茎中提取含高良姜素有效部位，然后将提取物按常规制药方法制成胶囊、片剂、颗粒、或滴丸剂型，具体操作按下列步骤进行：
a、以植物高良姜根茎为原料，用50-95％浓度的乙醇提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度60-80℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；
b、再将总粗提物用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％；
或将步骤a总粗提物用石油醚、乙酸乙酯或氯仿溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。
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