CN104341379A

CN104341379A - 一种高良姜素的提取方法

Info

Publication number: CN104341379A
Application number: CN201310334505.7A
Authority: CN
Inventors: 叶青
Original assignee: SHANGHAI U-SEA BIOTECH Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI U-SEA BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明公开了一种充分利用中药材制备高纯度高良姜素的方法，包括：多次合并组成比例类似中间产物，并采用葡聚糖层析和甲醇重结晶来获得高纯度高良姜素。与现有技术相比，本发明采用葡聚糖层析和甲醇重结晶方法来分离高良姜总粗提物中的高良姜素和山奈素，不仅能使高良姜素的纯度达到98-99.5％；而且通过科学合理的合并馏分设计，可以重复利用分离纯化过程中的各种纯度不高的馏分和粗品，充分利用药材资源，节省成本，方便操作。该方法使高良姜素开发为医药原料，尤其是中药注射剂和中成药的原料药成为可能。

Description

一种高良姜素的提取方法

技术领域

本发明涉及一种中药化合物提取分离方法，具体说，是涉及一种高良姜素的提取方法以实现获得高纯度的高良姜素直接用于医药制剂应用中。

背景技术

高良姜为姜科植物高良姜(Alpinia officinarumHance)的干燥根茎中药材。自古以来，作为一种温胃散寒，理气止痛的中药，临床常用于治疗脘腹寒痛、胃寒呕吐、消化不良、嗳气吞酸等病症。高良姜化学成分复杂，药理活性强，具有较强的抗溃疡、利腹泻、利胆、镇痛、消炎、抗缺氧、抗凝、抗血栓形成等作用。现代对高良姜的研究主要是集中在高良姜挥发油和高良姜黄酮类化合物。对后者的研究主要是对高良姜素的抗肿瘤作用的研究和对胃溃疡的治疗作用。高良姜素被认为是有前景的化学预防剂和抗微生物药物。高良姜素的抗肿瘤活性受到关注。但目前高良姜的使用多在中成药的复方中；高良姜素还没有被开发为抗肿瘤或其他治疗作用的药品或药物组合物。如果要进一步开发其医药用途，高良姜素必须纯度达到98％及以上，高良姜素的制备方法也必须方便可行，成本低廉。

高良姜药材中主要的黄酮化合物有高良姜素、槲皮素、山奈酚、山奈素、异鼠李素、槲皮素-5-甲醚和高良姜素-3-甲醚等。其中高良姜素是主要功能性成分，其化学结构(如式1所示)和山奈素的化学结构(如式2所示)类似，不难看出，山奈素仅比高良姜素多一个甲氧基。这种细微差异使两者物理化学性质非常接近，尤其是溶解度性质与极性上没有太大的区别；以致于用比较粗略的分离纯化方法，如常压正相层析色谱法，聚酰胺柱法，大孔吸附树脂法，或重结晶法都不能使两者很好地分离。另外，这两种化合物在高效液相色谱(HPLC)也需要通过比较长的时间的洗脱才能达到基线分离，现有技术中采用高效液相色谱分离得出的谱图如图1所示，可见这两种化合物并不能很好的分离。

式1

式2

现有技术中普通的纯化分离方法，如常压正相层析色谱法，聚酰胺柱法，大孔吸附树脂法，或重结晶法，都只能将高良姜粗提物中的高良姜素和山奈素与其它化学性质差异比较大的黄酮化合物分离，而不能很好地分离高良姜素和山奈素两者本身。往往使用这些方法只能分离出粗提物中的部分高良姜素，大部分高良姜素和山奈素的混合物只能丢弃。这造成了高良姜素纯度不能达到医药原料的要求，且伴随着药材的浪费。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种高良姜素的提取方法，以高得率获得高纯度的高良姜素从而实现将其提取物直接用于后续的医药制剂应用中。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高良姜素的提取方法，其具体包括以下步骤：

a)取高良姜干燥药材经粉碎、醇提、乙酸乙酯萃取制得高良姜素总粗提物；

b)将步骤a)获得的高良姜素总粗提物以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱经硅胶柱层析，通过薄层层析检测各洗脱馏分，将各馏分中相同高良姜素和山奈素配比的馏分合并浓缩，获得不同配比高良姜素和山奈素的混合粗品；

c)将步骤b)获得高良姜素百分含量大于90％的混合粗品经甲醇重结晶使高良姜素的纯度达98％或以上；

d)将步骤b)中的混合粗品中高良姜素百分含量小于90％的混合粗品再经葡聚糖凝胶柱层析通过甲醇洗脱，采用薄层层析检测各洗脱馏分，分别获得山奈素、山奈素：高良姜素＝2∶1、山奈素：高良姜素1∶2和高良姜素四种馏分；

e)将步骤d)获得经葡聚糖凝胶柱层析的高良姜素馏分经甲醇重结晶使高良姜素的纯度达98％或以上；

g)将步骤d)获得经葡聚糖凝胶柱层析的山奈素：高良姜素＝2∶1、山奈素：高良姜素1∶2两种馏分再经步骤d)进行葡聚糖凝胶柱层析后，再将获得的高良姜素馏分经步骤e)重结晶；反复重复上述操作至获得纯度达98％的高良姜素提取物。

作为进一步优选方案，所述步骤a)的具体操作如下：取高良姜药材制成饮片或用打粉机打碎成粗粉，用5～8倍量75％7醇提取两次，每次1小时；浓缩乙醇提取液，回收乙醇；再加入药材重量2-3倍的水，并用等体积乙酸乙酯萃取两次；浓缩乙酸乙酯层，并回收乙酸乙酯，获得高良姜素总粗提物。

作为进一步优选方案，步骤b)的具体操作如下：将步骤a)中获得的总粗提物加入适量正相硅胶，拌样抽干，并置于硅胶柱上端，进行柱层析的分离，并采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱；采用薄层层析检测各洗脱馏分，获得不同高良姜素和山奈素配比的混合粗品，并按照相同高良姜素和山奈素配比进行合并馏分，再浓缩各馏分；优选按如下配比合并馏分：高良姜素∶山奈素＝90～95∶10～5、70～80∶30～20、60～50∶40～50、30～40∶70～60、10～20∶90～80。

作为进一步优选方案，步骤c)中经甲醇重结晶使高良姜素的纯度为达98～99.5％。

作为进一步优选方案，步骤d)中葡聚糖凝胶抽提的上样体积为柱体积的1～10％，洗脱流速为0.8～1.0ml/min。

作为进一步优选方案，步骤e)中经甲醇重结晶使高良姜素的纯度为达98～99.5％。

与现有技术相比，多次合并组成比例类似中间产物，并采用葡聚糖层析和甲醇重结晶来获得高纯度高良姜素。本发明采用葡聚糖层析和甲醇重结晶方法来分离高良姜总粗提物中的高良姜素和山奈素，不仅能使高良姜素的纯度达到98-99.5％；而且通过科学的合并馏分设计，可以重复利用分离纯化过程中的各种纯度不高的馏分和粗品，充分利用药材资源，节省成本，方便操作。该方法使高良姜素开发为医药原料，尤其是中药注射剂和中成药原料药成为可能。

附图说明

图1为现有技术高良姜素和山奈素的高效液相图谱(峰1为高良姜素，峰2为山奈素)；

图2为本发明实施例1提供的高良姜素提取方法测得的高效液相图谱(峰1为高良姜素，峰2为山奈素)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。

本实施例中使用化学试剂和生物试剂均为分析纯或分析纯以上，且所用试剂和仪器均为市售品种，如无特殊说明，均按照相应说明书操作。

实施例1

①高良姜(Alpinia officinarumHance)干燥药材用打粉机打碎成粗粉，用体积百分含量为75％乙醇提取2次，料液比为5倍，每次1小时。乙醇提取液浓缩，回收乙醇浓缩液；浓缩液加适量水，并用等体积乙酸乙酯萃取两次；乙酸乙酯层浓缩，回收乙酸乙酯浓缩液，制得高良姜素粗提物；

②将获得的总粗提物加入适量正相硅胶，拌样抽干，并置于硅胶柱上端，进行柱层析的分离，并采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱；

③采用薄层层析检测(TLC)各洗脱馏分。TLC方法：展开剂：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝6.5∶3∶0.5；高良姜素Rf值约为0.6，山奈素Rf值约为0.5；在紫外灯254nm下观察高良姜素和山奈素斑点大小，并估计两者的比例。按照不同高良姜素和山奈素的比例进行合并馏分，各馏分比例设计为高良姜素∶山奈素为：95∶5、90∶10、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80、10∶90，浓缩各馏分；

④将步骤③制得各馏分用甲醇进行结晶处理，得到各种比例高良姜素-山奈素粗品结晶；

⑤所述步骤④所得含高良姜素纯度比较高的粗品，即高良姜素和山奈素比例为95∶5，90∶10的两组，直接通过甲醇重结晶，得高良姜素的纯度达98％；

⑥将高良姜索-山奈素的混合物粗品用甲醇溶解，加于葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)上端，上样体积为柱体积的3％，洗脱流速为1.0ml/min，采用甲醇进行洗脱；

⑦采用薄层层析检测(方法同上)各洗脱馏分，按照不同高良姜素和山奈素的比例进行合并馏分，最终将所有馏分分成山奈素主要，山奈素-高良姜素2∶1，山奈素-高良姜素1∶2，和高良姜素主要等4个馏分，浓缩各馏分；

⑧将⑦步骤制得馏分与步骤④制得比例类似的粗品结晶混合，其中山奈素-高良姜素2∶1与80∶20和60∶40混合，山奈素-高良姜素1∶2与40∶60和20∶80混合，山奈素主要与10∶90混合，再次上葡聚糖凝聚柱，按前述方法进行洗脱，合并和重结晶，所得高良姜素经HPLC检测纯度达98％。

实施例2

①高良姜(Alpinia officinarumHance)干燥药材用打粉机打碎成粗粉，用体积百分含量为75％乙醇提取2次，料液比为8倍，每次1小时。乙醇提取液浓缩，回收乙醇浓缩液；浓缩液加适量水，并用等体积乙酸乙酯萃取两次；乙酸乙酯层浓缩，回收乙酸乙酯浓缩液，制得高良姜素粗提物。

③采用薄层层析检测(方法同上)各洗脱馏分，按照不同高良姜素和山奈素的比例进行合并馏分，各馏分比例设计是高良姜素∶山奈素为：95∶5、90∶10、70∶30、60∶40、40∶60、30∶70、10∶90，浓缩各馏分；

⑥将高良姜素-山奈素的混合物粗品用甲醇溶解，加于葡聚糖凝聚柱(Sephadex LH-20)上端，上样体积为柱体积的5％，洗脱流速为1.0ml/min，采用甲醇进行洗脱；

⑧将⑦步骤制得馏分与步骤④制得比例类似的粗品结晶混合，其中山奈素-高良姜素2∶1与70∶30和60∶40混合，山奈素-高良姜素1∶2与40∶60和30∶70混合，山奈素主要与10∶90混合，再次上葡聚糖凝聚柱，按前述方法进行洗脱，合并和重结晶，所得高良姜素经高效液相色谱(HPLC)纯度达99％；

⑨将步骤⑦制得高良姜素主要馏分直接用甲醇进行重结晶，所得高良姜素经高效液相色谱测得纯度达99％。

实施例3

①高良姜(Alpinia officinarumHance)干燥药材用打粉机打碎成粗粉，用体积百分含量为75％乙醇提取3次，料液比为6倍，每次1小时。乙醇提取液浓缩，回收乙醇浓缩液；浓缩液加适量水，并用等体积乙酸乙酯萃取两次；乙酸乙酯层浓缩，回收乙酸乙酯浓缩液，制得高良姜素粗提物。

③采用薄层层析检测(方法同上)各洗脱馏分。按照不同高良姜素和山奈素的比例进行合并馏分，各馏分比例设计是高良姜素∶山奈素为：95∶5、90∶10、70∶30、60∶40、40∶60、30∶70、20∶80，浓缩各馏分；

⑤将高良姜素-山奈素的混合物粗品用甲醇溶解，加于葡聚糖凝聚柱(Sephadex LH-20)上端，上样体积为柱体积的7％，洗脱流速为0.8mi/min，采用甲醇进行洗脱；

⑥采用薄层层析检测(方法同上)各洗脱馏分，按照不同高良姜素和山奈素的比例进行合并馏分，最终将所有馏分分成山奈素主要，山奈素-高良姜素2∶1，山奈素-高良姜素1∶2，和高良姜素主要等4个馏分，浓缩各馏分；

⑦将⑥步骤制得馏分与步骤④制得比例类似的粗品结晶混合，其中山奈素-高良姜素2∶1与70∶30和60∶40混合，山奈素-高良姜素1∶2与40∶60和30∶70混合，山奈素主要与20∶80混合，再次上葡聚糖凝聚柱，按前述方法进行洗脱，合并和重结晶，得到纯度达99％的高良姜素。

⑧将步骤④制得高良姜素纯度比较高的粗品，即高良姜素和山奈素比例为95∶5，90∶10的两组和步骤⑥制得高良姜素主要馏分混合，用甲醇进行重结晶，所得高良姜素经高效液相色谱测得纯度达99.5％。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种高良姜素的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

d)将步骤b)中的混合粗品中高良姜素百分含量小于90％的混合粗品再经葡聚糖凝胶柱层析通过甲醇洗脱，采用薄层层析检测各洗脱馏分，分别获得山奈素、山奈素：高良姜素=2：1、山奈素：高良姜素1：2和高良姜素四种馏分；

f)将步骤d)获得经葡聚糖凝胶柱层析的山奈素：高良姜素=2：1、山奈素：高良姜素1：2两种馏分再经步骤d)进行葡聚糖凝胶柱层析后，再将获得的高良姜素馏分经步骤e)重结晶；反复重复上述操作至获得纯度达98％的高良姜素提取物。

2.根据权利要求1所述的高良素的提取方法，其特征在于：所述步骤a)的具体操作如下：取高良姜药材制成饮片或用打粉机打碎成粗粉，用5～8倍量75％乙醇提取两次，每次1小时；浓缩乙醇提取液，回收乙醇；再加入药材重量2-3倍的水，并用等体积乙酸乙酯萃取两次；浓缩乙酸乙酯层，并回收乙酸乙酯，获得高良姜素总粗提物。

3.根据权利要求1所述的高良素的提取方法，其特征在于：步骤b)的具体操作如下：将步骤a)中获得的总粗提物加入适量正相硅胶，拌样抽干，并置于硅胶柱上端，进行柱层析的分离，并采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱；采用薄层层析检测各洗脱馏分，获得不同高良姜素和山奈素配比的混合粗品，并按照相同高良姜素和山奈素配比进行合并馏分，再浓缩各馏分；优选按如下配比合并馏分：高良姜素：山奈素＝90～95∶10～5、70～80∶30～20、60～50∶40～50、30～40∶70～60、10～20∶90～80。

4.根据权利要求1所述的高良素的提取方法，其特征在于：步骤c)中经甲醇重结晶使高良姜素的纯度为达98～99.5％。

5.根据权利要求1所述的高良素的提取方法，其特征在于：步骤d)中葡聚糖凝胶抽提的上样体积为柱体积的1～10％，洗脱流速为0.8～1.0ml/min。

6.根据权利要求1所述的高良素的提取方法，其特征在于：步骤e)中经甲醇重结晶使高良姜素的纯度为达98～99.5％。