CN101002762A - 高良姜素在治疗肠易激综合症中的应用及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高良姜素在治疗肠易激综合症中的应用及其提取方法。本发明发现高良姜素具有抑制小肠推进亢进、解痉、止痛、止泻的作用，可以综合缓解肠易激综合症的各种症状，能用于制备治疗肠易激综合症的药物。本发明根据目标成分高良姜素的理化性质，采用醇提水沉法得到高良姜素的粗提取物，进一步采用大孔吸附树脂技术和葡聚糖凝胶技术分离纯化，得到纯度较高的高良姜素单体化合物，提取分离工艺简单，科学合理。
Description
技术领域
本发明涉及高良姜素，具体涉及高良姜素在治疗肠易激综合症中的应用及其提取方法。
背景技术
肠易激综合症(irritable bowel syndrome，IBS)是常见的消化系统疾病，以腹痛或腹部不适，伴有大便性状改变和排便习惯改变为特征的症候群。在西方，流行病学调查显示健康人群中的10％～20％曾罹患此病，IBS患者占消化科求诊人数的50％以上。而有文献报道，在美国因为IBS而消耗的医疗费用，每年约需要8亿美元。我国关于该病的流行率尚无确切的数据，1997年协和医院组织的一项调查结果表明，在北京地区其流行率大概在7％左右。由于其发病机制未能明确阐明，所以临床上的治疗就很难有理想的治疗药物，不同类型的IBS有不同的治疗药物，如腹泻型的IBS可用抗腹泻药、5-HT3受体拮抗剂或部分中药等，便秘型IBS可用促动力药、导泻药、CCK拮抗剂或部分中药等，腹痛型IBS可用解痉药、阿片肽受体激动剂或生长抑素及其类似物等，对于伴有中枢症状的IBS一般与抗焦虑药或抗抑郁药联用，但常用于腹泻型IBS的5-HT3受体拮抗剂(如阿洛司琼)和常用于便秘型IBS的5-HT4受体激动剂(如替加色罗)等对腹痛型IBS也有一定的疗效。在目前临床上常使用的上述药物中，没有哪一种药物对IBS治疗完全有效，也没有一种药物能够治疗IBS的所有临床类型。如美国胃肠病学会(ACG)推荐替加色罗作为治疗肠易激综合征的A级药物，但仅限于便秘型的IBS。国外公认的IBS治疗有效药物斯巴敏和匹维溴铵虽然副作用少，缓解症状短期疗效较好，但是其作用机制单一，仅为钙离子通道拮抗剂，对于发病原因和机理非常复杂的IBS而言仍然力不从心；而其他一些诸如5-HT受体和M受体拮抗剂等则因为其不良反应较多而难以在临床上广泛使用。因此目前治疗IBS还是倾向于联合用药。所以开发具有新颖作用机制、安全有效的治疗IBS新药非常必要。
高良姜素是存在于中药高良姜中的一种黄酮类化合物，高良姜是传统的温中止痛止呕中药，现代药理学研究证实，高良姜素具有调节钙离子释放、抗氧化应激、抗炎调节免疫、抗病原微生物、抑制平滑肌刺激收缩等药理作用，这与IBS发病原因的多个方面相吻合，而我们自己的动物模型实验也证实高良姜黄酮具有明显的抑制胃肠平滑肌收缩的作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有肠易激综合症治疗上存在的不足，发现高良姜素能治疗肠易激综合症，可用于制备治疗肠易激综合症的药物。
本发明的另一个目的是提供高良姜素的提取方法。
本发明的发明人经过大量的实验研究，发现高良姜素能用于治疗肠易激综合症。高良姜素可与医学上可接受的辅料制成各种剂型。
高良姜素的结构式如下所示：
上述剂型优选肠溶片、肠溶胶囊、软胶囊或滴丸制剂。
肠溶片可由高良姜素与淀粉、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁组成。其制备方法是，将高良姜素过80目筛后与淀粉按1∶2.5的比例混合，再过80目筛2次，置搅拌机中，加入适量蒸馏水，搅拌10分钟，制软材，过16目筛制粒，湿粒于60℃鼓风干燥箱中干燥，干粒过16目筛整粒。加入1％羧甲基淀粉钠及0.25％硬脂酸镁，混合均匀，压片，包肠溶衣制成。
肠溶胶囊可由高良姜素与HPMC、微粉硅胶和硬脂酸镁组成。其制备方法是，先将高良姜素与赋型剂HPMC和微粉硅胶按1∶1.5∶0.5的比例混合，制粒，干燥，再加入0.2％的润滑剂硬脂酸镁充分混合均匀，填充0号肠溶胶囊壳制成。
软胶囊制剂由高良姜素与适量植物油、3％～5％的蜂蜡及少量润湿剂组成。其制备方法是，先将高良姜素与辅料的混合物按1∶2.5的比例混合，再上扎囊机压制而成。
滴丸制剂由高良姜素与PEG4000及PEG6000混合组成。其制备方法是，先将高良姜素与PEG4000及PEG6000按1∶0.5∶2.5的比例混合，再熔融，滴入冷却剂液体石蜡中制成。
高良姜素与辅料制成的药物具有抑制小肠推进亢进、解痉、止痛、止泻的作用，可以综合缓解感肠易激综合症的各种症状。
中药材高良姜具有散寒止痛、温中止呕的作用。本发明根据目标成分高良姜素的理化性质，采用醇提水沉法得到高良姜素的粗提取物，进一步采用大孔吸附树脂技术和葡聚糖凝胶技术分离纯化，得到纯度较高的高良姜素单体化合物，具体步骤为：
(1)高良姜药材的提取：高良姜药材粉碎，过40～60目筛网，加6～10倍量60～90％乙醇，65～90℃回流0.5～2小时，趁热过滤。药渣再加3～6倍量60～90％乙醇，65～90℃回流0.5～2小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，60～80℃减压回收乙醇至含醇量为25％～45％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在60～80℃减压浓缩至溶液密度为1.0～1.3(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得高良姜粗干膏。
(2)高良姜素初步精制：高良姜粗干膏，加4～8倍量95％乙醇，50～70℃搅拌10～40分钟，趁热用200～300目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约25～45％。静置2～6小时，离心，取沉淀物，置60～70℃烘箱干燥8～12小时，得精制的高良姜黄色粉末。
(3)高良姜素进一步精制：将上述精制后高良姜黄色粉末用水溶解成浓度为0.5～1.2mg/ml的原液，以0.5～3BV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用5～10BV水以0.5～3BV/h的流速洗脱，再以40％～95％乙醇以0.5～3BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。
(4)将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为50～100mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶30～60)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.5～1.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱2～4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3～5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素，其中高良姜素的百分含量为90.0～99.9％。
在上述的醇提工艺中，介质规定浓度乙醇与被提原料的比例采用本领域的习惯做法，即规定浓度乙醇的用量单位为体积单位，被提原料的用量单位为重量单位。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明发现高良姜素具有抑制小肠推进亢进、解痉、止痛、止泻的作用，可以综合缓解感肠易激综合症的各种症状，能用于制备治疗肠易激综合症的药物。(2)本发明根据目标成分高良姜素的理化性质，采用醇提水沉法得到高良姜素的粗提取物，进一步采用大孔吸附树脂技术和葡聚糖凝胶技术分离纯化，得到纯度较高的高良姜素单体化合物，提取分离工艺简单，科学合理。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在这些实施例的范围之内。以下实施例中所述的高良姜药材，购自广州市清平药材市场。
实施例1：
取高良姜药材2000g，粉碎，过40目筛网。
取高良姜药材粉末加6倍量90％乙醇，65℃回流0.5小时，趁热过滤。药渣再加6倍量90％乙醇，65℃回流2小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，60℃减压回收乙醇至含醇量为45％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在60℃减压浓缩至溶液密度为1.2(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，50℃搅拌30分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置4小时，离心，取沉淀物，置60℃烘箱干燥10小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为0.8mg/ml的原液，以3BV/h(倍柱体积每小时)的流速上D101大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用9BV水以1BV/h的流速洗脱，再以95％乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为50mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶45)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.8BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱3倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与PEG4000及PEG6000按1∶0.5∶2.5的比例混合，再熔融，滴入冷却剂液体石蜡中即得滴丸剂。
该制剂的用量为每天3次，每次10粒，口服。
实施例2：
取高良姜药材2000g，粉碎，过60目筛网。
取高良姜药材粉末加8倍量60％乙醇，85℃回流1.5小时，趁热过滤。药渣再加6倍量60％乙醇，85℃回流0.5小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，80℃减压回收乙醇至含醇量为25％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.0(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加4倍量95％乙醇，70℃搅拌15分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置5小时，离心，取沉淀物，置65℃烘箱干燥8小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为0.5mg/ml的原液，以1BV/h(倍柱体积每小时)的流速上ADS-8大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用10BV水以1.2BV/h的流速洗脱，再以50％乙醇以2.4BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为70mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶30)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与大豆油按1∶2.5的比例混合，加入4％的蜂蜡，熔融，放冷，再加入0.25％吐温-80，上扎囊机压制而成软胶囊剂
该制剂的用量为每天2次，每次3粒，口服。
实施例3：
取高良姜药材4000g，粉碎，过50目筛网。
取高良姜药材粉末加10倍量70％乙醇，75℃回流0.5小时，趁热过滤。药渣再加6倍量70％乙醇，75℃回流2小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，75℃减压回收乙醇至含醇量为25％～45％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.0～1.3(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加5倍量95％乙醇，55℃搅拌25分钟，趁热用300目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约45％。静置6小时，离心，取沉淀物，置65℃烘箱干燥9小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.0mg/ml的原液，以2.8BV/h(倍柱体积每小时)的流速上HPD-600大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用6BV水以1.8BV/h的流速洗脱，再以70％乙醇以2.0BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为90mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶500)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.6BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱3倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素过80目筛后与150g淀粉混合，再过80目筛2次，置搅拌机中，加入蒸馏水50ml，搅拌10分钟，制软材，过16目筛制粒，湿粒于60℃鼓风干燥箱中干燥，干粒过16目筛整粒。加入1％羧甲基淀粉钠及0.25％硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，即得。
该制剂的用量为每天3次，每次2片，口服。
实施例4：
取高良姜药材3000g，粉碎，过60目筛网。
取高良姜药材粉末加7倍量80％乙醇，70℃回流1.5小时，趁热过滤。药渣再加4倍量80％乙醇，70℃回流1小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，65℃减压回收乙醇至含醇量为30％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在70℃减压浓缩至溶液密度为1.0(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加5倍量95％乙醇，70℃搅拌15分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约40％。静置2小时，离心，取沉淀物，置65℃烘箱干燥11小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为0.7mg/ml的原液，以2.2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上HPD-700大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用8BV水以1.5BV/h的流速洗脱，再以95％乙醇以1.8BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为60mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶55)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1.2BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱2倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素与赋型剂HPMC和微粉硅胶按1∶1.5∶0.5的比例混合，制粒，干燥，再加入0.2％的润滑剂硬脂酸镁充分混合均匀，填充0号肠溶胶囊壳制成。
该制剂的用量为每天2次，每次2粒，口服。
实施例5：
取高良姜药材2000g，粉碎，过40～60目筛网。
取高良姜药材粉末加9倍量85％乙醇，70℃回流0.8小时，趁热过滤。药渣再加6倍量85％乙醇，70℃回流0.5小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，65℃减压回收乙醇至含醇量为25％～45％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在70℃减压浓缩至溶液密度为1.1(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，55℃搅拌20分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约3545％。静置3小时，离心，取沉淀物，置60℃烘箱干燥8小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为0.5～1.2mg/ml的原液，以0.5～3BV/h(倍柱体积每小时)的流速上D101大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用8BV水以2BV/h的流速洗脱，再以90％乙醇以0.5BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为100mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶30)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱2倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集4.5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与PEG4000及PEG6000按1∶0.5∶2.5的比例混合，再熔融，滴入冷却剂液体石蜡中即得滴丸剂。
该制剂的用量为每天3次，每次10粒，口服。
实施例6：
取高良姜药材2000g，粉碎，过40目筛网。
取高良姜药材粉末加6倍量70％乙醇，80℃回流2小时，趁热过滤。药渣再加3倍量70％乙醇，80℃回流0.52小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，80℃减压回收乙醇至含醇量为25％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.0(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加6倍量95％乙醇，70℃搅拌40分钟，趁热用300目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置3小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥12小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.2mg/ml的原液，以0.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速上ADS-8大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用10BV水以2.5BV/h的流速洗脱，再以50％乙醇以2.5BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为60mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶35)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.7BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与大豆油按1∶2.5的比例混合，加入4％的蜂蜡，熔融，放冷，再加入0.25％吐温-80，上扎囊机压制而成软胶囊剂
该制剂的用量为每天2次，每次3粒，口服。
实施例7：
取高良姜药材4000g，粉碎，过50目筛网。
取高良姜药材粉末加8倍量75％乙醇，70℃回流1.5小时，趁热过滤。药渣再加5倍量75％乙醇，70℃回流1小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，60℃减压回收乙醇至含醇量为40％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在75℃减压浓缩至溶液密度为1.1(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，65℃搅拌40分钟，趁热用300目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置4小时，离心，取沉淀物，置65℃烘箱干燥9小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为0.7mg/ml的原液，以1.6BV/h(倍柱体积每小时)的流速上YWD04A大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用6BV水以1.8BV/h的流速洗脱，再以60％乙醇以2.7BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为80mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶45)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以0.9BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱2倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集4倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素过80目筛后与150g淀粉混合，再过80目筛2次，置搅拌机中，加入蒸馏水50ml，搅拌10分钟，制软材，过16目筛制粒，湿粒于60℃鼓风干燥箱中干燥，干粒过16目筛整粒。加入1％羧甲基淀粉钠及0.25％硬脂酸镁，混合均匀，压片，包肠溶衣，即得。(肠溶衣液处方为：CAP10.0g，十八醇4.0g，苯二甲酸二乙酯1.0ml，异丙醇40.0ml，丙酮45.0ml。)
该制剂的用量为每天3次，每次2片，口服。
实施例8：
取高良姜药材4000g，粉碎，过40目筛网。
取高良姜药材粉末加10倍量85％乙醇，75℃回流1.8小时，趁热过滤。药渣再加6倍量85％乙醇，75℃回流0.6小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，60℃减压回收乙醇至含醇量为35％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.3(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，65℃搅拌20分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置4小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥8小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.0mg/ml的原液，以2.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速上ADS-8大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用7BV水以2.5BV/h的流速洗脱，再以75％乙醇以2.0BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为90mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶40)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1.3BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱2倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素与赋型剂HPMC和微粉硅胶按1∶1.5∶0.5的比例混合，制粒，干燥，再加入0.2％的润滑剂硬脂酸镁充分混合均匀，填充0号肠溶胶囊壳制成。
该制剂的用量为每天2次，每次2粒，口服。
实施例9：
取高良姜药材2000g，粉碎，过60目筛网。
取高良姜药材粉末加9倍量70％乙醇，85℃回流2小时，趁热过滤。药渣再加3倍量70％乙醇，85℃回流0.8小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，75℃减压回收乙醇至含醇量为40％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在75℃减压浓缩至溶液密度为1.2(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，55℃搅拌35分钟，趁热用300目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置6小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥9小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.1mg/ml的原液，以1.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速上HPD-600大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用10BV水以0.5BV/h的流速洗脱，再以80％乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与PEG4000及PEG6000按1∶0.5∶2.5的比例混合，再熔融，滴入冷却剂液体石蜡中即得滴丸剂。
该制剂的用量为每天3次，每次10粒，口服。
实施例10：
取高良姜药材2000g，粉碎，过50目筛网。
取高良姜药材粉末加7倍量65％乙醇，85℃回流2小时，趁热过滤。药渣再加4倍量605％乙醇，85℃回流1小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，75℃减压回收乙醇至含醇量为35％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.3(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加7倍量95％乙醇，70℃搅拌20分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约25％。静置3小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥9小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.0mg/ml的原液，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上D101大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用10BV水以3BV/h的流速洗脱，再以45％乙醇以2.6BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为70mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶55)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1.1BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述所得高良姜素与大豆油按1∶2.5的比例混合，加入4％的蜂蜡，熔融，放冷，再加入0.25％吐温-80，上扎囊机压制而成软胶囊剂
该制剂的用量为每天2次，每次3粒，口服。
实施例11：
取高良姜药材4000g，粉碎，过40目筛网。
取高良姜药材粉末加8倍量70％乙醇，80℃回流1.5小时，趁热过滤。药渣再加3倍量70％乙醇，80℃回流1小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，75℃减压回收乙醇至含醇量为25％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在80℃减压浓缩至溶液密度为1.0(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加6倍量95％乙醇，65℃搅拌40分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约40％。静置5小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥11小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.2mg/ml的原液，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上HPD-600大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用7BV水以2.4BV/h的流速洗脱，再以80％乙醇以2.7BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为90mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶60)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1.4BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱3倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素过80目筛后与150g淀粉混合，再过80目筛2次，置搅拌机中，加入蒸馏水50ml，搅拌10分钟，制软材，过16目筛制粒，湿粒于60℃鼓风干燥箱中干燥，干粒过16目筛整粒。加入1％羧甲基淀粉钠及0.25％硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，即得。
该制剂的用量为每天3次，每次2片，口服。
实施例12：
取高良姜药材4000g，粉碎，过60目筛网。
取高良姜药材粉末加6倍量90％乙醇，80℃回流1小时，趁热过滤。药渣再加5倍量90％乙醇，80℃回流1小时，趁热过滤。合并两次乙醇提取液，60℃减压回收乙醇至含醇量为40％，室温放置两天，离心，收集沉淀。溶液进一步在60℃减压浓缩至溶液密度为1.1(70℃)，合并于之前收集的沉淀。搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层。离心，收集沉淀，干燥得粗黄酮干膏；高良姜粗干膏，加4倍量95％乙醇，50℃搅拌35分钟，趁热用200目滤布过滤，过滤残渣弃去。滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至大约30％。静置2小时，离心，取沉淀物，置70℃烘箱干燥11小时，得精制的高良姜黄色粉末；将上述精制后的粉末用水溶解成浓度为1.2mg/ml的原液，以3BV/h(倍柱体积每小时)的流速上ADS-8大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用7BV水以0.5BV/h的流速洗脱，再以75％乙醇以2.2BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥，即得粗高良姜素。将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为100mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱(样品与吸附剂的质量比为1∶50)，用氯仿-甲醇(3∶7)的混合溶剂以1.5BV/h(倍柱体积每小时)的流速洗脱，先洗脱4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
将上述高良姜素与赋型剂HPMC和微粉硅胶按1∶1.5∶0.5的比例混合，制粒，干燥，再加入0.2％的润滑剂硬脂酸镁充分混合均匀，填充0号肠溶胶囊壳制成。
该制剂的用量为每天2次，每次2粒，口服。
实验一：高良姜素对正常小鼠小肠推进运动的影响(炭末法)
取NIH小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，随机分成5组，即空白对照组、腹可安阳性组、高良姜素(纯度＞90％)低、中、高剂量组。然后每组灌胃给予相应的药物，空白对照组给予等容积的0.5％CMC-Na，每天1次，给药容积为20ml/kg，连续5天，于第5天给药前禁食18小时，给药后1小时每组给5％活性炭混悬液(10％阿拉伯胶配制)灌胃0.5ml/只，20分钟手脱椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门到回盲部小肠，不加牵引地平铺于玻璃平板上，测其全长及幽门至炭末前沿距离，计算其与全长的百分率，即推进百分率，结果见表1。
结果表明：高良姜素中、高剂量对正常小鼠小肠运动有明显的抑制作用，可明显降低推进距离和推进率(中剂量P＜0.05，高剂量P＜0.01＝。良姜黄酮片低、中剂量对正常小鼠小肠推进运动无明显影响。腹可安亦能明显的抑制正常小鼠小肠运动，可明显降低推进距离和推进率(P＜0.05)。
表1.高良姜素对正常小鼠小肠推进运动的影响(
)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 推进百分率(％) |
| 空白对照腹可安高良姜素高良姜素高良姜素 | -1g204080 | 1212121212 | 71.2±7.661.3±8.3*67.2±10.162.7±7.1*58.1±7.0** |
与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。
实验二：高良姜素对新斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响
取健康小鼠72只，称重标记后随机分为6组：正常对照组、空白模型组、阿托品组、高良姜素低、中、高剂量组，每组12只，0.1mL/10灌服；正常对照组、空白模型组、阿托品组灌服等体积生理盐水，每日1次，连续3日，实验前各组动物禁食不禁水24h，末次给药1h后，各组小鼠皮下注射新斯的明0.12mg/kg，阿托品组再予以阿托品0.1mg/kg腹腔注射。各组在5Min后灌服炭末混悬液(阿拉伯胶10％，活性炭5％)，0.2mL/只，20min后脱颈椎处死，剖腹取上端自幽门、下端至回肓部的肠管，铺直后测量幽门至回盲部全长(小肠总长度)及幽门至炭末前沿的距离(炭末推进长度)，计算小肠推进百分率，结果见表2。
表2.高良姜素对新斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 推进百分率(％) |
| 正常对照空白模型阿托品组高良姜素高良姜素高良姜素 | --0.1204080 | 121212121212 | 57.2±6.582.49±8.2**64.78±6.9*△△75.2±9.1**△68.7±7.1**△△65.8±6.7*△△ |
与正常对照组比较：*P＜0.05，料P＜0.01；与空白模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。
结果表明：小鼠在注射新斯的明后，其小肠推进率有明显的升高(P＜0.05)，给以高良姜素后，各剂量组小肠推进率均有明显下降(小剂量组P＜0.05，大中剂量组P＜0.01)，与阿托品药效近似。
实验三：高良姜素对小鼠致泻实验的影响
取健康小鼠75只，随机分为5组：空白模型组、补中益气汤组、高良姜素低、中、高剂量组，每组15只。高良姜素组灌胃，低、中、高剂量，补中益气汤组灌胃补中益气汤9.23g/kg，空白模型组灌胃等量生理盐水。以上各组均按0.1mL/10g灌胃。每日1次，连续3日。末次给药1h后给予番泻叶浸出液0.4g/20g灌胃。小鼠单笼观察，笼下铺置吸水滤纸作湿粪计数，以湿粪数多少表示腹泻程度：给予番泻叶后观察各组4h内湿粪总数。
表3.高良姜素对小鼠致泻实验的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 湿粪数 |
| 空白模型组补中益气组高良姜素高良姜素高良姜素 | -9.23g/kg204080 | 1515151515 | 8.89±2.016.16±1.79**7.32±2.596.42±2.15*5.06±1.90** |
与空白模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明：大中剂量组高良姜素给药后，模型小鼠湿粪数具有明显下降(中剂量组P＜0.05，大剂量组P＜0.01)，大剂量组与补中益气组降低湿粪能力相近。
实验四：高良姜素对肠道高敏感性肠易激综合征大鼠模型疗效观察
实验材料及方法：清洁级新生SD大鼠72只，雌雄各半，体重(11±2)g，年龄8d，随机分为6组：空白对照组、模型对照组、西药(匹维溴铵)组、高良姜素低剂量组、中剂量组和高剂量组。从第6周开始给药。空白对照组和模型对照组以生理盐水按10mL/kg ig，西药组以匹维溴铵按15mg/kg ig，均连续给药28d，每天1次。给药期间，停止造模。模型组采用醋酸结肠慢性刺激法造成肠道高敏感性的IBS大鼠模型。对照组同法给予等量0.9％的生理盐水，作为对照。共持续3周。从第4周开始的2周内，停止造模，不进行任何实验操作。分别在造模后的第10周对实验大鼠进行肠道分别在造模后的第10周对实验大鼠进行肠道敏感性评估：①评估大鼠的腹部回缩反射；②记录腹壁肌电活动评估肠道敏感性。均按文献方法进行。
观察指标：(1)容量阈值给药4周(造模后第10周)后以直肠内球囊扩张时腹部回缩反射和背部拱起作为标准，记录容量阈值。(2)腹壁肌电活动给药4周(造模后第10周)后以电生理仪记录直肠内球囊在不同容量下每次持续5Min期间腹壁收缩次数。(3)血清5-HT、血浆SP、CGRP含量测定给药4周(造模后第10周)后进行。血清5-HT含量用荧光分光光度计法测定。血浆SP含量用放免法测定。按放免试剂盒操作说明书进行。(4)统计学处理结果用均数±标准差表示，组间变量比较用t检验。
结果：1、行为测试结果，见下表4。
表4.各组引起大鼠腹部抬起和背部拱起的扩张容量阈值(ml，
，n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 腹部抬起 | 背部拱起 |
| 正常对照空白模型匹维溴铵组高良姜素高良姜素高良姜素 | --15204080 | 1.752±0.101**1.003±0.0321.601±0.115**1.398±0.098**1.598±0.103**1.625±0.085** | 0.976±0.023**0.479±0.1220.736±0.152**0.604±0.147*0.741±0.093**0.867±0.110** |
| △ | |||
与空白模型组比较：*P＜0.05，料P＜0.01：与匹维溴铵组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。
用药后，高良姜素各剂量组腹部抬起和背部拱起阈值较模型组有明显升高。中剂量组和大剂量组与匹维溴铵组相近。
2、腹壁肌电活动记录结果，见下表5。
表5.不同扩张容量下各组大鼠腹壁肌肉收缩次数(次/5min，
，n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | Times | |
| 1.0ml | 1.5ml | ||
| 正常对照空白模型匹维溴铵组高良姜素高良姜素高良姜素 | --15204080 | 7.78±1.13**12.25±1.328.03±1.15**10.28±1.30**△△8.15±1.26**7.37±1.20** | 12.56±1.23**18.43±1.4112.72±1.55**15.69±1.42**△△12.85±1.48**12.41±1.34** |
与空白模型组比较：*P＜0.05，料P＜0.01；与匹维溴铵组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。
结果显示，用药后，高良姜素各组与模型组比较差异非常显著，大中剂量组与匹维溴铵组比较差异无显著性。
3、血清5-HT含量测定结果，见下表6。
表6.各组血清5-HT含量(ng/mL，
，n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 5-HT含量 |
| 正常对照空白模型匹维溴铵组高良姜素高良姜素高良姜素 | --15204080 | 121.13±5.98**269.18±6.03130.98±7.32**176.39±8.52**△△134.69±7.88**124.95±5.12**△ |
与空白模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与匹维溴铵组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。
结果显示，用药后各处理组较模型组5-HT含量明显下降，差异显著，其中高良姜素大剂量组与正常对照组比较无明显差异与匹维溴铵组比较差异显著(P＜0.05)。
4、血浆SP含量测定结果，见下表7。
表7.各组血清SP含量(pg/mL，
，n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | SP含量 |
| 正常对照空白模型匹维溴铵组高良姜素高良姜素高良姜素 | --15204080 | 41.12±5.21**68.25±3.2562.57±4.03**60.58±5.33**57.46±4.98△**48.55±5.66△△** |
与空白模型组比较：*P＜0.05，料P＜0.01；与匹维溴铵组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。
用药后，处理组较模型组SP水平都有明显降低，其中以高良姜素中、大剂量组降低尤其明显，与匹维溴铵相比也有显著性差异。
Claims (4)
1、一种高良姜素的提取方法，其特征在于从中药高良姜中经提取分离得到，步骤为：
(1)将高良姜药材粉碎，过40～60目筛网，加6～10倍量60～90％乙醇，65～90℃回流0.5～2小时，趁热过滤；药渣再加3～6倍量60～90％乙醇，65～90℃回流0.5～2小时，趁热过滤；合并两次乙醇提取液，60～80℃减压回收乙醇至含醇量为25％～45％，室温放置，离心，收集沉淀；溶液进一步在60～80℃减压浓缩至溶液密度为1.0～1.3，合并于之前收集的沉淀；搅拌均匀，室温放置至溶液明显分层，离心，收集沉淀，干燥得高良姜粗干膏；
(2)高良姜粗干膏，加4～8倍量95％乙醇，50～70℃搅拌10～40分钟，趁热用200～300目滤布过滤，过滤残渣弃去；滤液缓慢加水，不断搅拌，最终使乙醇含量降至25～45％；静置2～6小时，离心，取沉淀物，置60～70℃烘箱干燥8～12小时，得精制的高良姜黄色粉末；
(3)将上述精制后的高良姜黄色粉末用水溶解成浓度为0.5～1.2mg/ml的原液，以0.5～3BV/h的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用5～10BV水以0.5～3BV/h的流速洗脱，再以40％～95％乙醇以0.5～3BV/h的流速洗脱，收集规定浓度乙醇洗脱液，浓缩，于真空干燥箱内干燥即得粗高良姜素；
(4)将粗高良姜素用甲醇溶解成浓度为50～100mg/ml的原液，上葡聚糖凝胶Sephedax LH-20柱，样品与吸附剂的质量比为1∶30～60，用体积比氯仿∶甲醇＝3∶7的混合溶剂以0.5～1.5BV/h的流速洗脱，先洗脱2～4倍柱体积的溶剂并弃去，然后正式收集洗脱液，共收集3～5倍柱体积的洗脱液，合并，减压回收溶剂至干，即得高良姜素。
2、高良姜素在制备治疗肠易激综合症的药物中的应用。
3、如权利要求2所述的应用，其特征在于，高良姜素可与医学上可接受的辅料制成各种剂型。
4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述剂型为肠溶片、肠溶胶囊、软胶囊或滴丸制剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |