CN102805762A - 五味子多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种五味子多糖提取物及其制备方法和应用。以D-葡萄糖计，多糖含量不低于多糖提取物总重量的45％，单糖组成主要为D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸，其中D-葡萄糖与D-半乳糖的质量比为3～9∶1，D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的5～40％。通过小鼠耳异种被动皮肤过敏试验、大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒实验证明，本发明的五味子多糖提取物具有显著的抗变态反应活性，可用于制备抗变态反应药物、功能性食品及化妆品。

Description

五味子多糖提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及一种植物提取物，具体涉及一种五味子多糖提取物及其制备方法和应用，特别是涉及所述五味子多糖提取物在制备抗变态反应药物、功能性食品及化妆品中的应用。 

背景技术

变态反应又称超敏反应，是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的特异性免疫应答。正常的免疫反应，对异体物质产生排斥，使机体得到保护，而变态反应，则是机体对这类抗原物质的过强反应，它导致组织损伤，产生轻重不等的危害。 

常见的变态反应疾病：主要有变应性鼻炎(常年性变应性鼻炎和季节性变应性鼻炎)、支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、过敏性紫癜、药物过敏、食物过敏、过敏性休克等。 

近年来，由于人们生活方式的变化，以及生态环境的破坏等，变态反应性疾病的发病率在全球范围迅速增加，尤其是在发达国家与地区。据世界卫生组织(WHO)估计，全球约有1亿5千万人患有哮喘，其中50％以上的成人及至少80％的儿童，患者均由过敏因素诱发，每年约有18万人死于哮喘。食物过敏、湿疹和药物过敏的患病率近年也明显升高，美国有300万人对花生和坚果过敏，6岁以下儿童食物过敏的患病率为4％，成人为1％～2％。美国每年因变态反应性疾病要花掉医疗保障体系近180亿美元的费用。国内流行病学调查显示，目前我国变态反应性疾病的发病率也高达37.3％，其中患过变应性鼻炎的病人已达1％～2％，最高可达4％，过敏性皮肤病的发病率在3％以内。 

传统医学界对变态反应性没有很好的根治手段，西医治疗的药物主要有抗组胺药、激素，还有过敏反应介质阻释剂等。这些药物普遍副作用较大，停药易发，特别对婴幼儿、儿童、青少年的发育有极大的影响。 

天然来源的植物药，特别是中药，相对化学药物来说，安全性高，副作用小，往往作用于多个环节，具有显著的疗效，因而越来越受到国内外医学界的关注。但从单味中药里分离出来的具有预防和治疗变态反应性疾病的成分清楚、含量明确的有效部位，很少见到报导。 

中药五味子是木兰科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实，习称北五味子，是药食同源的常用滋补性中药，临床应用广泛。五味子酯溶性部位中的联苯烯类木脂素是目前公认的主要生物活性成分，临床主要用于治疗慢性肝炎。五味子的水溶性部位主要为多糖，研究表明具有多种生理活性。但关于五味子多糖的抗变态反应活性目前还未有公开的文献或专利报道。 

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种从药食同源的单味中药五味子提取制备的有效部位--具有显著抗变态反应活性的五味子多糖提取物，使用安全，无副作用之忧。并且本发明还首次阐明所述五味子多糖提取物具有显著的抗变态反应活性，可用于制备预防和治疗变态反应性疾病的药物，以及功能性食品和化妆品，具有显著的优越性。 

本发明的另一目的是提供一种所述五味子多糖提取物的制备方法。 

本发明的又一目的是提供所述五味子多糖提取物的应用，特别是提供所述五味子多糖提取物在制备抗变态反应药物、功能性食品及化妆品中的应用。 

本发明是采用以下技术方案来实现上述目的的。 

本发明所述的具有显著抗变态反应活性的五味子多糖提取物，以D-葡萄糖计，多糖含量不低于多糖提取物总重量的45％；单糖组成主要为D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸；其中，D-葡萄糖与D-半乳糖的质量比为3～9∶1，D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的5～40％。 

所述五味子多糖提取物的制备方法，包括以下步骤： 

(1)取五味子药材，粉碎成最粗粉或粗粉，加入五味子粉重量6～10倍的65～95％(v/v)乙醇，回流提取1～3次，每次1～3小时，提取结束降至室温后，过滤；滤液可用于本发明以外的用途； 

(2)药渣加入药材重量6～10倍量的水，回流提取1～3次，每次1～3小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于生 药量0.3～0.5g； 

(3)上述浓缩液离心，弃去沉淀，溶液进一步减压浓缩至相对密度1.12～1.18/60℃，加95％(v/v)乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为70％～90％(v/v)，静置，离心或过滤得沉淀，沉淀用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤后，得到多糖提取物粗品； 

(4)多糖提取物粗品经以下两种方法中的任一种进行净化： 

A)多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1～5wt％的水溶液，用透析膜(截留分子量Da 10000)在纯水中透析24～72小时，或者用截留分子量Da 10000的超滤膜进行超滤，去除盐等小分子，溶液再经后处理得净化后的五味子多糖提取物。 

B)多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1～5wt％的水溶液，冰浴下每100ml加入2～8g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在纯水中透析24～72小时，或者用截留分子量Da 10000的超滤膜进行超滤，溶液再经后处理得净化后的五味子多糖提取物。 

上述两种净化方法中所述的后处理，可以采用下面4种方法中的任一种： 

a)将溶液直接冷冻干燥得到五味子多糖提取物； 

b)将溶液减压浓缩至比重1.2～1.5(60℃)后，真空干燥，得到五味子多糖提取物。 

c)将溶液减压浓缩至比重1.1～1.3(60℃)后，喷雾干燥，得到五味子多糖提取物。 

d)将溶液浓缩至相对于粗品重量的2～4倍后加95％(v/v)乙醇，使醇含量为70％～90％(v/v)，静置，离心或过滤得到沉淀，将沉淀于30～50℃鼓风干燥得到五味子多糖提取物。 

其中，本发明制备方法的步骤(1)主要考虑到五味子药材的综合用途，本发明的制备方法也可以从第(2)步直接开始，即五味子药材，粉碎成最粗粉或粗粉后，直接加水回流提取，进行以后的步骤。 

本发明以中药五味子为原料，经粉碎、先醇提去酯溶性成分后再水提(或直接水提)、醇沉，透析或超滤(或脱蛋白后再透析或超滤)，干燥，即制得所述五味子多糖提取物。其中，五味子多糖提取物的含量，是以D-葡萄糖为标准品，按照分光光度法(2010年版中国药典一部附录VA)、苯酚-硫酸法测定，证明其多糖含量不低于多糖提取物总重量的45％；其单糖组成中， D-葡萄糖与D-半乳糖质量比的测定，是采用D-葡萄糖与D-半乳糖的还原氢化乙酰化产物为标准品，照气相色谱面积归一化法(2010年版中国药典一部附录VI E)测定，证明其峰面积比为3～9∶1；D-半乳糖醛酸含量的测定，是以D-半乳糖醛酸为标准品，采用分光光度法(2010年版中国药典一部附录VA)、间羟联苯法测定，证明D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的5～40％。 

经动物试验(小鼠耳异种被动皮肤过敏试验、大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒试验，参看实施例10和实施例11，试验所选的阳性对照药物为酮替芬，酮替芬是常用的抗变态反应药物，属抗组胺药，也是肥大细胞稳定剂，但有明显的副作用)验证，模型结果可靠。试验结果显示，本发明的五味子多糖提取物具有显著的抗变态反应活性，可用于制备预防和治疗变态反应疾病的药物或者功能性食品及化妆品。其可以以原型、水溶液稀释等形式，通过与载体材料结合制成一定制剂，如片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂、口服液、注射剂、混悬剂、乳剂、软膏剂、贴剂、霜剂、喷雾剂、擦剂或洗剂等，供药品、功能性食品和化妆品市场的消费。可根据各制剂的需要加入适当辅料。 

附图说明

图1是实施例8的单糖组成标准品的气相色谱图。图中依次是D-鼠李糖(15.111min)、L-岩藻糖(15.544min)、D-木糖(16.738min)、D-甘露糖(29.703min)、D-葡萄糖(30.519min)、D-半乳糖(31.170min)、D-氨基葡萄糖(36.532min)和D-氨基半乳糖(37.409min)的乙酰化衍生物。 

图2是实施例8的五味子多糖单糖组成的气相色谱图。主要的两个峰是D-葡萄糖(30.519min)和D-半乳糖(31.170min)。 

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或等同替换，但这些修改或替换均落入本发明保护范围内。 

实施例1  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材2kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量8倍的80％乙醇， 回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤；药渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于生药量0.4g；浓缩液离心，溶液进一步减压浓缩至相对密度1.15/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为80％，静置，离心得到沉淀，沉淀分别用2倍重量的无水乙醇、丙酮洗涤后，得到多糖提取物粗品176克；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1％的水溶液，用透析膜(截留分子量Da 10000)在纯水中透析48小时，去除小分子，冷冻干燥得到五味子多糖提取物126克。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例2  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材2kg，粉碎成粗粉，加入五味子粉重量8倍的80％乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，提取结束降至室温后，过滤；药渣加入重量9倍的水，回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于含生药0.4g；浓缩液离心，进一步减压浓缩至相对密度1.15/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为85％，静置，离心得到沉淀，沉淀分别用2倍重量的无水乙醇、丙酮洗涤后，得到多糖提取物粗品180克；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1％的水溶液，冰浴下每100ml加入4g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在纯水中透析48小时，将溶液浓缩至相对于粗品重量的4倍后加95％乙醇，使醇含量为80％，静置，离心或过滤得到沉淀，将沉淀于40℃鼓风干燥，得到五味子多糖提取物106克。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例3  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材4kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量10倍的65％乙醇，回流提取3小时，提取结束降至室温后，过滤；药渣加入重量6倍的水，回流提取3次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于生药量0.4g；浓缩液离心，溶液进一步减压浓缩至相 对密度1.16/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为75％，静置，离心得到沉淀，沉淀分别用2倍重量的无水乙醇、丙酮洗涤后，得到多糖提取物粗品448克；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成2％的水溶液，以截留分子量Da 10000的超滤膜，超滤，再将溶液减压浓缩至比重1.30(60℃)后，真空干燥，得到五味子多糖提取物301克。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例4  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材5kg，粉碎成粗粉，加入五味子粉重量8倍的95％乙醇，回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤；药渣加入重量10倍的水，回流提取3小时，提取结束降至室温后，过滤，将水提取液减压浓缩至每ml相当于含生药0.4g；浓缩液离心，进一步减压浓缩至相对密度1.14/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为80％，静置，离心得到沉淀，沉淀分别用2倍重量的无水乙醇、丙酮洗涤后，得到多糖提取物粗品402克；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成2％的水溶液，冰浴下每100ml加入3.5g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在纯水中透析48小时，将溶液减压浓缩至比重1.21(60℃)后，喷雾干燥，得到五味子多糖提取物262克。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例5  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材5kg，粉碎成最粗粉，药渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤，合并提取液，减压浓缩至每ml相当于含生药0.4g；浓缩液离心，进一步减压浓缩至相对密度1.14/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为85％，静置，离心得到得到多糖提取物粗品464克；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成3％的水溶液，冰浴下每100ml加入4g三氯乙酸，以截留分子量Da 10000的超滤膜，超滤，再将溶液冷冻干燥，得到五味子多糖提取物258克。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和 治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例6  五味子多糖提取物的制备 

取五味子药材20kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量8倍的80％乙醇，回流提取2次，每次2小时，提取结束后降温至室温，过滤；药渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于含生药0.4g；浓缩液离心，进一步减压浓缩至相对密度1.15/60℃，加95％乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为80％，静置，离心得到沉淀，沉淀分别用2倍重量的无水乙醇、丙酮洗涤后，得到多糖提取物粗品1.79kg；多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1％的水溶液，以截留分子量Da 10000的超滤膜，超滤，再将溶液浓缩至相对于粗品重量的2.5倍后加95％乙醇，使醇含量为80％，静置，离心或过滤得到沉淀，将沉淀于45℃鼓风干燥，得到五味子多糖提取物1.27kg。然后将该五味子多糖提取物以原型、水溶液稀释等形式，或通过与载体材料结合，制备成为预防和治疗变态反应疾病的药物或功能性食品，或化妆品。 

实施例7 

五味子多糖提取物含量测定 

1)试剂与仪器： 

苯酚，浓硫酸，乙醇，分析纯；D-葡萄糖，购自中国药品生物制品检定所；比色计，UV-2401PC型，日本岛沣公司生产。 

2)对照品溶液的制备 

精密称取D-葡萄糖对照品适量，加蒸馏水制成每1ml含40μg的溶液。 

3)供试品溶液的制备 

精密称取五味子多糖提取物0.25g，至250ml量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，精密量取5.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 

4)标准曲线制备 

分别吸取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，各以水补至2ml，分别加入6％苯酚溶液1ml，摇匀，缓慢滴加浓硫酸4ml盖好塞子，迅速摇匀，室温放置30分钟，以蒸馏水作为空白对照，在波长488nm处测定吸光度，绘制标准曲线。 

5)测定 

精密吸取供试品溶液1ml，按上述操作，测定吸光度，计算各实施例多糖提取物中多糖的含量。其中，实施例1所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为50.1％；实施例2所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为68.1％；实施例3所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为51.3％；实施例4所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为66.5％；实施例5所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为67.0％；实施例6所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量为50.4％。 

实施例8 

五味子多糖提取物中多糖的单糖组成实验 

1)仪器和试剂 

Agilent 6890气相色谱仪，HP-5(30m×0.32mm×0.5μm)色谱柱。 

乙醇、乙腈、氯仿、乙酸酐、无水硫酸钠、三氯乙酸、三氟乙酸、4-甲基吗啡啉硼烷均为分析纯。 

2)对照品 

D-鼠李糖、L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-氨基葡萄糖和D-氨基半乳糖对照品由上海中医药大学中药研究所赠送。 

3)对照品溶液的制备 

精密称定各单糖对照品1.0mg，至10ml圆底烧瓶中，加80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷50μl，3mol/L三氟乙酸200μl，摇匀；80℃油浴5分钟；加入80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷50μl，摇匀，120℃油浴1小时，冷却至室温，再加入80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷100μl；50℃浓缩蒸干，加入2ml乙腈蒸干，重复3次，完全带除水分；加入乙酸酐100μl，三氟乙酸100μl；50℃水浴10分钟；加入3ml冰水，摇匀；用氯仿萃取乙酰化产物三次，每次3ml；合并萃取液，浓缩，无水硫酸钠干燥，氯仿定容至2ml，作为对照品溶液。 

4)供试品溶液的制备 

精密称定实施例2所制得的五味子多糖提取物1.0mg，至10ml圆底烧瓶中，加80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷50μl，3mol/L三氟乙酸200μl，摇匀；80℃油浴5分钟；加入80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷50μl，摇匀，120℃油浴1小时，冷却至室温，再加入80mg/ml 4-甲基吗啡啉硼烷100μl；50℃浓缩蒸干， 加入2ml乙腈蒸干，重复3次，完全带除水分；加入乙酸酐100μl，三氟乙酸100μl；50℃水浴10分钟；加入3ml冰水，摇匀；用氯仿萃取乙酰化产物三次，每次3ml；合并萃取液，浓缩，无水硫酸钠干燥，氯仿定容至2ml，作为供试品溶液。 

5)气相色谱条件 

采用HP-5(30m×0.32mm×0.5μm)色谱柱，进样器温度280℃，检测器(FID)温度310℃。采用程序升温：130℃恒温5min，2℃/min升温至180℃，恒温5min，10℃/min升温至310℃。载气为高纯氮，流速1.0ml/min，进样量1.0μl，分流比30∶1。 

6)测定 

采用气相色谱法分别测定各对照品与供样试品溶液，通过保留时间的比较可知，五味子多糖提取物中多糖的单糖组成(除糖醛酸外)主要为D-葡萄糖和D-半乳糖，通过面积归一化法可知，D-葡萄糖与D-半乳糖的峰面积比例为5.67∶1，见图1和图2(注：糖醛酸类，用此方法测不出，需另测)。 

采用同样方法测定其他实施例五味子多糖提取物中多糖的单糖组成，测得D-葡萄糖与D-半乳糖的峰面积比例在3～9∶1间。 

实施例9  五味子多糖提取物中D-半乳糖醛酸含量测定 

1)试剂与仪器 

间羟苯酚，氢氧化钠，四硼酸钠，浓硫酸，分析纯；D-半乳糖醛酸，购自中国药品生物制品检定所；比色计，UV-2401PC型，日本岛沣公司生产。 

2)对照品溶液的制备 

精密称取D-半乳糖醛酸对照品适量，加蒸馏水制成每1ml含60μg溶液。 

3)供试品溶液的制备 

精密称定五味子多糖提取物0.25g，至250ml量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，精密量取5.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 

4)标准曲线制备 

分别吸取对照品溶液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml于具塞试管中，各以水补至0.25ml。在冰浴中预冷后加入0.0125mol/L四硼酸钠浓硫酸试液1.5ml，振摇混合，在沸腾水浴中加入5分钟。以冰浴冷却至室温后，以微量加液器加入0.15％间羟联苯试液(0.5％氢氧化钠配制)25μL。摇匀后， 在520nm处测定光吸收，以“0.00”管作空白对照，绘制标准曲线。 

5)测定法 

精密吸取供试品溶液1ml，按上述操作，测定吸光度。实施例2所制得五味子多糖提取物中D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的21.41％。 

采用同样方法测定其他实施例五味子多糖提取物中多糖的D-半乳糖醛酸的含量，测得五味子多糖提取物中D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的5～40％。 

实施例10  小鼠耳异种被动皮肤过敏试验 

1)实验原理 

将致敏大鼠的血清(内含丰富IgE抗体)皮内注射于正常小鼠的耳廓，使之被动致敏。当抗原攻击时，耳廓局部血管通透性增加，注入伊文思蓝，可渗入耳廓中，按渗入伊文思蓝量的多少，反映皮肤过敏程度。 

2)实验动物 

Balb/C小鼠，18～22g，40只，雌雄各半。 

Wistar大鼠，90～100g，8只，雌雄各半。 

饲养条件：室温20℃～23℃，相对湿度45％～65％，14h光照/10h黑暗循环(光照时间6:30～20:30)，自由给水给食，购买后在SPF级动物房饲养2日后开始实验。 

3)大鼠抗血清的制备 

对大鼠每足跖注射卵白蛋白0.1ml，同时腹腔注射氢氧化铝凝胶0.4ml，隔天致敏一次，共三次，于末次致敏14天后采血，收集血清，于-20℃保存备用。 

4)小鼠被动过敏试验 

Balb/C小鼠随机分为5组，每组8只，分别为空白组、模型组、阳性对照组(酮替芬)、样品A组和样品B组。空白组注射生理盐水七天。模型组注射生理盐水七天，于第五天两只耳廓各注射大鼠抗血清20μl，后续同样品组。阳性对照组于抗原攻击前半小时注射酮替芬(5mg/kg)，其余同模型组。样品A组(实施例1所制得的五味子多糖提取物，用蒸馏水溶解，灌胃给药，剂量：150mg/kg，每日1次，每次0.2ml)、样品B组(实施例2所制得的五味子多糖提取物，用蒸馏水溶解，灌胃给药，剂量：150mg/kg，每日1次， 每次0.2ml)给药7天，于第五天时，小鼠两只耳廓各注射大鼠抗血清20μl，48小时后进行抗原攻击，尾静脉注射0.5％伊文斯蓝溶液(含卵白蛋白0.25mg)0.25ml，30min后将小鼠脱臼处死，剪下耳廓，两只耳廓置于试管内，加入1mol/L氢氧化钾溶液0.75ml，37℃过夜消化，次日加入3.5mL，0.6mol/L磷酸溶液和丙酮混合液(按5∶13比例混合)，经涡旋器震摇提取，再离心(2500rpm，15min)，上清液以640nm测定光密度，结果见表1。 

5)实验结果 

与模型对照组相比，样品A组、样品B组对小鼠耳异种皮肤过敏反应都有显著的抑制作用，表明本发明的五味子多糖提取物有显著的抗变态反应活性。 

表1 小鼠被动皮肤过敏试验结果 

组别	剂量(g/kg)	耳提液光密度平均值	抑制率(％)
				空白组	等体积生理盐水	0.03853±0.0154	-
模型组	等体积生理盐水	0.2226±0.0234**	-
				阳性对照药	5mg/kg	0.1106±0.0353ΔΔ	60.84
样品A组	150mg/kg	0.1221±0.0325ΔΔ	54.58
				样品B组	150mg/kg	0.1639±0.0339ΔΔ	31.89

^**p＜0.01vs正常组；^ΔΔp＜0.01vs模型组 

实施例11  大鼠主动腹腔肥大细胞脱颗粒试验 

1)实验材料 

SD大鼠30只，雄性，体重200克左右。 

氢氧化铝凝胶(sigma)、中性红(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20100521)、卵白蛋白(sigma)、肝素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20091029)、D-Hanks液(吉诺生物科技有限公司)、酮替芬(中国药品生物制品检定所，100230-200602)。 

2)空白血清及药物血清的制备 

雄性SD大鼠，随机分为4组，即：空白血清组、样品A药物血清组(样品A为实施例1所制得的五味子多糖提取物，用蒸馏水溶解，灌胃给药，150mg/kg)、样品B药物血清组(样品B为实施例2所制得的五味子多糖提 取物，用蒸馏水溶解，灌胃给药，150mg/kg)、阳性药血清组，每组3只。样品A和B药物血清组每次灌胃给药3ml，一天2次，共三天，然后禁食12h，第四天早上剂量加倍；空白血清组灌服等量生理盐水。第四天给完药1h后腹主动脉取血，阳性药血清组在采血前1小时，腹腔注射酮替芬0.2ml(5mg/kg)。采血后，收集血清于-20℃保存，使用前过滤。 

3)大鼠主动腹腔肥大细胞脱颗粒试验 

SD大鼠，分为正常对照组和致敏组，正常对照组3只，致敏组15只。致敏组又分为5组，每组3只，即：模型组、空白血清组、阳性药组、样品A组、样品B组。致敏组每足跖注射含有卵白蛋白(OVA)的氢氧化铝凝胶0.1ml(每ml凝胶中含有1mg OVA)，隔天致敏一次，共3次，正常对照组注射等量生理盐水，14天后，颈动脉放血处死，在腹部注入10ml的D-Hanks液(含肝素0.005％)，按摩腹部2min，打开腹腔抽取液体，放入试管中，冰浴，离心1500r/min，5min，弃去上清液，加入约2ml的D-Hanks液，混匀待用。 

各组分别吸取0.5ml混匀的肥大细胞悬液，正常组加入1ml的D-Hanks液，模型组加入0.75ml的D-Hanks液，其余各组加入相对应的含药血清0.75ml，摇匀放置5min，除正常组外，每组均加入0.25ml的80μg/ml的卵白蛋白溶液(用生理盐水溶解)，使得每个样本总体积均为1.5ml，37℃水浴5min，吸去上清液，吸取底部混匀的肥大细胞悬液，滴加1～2滴于中性红染色的载玻片上，加盖玻片，于37℃温箱中孵育3min，高倍镜下观察肥大细胞脱颗粒的情况，每个样本做复片，每张片子查看60个细胞，正常肥大细胞为圆形，边缘光滑，细胞内有均匀分布的石榴红色颗粒，而脱颗粒的细胞颗粒脱失，边缘变形，没有完整的细胞结构。实验结果见表2。 

4)实验结果 

与模型对照组相比，样品A和样品B都能显著抑制大鼠主动腹腔肥大细胞脱颗粒，说明五味子多糖提取物有显著的抗变态反应活性。 

表2 大鼠主动腹腔肥大细胞脱颗粒试验结果 

组别	给药剂量	脱颗粒百分率(％)	抑制率(％)
				正常对照组	-	9.72±2.45	-
模型组	-	82.78±8.78**	-
				空白血清组	等体积生理盐水	80.55±7.72**Δ	0
阳性对照药	5mg/kg	12.50±4.05##	96.20
				样品A组	150mg/kg	11.33±2.87##	97.72
样品B组	150mg/kg	23.33±3.65##	81.37

^**p＜0.01vs正常组；^##p＜0.01vs模型组；^Δp＞0.5vs模型组。 

Claims (10)

1.一种五味子多糖提取物，其特征在于，以D-葡萄糖计，多糖含量不低于多糖提取物总重量的45％。

2.根据权利要求1所述的五味子多糖提取物，其特征在于，所述多糖的单糖组成主要有：D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸，其中，D-葡萄糖与D-半乳糖的质量比为3～9∶1，D-半乳糖醛酸占多糖提取物总重量的5～40％。

3.权利要求1或2所述的五味子多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取五味子药材，粉碎成最粗粉或粗粉，加入五味子粉重量6～10倍的65～95％(v/v)乙醇，回流提取1～3次，每次1～3小时，提取结束降至室温后，过滤，滤液回收另用；

(2)药渣加入药材重量6～10倍量的水，回流提取1～3次，每次1～3小时，提取结束降至室温后，过滤，合并水提取液，减压浓缩至每ml相当于生药量0.3～0.5g；

(3)上述浓缩液离心，弃去沉淀，溶液进一步减压浓缩至相对密度1.12～1.18/60℃，加95％(v/v)乙醇，用酒精比重计测量，至含醇量为70％～90％(v/v)，静置，离心或过滤得沉淀，沉淀用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤后，得多糖提取物粗品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多糖提取物粗品采用以下方法净化：多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1～5wt％的水溶液，用透析膜在纯水中透析24～72小时，或者用超滤的方法，去除小分子，溶液再经后处理，即得到净化后的五味子多糖提取物。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多糖提取物粗品采用以下方法净化：多糖提取物粗品用蒸馏水充分溶解成1～5wt％的水溶液，冰浴下每100ml加入2～8g三氯乙酸，用透析膜在纯水中透析24～72小时，溶液再经后处理，即得到净化后五味子多糖提取物。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述透析膜或者超滤用的超滤膜的截留分子量Da为10000。

7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的后处理采用以下任一种方式：

a、将溶液直接冷冻干燥得到五味子多糖提取物；

b、将溶液减压浓缩至比重1.2～1.5/60℃后，真空干燥，得到五味子多糖提取物；

c、将溶液减压浓缩至比重1.1～1.3/60℃后，喷雾干燥，得到五味子多糖提取物；

d、将溶液浓缩至相对于粗品重量的2～4倍后加95％(v/v)乙醇，使醇含量为70％～90％(v/v)，静置，离心或过滤得到沉淀，将沉淀于30～50℃鼓风干燥得到五味子多糖提取物。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法可从第(2)步直接开始，即五味子药材，粉碎成最粗粉或粗粉后，直接加水回流提取，进行以后的步骤。

9.权利要求1或2所述的五味子多糖提取物在制备抗变态反应药物、功能性食品及化妆品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的五味子多糖提取物以原型或水溶液稀释形式，通过与载体材料结合制成片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂、口服液、注射剂、混悬剂、乳剂、软膏剂、贴剂、霜剂、喷雾剂、擦剂或洗剂。

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