CN103012560B

CN103012560B - 一种地骨皮中环肽类化合物的制备方法

Info

Publication number: CN103012560B
Application number: CN201210566324.2A
Authority: CN
Inventors: 谢练武; 郭亚平; 孙汉洲; 胡云楚
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN103012560A

Abstract

本发明涉及一种地骨皮中环肽类化合物的制备方法。通过对地骨皮甲醇提取物，连续进行硅胶柱层析，聚苯乙烯小孔树脂粗分离与反相C₁₈硅胶柱层析精制，冷冻干燥后制得四种环肽类化合物。采用石油醚、氯仿提取的两步非常关键，因为除去了油脂成分与弱极性成分，实现了按化合物极性初步分离的目的。此外采用固液萃取（固液回流提取）的方法得到含有环肽类的甲醇提取物，固液萃取方法的最大优点在于分离速度快，便于机械化连续操作，避免了液液萃取方法中静置时间长，容易产生乳化现象的缺点，制备得到的环肽类化合物纯度高，具有对血管紧张素Ⅰ转化酶（ACE）与血管紧张肽原酶（renin）的抑制作用，还可用于制备治疗糖尿病或者降血糖的药物。

Description

一种地骨皮中环肽类化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从地骨皮中制备环肽类化合物的方法。

背景技术

地骨皮（Cortex Lycii radicis）为茄科植物枸杞（Lycium chinense Mill.）与同属植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的根皮。一般常用于清虚热，泻肺火，凉血。主治阴虚劳热，骨蒸盗汗，小儿疳积发热，肺热喘咳，吐血，衄血，尿血，消渴。同时，现代药理学研究表明，地骨皮具有广泛的生理活性，譬如降血糖、降血压、降血脂，抑菌消炎，抗心血管疾病等作用。

下述通式表示的环肽类化合物A、B于1989年，C、D于1993年在地骨皮中首次分离出来（见文献：1.Yahara S,Shigeyama C,Nohara T,Okuda H,Wakamatsu K,and Yasuhara T.Structures of anti-ACE and-renin peptides from lycii radicis cortex[J].TetrahedronLetters,1989,30(44):6041-6042.；2.Yahara S,Shigeyama C,Ura T,Wakamatsu K,Yasuhara T,Nohara T.Cyclic peptides,acyclic diterpene glycosides and othercompounds from Lycium chinense Mill[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1993,41(4):703-709.）。通式A、B即文献1的lyciumin A与lyciumin B；通式C、D即文献2的lyciumin C与lyciumin D。

通式

其中的A相对分子质量为873，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

其中的B相对分子质量为896，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

其中的C相对分子质量为963，R₃=-CH₂OH；

其中的D相对分子质量为899，R₂=H，R₃=-CH(CH₃)CH₂CH₃。

上述通式表示的A、B、C和D环肽类化合物目前发现其具有对血管紧张素Ⅰ转化酶（ACE）与血管紧张肽原酶（renin）的抑制作用，本发明人首次发现其能用作降血糖制剂或用于糖尿病治疗。

继癌症和心脑血管疾病之后，糖尿病已经成为危害人类健康的三大杀手之一，而且糖尿病会造成严重的并发症，例如:糖尿病肾病、糖尿病神经病变及糖尿病眼部病变等，给患者带来巨大痛苦。目前，用于治疗糖尿病的常用药物，除了胰岛素外还有四类，第一类是促进胰岛素分泌的磺脲类及非磺脲类药物。磺脲类如格列苯脲、格列吡嗪，迪沙片、格列齐特、格列喹酮等。非磺脲类如瑞格列奈、那格列奈等；第二类是双胍类降糖药物，如二甲双胍、苯乙双胍；第三类是噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，如曲格列酮、吡格列酮、恩格列酮和罗格列酮等；第四类是α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖（拜糖平）、伏格列波糖等。但是利用具有胰岛素类似作用的肽类或环肽类化合物用于降血糖治疗的较少。地骨皮中上述通式表示的环肽类化合物属于天然药物，一般毒副作用较低，符合当代人们崇尚自然，追求绿色安全的理念。因此探索出效果更好，操作简便的提取环肽类化合物的方法，有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种效果较好的从地骨皮中制备环肽类化合物的方法。一种地骨皮中环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）对洗净晾干的地骨皮，粉碎后依次采用石油醚、氯仿与甲醇，分别加热进行2～3次回流提取，获得除去油脂成分与弱极性成分的甲醇提取物；

（2）对甲醇提取物进行柱层析分离制备，包括：硅胶柱层析、聚苯乙烯基小孔树脂柱层析粗分离得到4种粗产物、再分别经过反相C₁₈硅胶柱层析精制，收集后减压浓缩，冷冻干燥后分别获得如下通式的化合物A、B、C和D；

A，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

B，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

C，R₃=-CH₂OH；

D，R₂=H，R₃=-CH(CH₃)CH₂CH₃。

步骤（1）所述的氯仿可以用二氯甲烷代替。

步骤（1）具体过程如下：

地骨皮粉碎后，按照体积质量比2～3mL/g地骨皮加入30～60℃沸程石油醚，55～65℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时；石油醚提取后的地骨皮残渣置于通风处或者真空干燥器中除尽石油醚，然后按照体积质量比2～3mL/g地骨皮残渣加入氯仿或二氯甲烷，65～75℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时，氯仿或二氯甲烷提取后的地骨皮残渣置于通风处或真空干燥器中除尽氯仿或二氯甲烷，然后按照体积质量比2～3mL/g地骨皮残渣加入甲醇，65～75℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时，合并提取液，回收溶剂，回收溶剂后得浸膏，此为地骨皮甲醇提取物。

步骤（1）中地骨皮粉碎至30目。

步骤（2）具体过程如下：

运用硅胶柱层析，上样后以氯仿:甲醇:水=70:30:5为洗脱液淋洗，收集第15～20倍柱体积的馏分，于40～50℃下减压浓缩，蒸干备用；然后利用聚苯乙烯基小孔树脂柱层析粗分离，上样后以甲醇:水体系梯度洗脱，甲醇从40%到100%变化，梯度间隔10%，每个梯度使用4倍柱体积，分别收集甲醇为40%，50%，60%与80%时的馏分，分别于40～50℃下减压浓缩，蒸干，获得粗产品1、2、3与4；最后，将获得的四种粗产品分别进行反相C₁₈硅胶柱层析精制，同样采用甲醇:水体系进行梯度洗脱，梯度间隔5%，每个梯度使用2倍柱体积，对于粗产品1收集甲醇为35%的馏分，对于粗产品2收集甲醇为40%的馏分，对于粗产品3收集甲醇为50%的馏分，对于粗产品4收集甲醇为70%的馏分，分别于40～50℃下减压浓缩，冷冻干燥后分别获得环肽类化合物A、B、C和D。

所述的聚苯乙烯基小孔树脂包括MCI Gel CHP20P树脂。

本发明提取方法中采用石油醚、氯仿提取的两步非常关键，因为除去了油脂成分与弱极性成分，实现了按化合物极性初步分离的目的。

一般地，提取环肽类化合物常采用乙醇提取植物干粉，得到乙醇提取浸膏后悬于水中再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同极性部位（环肽类有可能在乙酸乙酯部位或正丁醇部位），然后采用各种柱层析方法进一步分离纯化得到环肽类纯品。在本发明中，采用的是固液萃取（固液回流提取）方法得到含有环肽类的甲醇提取物，固液萃取方法的最大优点在于分离速度快，便于机械化连续操作，避免了液液萃取方法中静置时间长，容易产生乳化现象的缺点。本发明提纯制备的环肽类化合物A、B、C和D纯度较高，均在98%以上（HPLC检测），另外，它们的快原子轰击质谱图（FAB-MS）见附图。

附图说明

图1为本发明制备的环肽类化合物A的快原子轰击质谱图；

图2为本发明制备的环肽类化合物B的快原子轰击质谱图；

图3为本发明制备的环肽类化合物C的快原子轰击质谱图；

图4为本发明制备的环肽类化合物D的快原子轰击质谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

将地骨皮除去尘土，去杂质，洗净，烘干，碾碎至30目左右，称取地骨皮粉粒3000g，加入2.5倍量（体积质量比mL/g）30～60℃沸程石油醚，55～65℃水浴加热连续回流（回流时间4～5小时）提取2～3次，合并提取液，回收溶剂，挥干溶剂得地骨皮石油醚提取物；石油醚提取后的地骨皮残渣置于通风处除尽石油醚，然后加入3倍量（体积质量比，mL/g）二氯甲烷，65～75℃水浴加热连续回流（回流时间4～5小时）提取2～3次，合并提取液，回收溶剂，挥干溶剂得地骨皮二氯甲烷提取物；二氯甲烷提取后的地骨皮残渣置于通风处除尽二氯甲烷，然后加入2～3倍量甲醇，65～75℃水浴加热连续回流（回流时间4～5小时）提取2～3次，合并提取液，回收溶剂，回收溶剂后得地骨皮甲醇提取物152g。

将甲醇提取物152g上样到硅胶柱（7cm i.d.×80cm），以氯仿:甲醇:水=70:30:5为洗脱液淋洗，收集第15～20倍柱体积的馏分，于40℃下减压浓缩，蒸干得样品95.3g；然后用MCI Gel CHP20P树脂柱（5cm i.d.×60cm）粗分离，上样后以甲醇:水体系从40%到100%梯度洗脱，梯度间隔10%，每个梯度使用4倍柱体积，分别收集甲醇为40%，50%，60%与80%时的馏分，分别于40～50℃下减压浓缩，蒸干，获得粗产品1（21.4g）、粗产品2（16.7g）、粗产品3（18.2g）与粗产品4（11.3g）；将获得的四种粗产品分别用反相C₁₈硅胶柱（2cm i.d.×60cm）层析精制，采用甲醇:水体系进行梯度洗脱，梯度间隔5%，每个梯度使用2倍柱体积，对于粗产品1收集甲醇为35%的馏分，对于粗产品2收集甲醇为40%的馏分，对于粗产品3收集甲醇为50%的馏分，对于粗产品4收集甲醇为70%的馏分，分别于40℃下减压浓缩，冷冻干燥后分别获得化合物A 15.2g（纯度99.8%）、化合物B 13.5g（纯度98.8%）、化合物C 14.7g（纯度99.2%）和化合物D 8.2g（纯度98.5%）。通式分别如下：

A，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

B，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

C，R₃=-CH₂OH；

D，R₂=H，R₃=-CH(CH₃)CH₂CH₃。

实施例2:

实施例1得到的A、B、C和D环肽类化合物降糖作用效果测试：

首先，对8周龄Sprague-Dawley大鼠（初始体重200～250g）高脂喂养3个月后，连续1周腹腔注射小剂量链脲佐菌素（streptozocin）腹腔注射致正常大鼠血糖升高模型，在此基础上，采用口服葡萄糖耐糖试验（OGTT），分别尾部静脉注射环肽类A、B、C和D药物样品5mg/Kg（体重），以西药中公认的治疗糖尿病药物吡格列酮为阳性对照，观测A、B、C和D环肽类化合物对糖尿病大鼠体重、血糖、胰岛素的影响。

然后，在停止腹腔注射链脲佐菌素的第三天空腹12h后，测空腹血糖，以空腹血糖＞11.1mmol/L作为造模成功标准。将造模成功的48只大鼠分为6组，每组8只，即空白组、吡格列酮阳性对照组、环肽化合物A组、B组、C组与D组。五种药物采用柠檬酸-磷酸缓冲溶液配制，均按5mg/kg（体重）尾部静脉给药，空白组注入相当体积的缓冲溶液。各组动物在给药前，分别测定口服葡萄糖耐量(OGTT)，即在空腹12h后，用50%葡萄糖溶液按照2g/kg（体重）灌胃，剪尾出血，用罗氏血糖仪检测其0min，30min，60min和120min时的血糖与胰岛素水平。

在连续用药8周后，结果发现，各组动物间平均体重无显著差异；六组动物在口服葡萄糖30min后血糖与胰岛素水平达到最高值，然后缓慢下降；与空白组相比，在所有时间段内，其他五组用药组的血糖与胰岛素水平降低非常明显；以空白组的血糖浓度升高值作为基准，将它分别减去其他组的血糖浓度升高值得到的差值再除以它，将该比值定义为对血糖浓度升高的抑制率。

以上试验重复三次（每次同样采用48只糖尿病大鼠），我们发现，连续用药8周后，糖尿病大鼠的口服葡萄糖120min后血糖浓度升高的抑制率,环肽类化合物A为54.3～76.5%，B为56.6～67.4%，C为60.9～65.8%，D为58.5～69.3%；吡格列酮为68.7～85.2%。

上述试验说明，A、B、C和D环肽类化合物的降糖效果较强，可以用作降血糖药物治疗糖尿病。由于A、B、C和D环肽类化合物的降糖效果相当，因此可以单独使用，也可以混合使用。

A、B、C和D环肽类化合物体外毒性评价：

体外毒性试验是应用灌注的器官、培养的组织切片、细胞（或亚细胞成分），在体外进行的毒理试验。目前国内外已广泛开展体外毒性试验，能部分代替动物试验。本发明以大鼠来源的成纤维细胞、肝细胞、淋巴细胞、肾脏皮质细胞、心脏细胞、脑细胞与胚胎细胞组成毒性试验细胞模型，以二甲亚砜（DMSO）为溶剂和阴性对照，以苯酚（65g/L）为阳性对照,设置药物高剂量组（100g/L）与低剂量组（10g/L），采用台酚蓝染色计数法，用细胞相对增殖率（相对于阴性对照）的均值评分标准评定该受试药物环肽类A、B、C与D的毒性程度，结果如下表。

根据GB/T14233.2-93判断，相对增殖率在80%以上说明没有任何毒性，从上表结果可知，本发明地骨皮A、B、C和D环肽类化合物对大鼠来源的成纤维细胞、肝细胞、淋巴细胞、肾脏皮质细胞、心脏细胞、脑细胞与胚胎细胞不显出毒性，而且与剂量大小不相关，所以可以推断，A、B、C和D环肽类化合物对各类脏器、组织无明显毒性作用。

Claims

1.一种地骨皮中环肽类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对洗净晾干的地骨皮粉碎后，按照体积质量比2～3mL/g地骨皮加入30～60℃沸程石油醚，55～65℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时；石油醚提取后的地骨皮残渣置于通风处或者真空干燥器中除尽石油醚，然后按照体积质量比2～3mL/g地骨皮残渣加入氯仿或二氯甲烷，65～75℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时，氯仿或二氯甲烷提取后的地骨皮残渣置于通风处或真空干燥器中除尽氯仿或二氯甲烷，然后按照体积质量比2～3mL/g地骨皮残渣加入甲醇，65～75℃水浴加热连续回流提取2～3次，回流时间4～5小时，合并提取液，回收溶剂，回收溶剂后得浸膏，此为地骨皮甲醇提取物；

（2）对甲醇提取物进行柱层析分离制备，具体过程如下：

运用硅胶柱层析，上样后以氯仿:甲醇:水=70:30:5为洗脱液淋洗，收集第15～20倍柱体积的馏分，于40～50℃下减压浓缩，蒸干备用；然后利用聚苯乙烯基小孔树脂柱层析粗分离，上样后以甲醇:水体系梯度洗脱，甲醇从40%到100%变化，梯度间隔10%，每个梯度使用4倍柱体积，分别收集甲醇为40%，50%，60%与80%时的馏分，分别于40～50℃下减压浓缩，蒸干，获得粗产品1、2、3与4；最后，将获得的四种粗产品分别进行反相C₁₈硅胶柱层析精制，同样采用甲醇:水体系进行梯度洗脱，梯度间隔5%，每个梯度使用2倍柱体积，对于粗产品1收集甲醇为35%的馏分，对于粗产品2收集甲醇为40%的馏分，对于粗产品3收集甲醇为50%的馏分，对于粗产品4收集甲醇为70%的馏分，分别于40～50℃下减压浓缩，冷冻干燥后分别获得如下通式的化合物A、B、C和D；

A，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

B，R₂=H，R₃=-CH₂OH；

C，R₃=-CH₂OH；

D，R₂=H，R₃=-CH(CH₃)CH₂CH₃。

2.根据权利要求1所述的地骨皮中环肽类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中地骨皮粉碎至30目。