CN102274244B - 一种肉桂多酚提取物、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种肉桂多酚提取物、其制备方法及其用途，其特征是：将肉桂用CO₂超临界萃取除去脂溶性物质，萃取残渣经水或水混合性溶剂提取，可得到总酚含量6％左右的肉桂多酚粗提取物，再采用SP207大孔吸附树脂纯化，得到的肉桂多酚提取物总多酚含量26％以上，其纯度高，质量稳定。本发明的肉桂多酚具有在治疗和预防2型糖尿病中降低血糖、调节血脂和改善肝功能的作用。

Description

一种肉桂多酚提取物、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种肉桂多酚提取物、其制备方法及其用途，本发明的肉桂多酚具有在治疗和预防2型糖尿病中降低血糖、调节血脂和改善肝功能的作用。

背景技术

糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，1999年世界卫生组织糖尿病专家委员会对糖尿病作出了如下定义：糖尿病是由于人体内胰岛素缺乏或相对缺乏所致的一种慢性内分秘代谢性疾病，以糖代谢紊乱为突出表现，未治疗状态下高血糖为主要特征，并伴有蛋白质和脂肪代谢异常。糖尿病是一种古老的疾病，我国早在2000多年前就有该病的记载，早在《黄帝内经》中对糖尿病已有详细的记载，对糖尿病病因病机、临床表现、治则和预后都作出了论述，到汉代在《金匮要略》中把糖尿病作为一个独立疾病来对待，唐代《外台秘要》中最先记载了糖尿病尿甜的表现。而西方国家直到1672年才有土耳其人Areteus较系统的描述了糖尿病的临床表现，他发现了糖尿病患者“尿甜如蜜”，并详细记载了糖尿病患者从开始发病到病情恶化，直至昏迷死亡的临床过程。尽管欧州人直到17世纪才认识了糖尿病的特点，但在19世纪他们最早证明尿中排泄的是葡萄糖，从而最早揭示了糖尿病与葡萄糖代谢间的关系。糖尿病临床表现为多饮、多食、多尿、身体消瘦，即“三多一少”，并有疲乏无力、尿有甜味等表现，严重者可发生酮症酸中毒甚至昏迷，常易并发心脑血管、神经、肾、眼、急性感染等病变，是严重危害人类健康的疾病。

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病，临床以高血糖为主要标志，主要分为1型(胰岛素依赖型，IDDM)和2型(非胰岛素依赖型，NIDDM)两种，前者乃因胰岛素绝对缺乏，胰岛β细胞分泌极少胰岛素，以致于不能抑制脂肪分解，有大量酮体产生而导致酮症酸中毒(DKA)。2型糖尿病患者的胰岛β细胞仍有一定量胰岛素分泌功能，足以抑制脂肪组织过多游离脂肪酸释放，防止自发性酮症酸中毒的发生。然而高血糖长时期存在。还有一种新型的迟发自身免疫型糖尿病(LADA)，也称1.5型糖尿病。

2010年3月25日出版的《新英格兰医学杂志》上，由来自杜兰大学的研究员人和他们的中国同事在中国进行的一项基于大规模人群的糖尿病研究得出结论说，这种疾病在中国成年人群中已经达到了流行的比例。这项研究估计9240万20岁或20岁以上的成年人(人口的9.7％)有糖尿病，而14820万成年人(15.5％)有前驱糖尿病，后者是出现显性糖尿病和心血管疾病的一个关键的风险因素。国际糖尿病联盟(IDF)主席Pierre Lefebvre教授概述了以下事实：“50多年来，糖尿病已经发展为一个危害人类健康和社会发展的全球性问题。糖尿病患者的总人数每年以惊人的速度在递增。如果继续对糖尿病的蔓延无动于衷，那么它的肆虐将波及全球超过3.5亿人口，进而威胁到许多国家的医疗保障体系，甚至吞噬发展中国家的经济发展成果。”中国的糖尿病患者人数近6年内激增2倍多，现已突破9000万之众，这个“世界第一”的帽子已给正在崛起的中国带来了沉重负担，每年我国直接用于糖尿病的医疗费用高达一千七百亿元人民币。世界卫生组织指出，如不采取有效措施，预计在未来10年内，仅糖尿病、心脏病、中风就将给中国造成至少5500亿美元的经济损失。

2型糖尿病的主要治疗方法就是各种形式的胰岛素控制治疗，2型糖尿病患者的病症主要表现为代谢异常，最为典型的就是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏，这些异常导致血糖升高，进而提升了发生心血管方面疾病的可能。因此控制血糖能延缓2型糖尿病患者微血管和大血管病变的发展。众所周知的用于治疗高血糖的各种技术和治疗方法可概括为两种，一种通过改变生活方式来增加胰岛素敏感性，主要包括减轻体重，改善饮食和适量的运动，随着病情的发展口服胰岛素促泌剂和胰岛素增敏剂，以保持血糖正常水平，患病后期由于胰岛β细胞功能的衰退，需要注射胰岛素来达到控制血糖的目的。对于某些患者来说，单用口服降糖药物是没有效果的，往往需要配合胰岛素一起使用才能起效，但是经常会有无法增加体重和低血糖的效果。还有一些患者因为身体或者有其他疾病的因素影响，无法使用胰岛素治疗。

目前常用口服降糖药以促胰岛素分泌剂和胰岛素增敏剂为主，前者包括磺脲类(格列本脲(优降糖))，双胍类(二甲双胍)，后者主要为增敏剂(罗格列酮)，等用于二型糖尿病的治疗，还有一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，不同于磺脲类和双胍类的新一代抗高血糖药物。这类药物能提高肌肉、脂肪对葡萄糖的摄取和利用，抑制肝脏葡萄糖的输出，降低血糖。但是2型糖尿病为一种慢性疾病，需终生服药，控制血糖的同时，西药不良反应随之出现，患者对西药耐受性差，长期服药会给患者带来诸多器官损伤，有些反应较严重甚至引起死亡。其中不良反应包括低血糖，心血管副反应，消化道副反应，乳酸性酸中毒，肝肾毒性等。

中医药是中华民族优秀文化的灿烂结晶，数千年来，为中华民族的繁衍昌盛建立了不可磨灭的功绩，同时也为世界民族医学的发展作出了贡献。采用现代科学研究手段，开发出高效、优质、安全、稳定的“三效”、“三小”、“三便”的新型中药，随着人类对化学药物毒副作用的认识，倾向于“回归自然”，采用天然药进行医疗保健日益受到重视。

迄今为止，中医治疗糖尿病取得了很大成绩，其优点在于它不仅可降低血糖，减低胰岛素抵抗，且作用持久，无毒副作用，同时可降低糖尿病并发症的发病率，延缓并发症的进程，发挥整体调节的优势，改善患者生活质量。目前，畅销的中药制剂及其复方制剂约有10多个。据不完全统计，消渴丸、糖脉康、消渴康、糖乐、玉兰降糖胶囊、玉苓消渴茶是6个独家品种。而降糖舒、渴乐宁、玉泉丸(片、散、颗粒)、十味玉泉胶囊、参芪降糖、振源胶囊(口服液、片)等各个品种获准生产的厂商均在10家之内；降糖宁、消渴灵生产批文多达50多个；降糖中成药制剂生产批文已超过200多个。但是，整体来看，糖尿病中成药在整个糖尿病用药中的市场份额相对较少，在口服糖尿病市场上，中成药只占据16％的市场份额，远远低于西药，处于辅助治疗地位。在主要品种中，消渴丸占有市场主导地位，占领整个糖尿病中成药55％的市场分额，但消渴丸中含有西药成分，并非纯中药产品。目前纯中药降糖制剂包括糖脉康颗粒、参芪降糖颗粒、金芪降糖片和辅仁糖尿乐胶囊等只占市场的31％强。其他品种只占10％多的市场。研制一种具有确切降糖作用的纯中药制剂具有非常重大的市场价值，并对研究降糖天然化学活性组分具有重要的理论意义。

肉桂为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮，是一种常用中药材，作为香料和药用历史悠久，最早记载源于《神农本草经》，有“桂为百药之长”的说法。肉桂其性味辛、甘、大热，归肾、脾、心、肝经，具有补火助阳，引火归源，散寒止痛，活血通经的功能。《中华人民共和国药典》收载了肉桂皮、枝和枝叶提取的挥发油，分别命名为肉桂、桂枝、肉桂油。肉桂所含化学成分复杂，其中多数物质都具有其独特的药理作用。肉桂和桂枝作为香料、食品添加剂和中药，长期以来主要关注的是挥发油部分，肉桂油为常用的驱风药及健胃药。肉桂一股含挥发油1％～2％，其中桂皮醛(cinnamaldehyd)75％～90％，并含有少量醋酸桂皮脂(cinnamyl acetate)、丁香酚等。CO₂超临界萃取法可以从肉桂中提取10％左右的肉桂醛油，其中大部分为挥发油，CO₂超临界萃取的挥发油一股作为香料和食品添加剂使用。肉桂水或醇提取物中主要含鞣质类、香豆素类、桂皮酸、胆碱、倍半萜、二萜类化合物等。

经现代药理试验表明，Karalee J等研究发现肉桂中含有的一种甲基羟基查尔酮聚合物(MHCP)在3T3-L1脂肪细胞中有类似胰岛素样作用(Karalee J.Jarvill-Taylor，et al.AHydroxychalcone Derived from Cinnamon Functions as a Mimetic for Insulin in 3T3-L1adipocytes[J]Journal of the American College of Nutrition 2001，20(4)：327-336)，Justin A等研究发现肉桂不能够提高1型糖尿病患者的血糖代谢水平(Justin A Altschuler，Samuel J.Casella，et al.The effect of Cinnamon on A1C among adolescents with type 1 diabetes[J]DiabetesCare April 2007，30(4)：813-816)；于峰、王厚伟等认为肉桂多糖对四氧嘧啶诱发的实验性糖尿病小鼠有显著的降糖效果(肉桂多糖对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠降糖作用的研究[J].食品与药品2009，11(6)：25-27)；李宗孝，温普红，袁美娟的细胞实验表明，从肉桂中分离得到的MHCP有胰岛素样作用，能有效调节细胞各种反应能力(肉桂中查耳酮的类似胰岛素作用[J].中医药学报2004，32(5)：72-75)，但是该文献并未提到MHCP的化学组成、具体来源和制备方法。

CN200610201217.4公开了一种肉桂治疗糖尿病上的用途及产品和其制备方法，CN200610117512.1公开了一种肉桂提取物的制备方法、肉桂提取物、其组合物及用途，这两篇专利中都没有明确肉桂中降糖活性组分的属性及其质量控制方法，并且两专利中的肉桂提取物的制备都是采用水或水性溶剂提取，萃取物中含有大量的挥发油成分，主要是肉桂醛、香豆类等，现代研究表明此类物质不但没有降糖活性，并且会影响血压的稳定。CN200610023280.3公开了一种从中药肉桂中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该专利认为提取物对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制作用，但该专利没有明确提取物的性质、稳定性、测定指标和质量控制方法。CN200810027065.X公开了一种肉桂皂苷提取物及其制备方法和应用，该专利提取了肉桂皂苷作用活性成分。

发明内容

本发明公开了一种肉桂多酚提取物。

发明人研究发现，肉桂中的降糖成分是水溶性多酚类物质，其在肉桂药材中的含量非常低，约0.1％-0.3％。中药肉桂中含有8％～12％的肉桂醛、肉桂酸、香豆素类、丁香酚等挥发性物质，它们没有降糖效果，因此必须在提取多酚前预先分离和去除。CO₂超临界萃取可有效分离出脂溶性物质并另加利用，萃取残渣经水或水混合性溶剂提取，可得到总酚含量6％左右的肉桂多酚粗提取物，其中含有大量的水解多糖、水溶性淀粉等杂质，它们的存在造成产品具有非常大的引湿性，影响肉桂多酚提取物的稳定性，且不利于保存和生产制剂，所以必须进一步纯化。发明人采用SP207大孔吸附树脂纯化可以最大程度的分离出水溶性多酚，纯化后总多酚含量提高到了26％以上，其纯度高，质量稳定。并且提取物有利于后续的制剂生产。

本发明的肉桂多酚提取物用以下方法得到：

(1)肉桂药材粉碎后用CO₂超临界萃取去除挥发油；

(2)CO₂超临界萃取后残渣用水或30％～70％乙醇加热煎煮；

(3)煎煮液离心分离，滤液真空浓缩后干燥得肉桂多酚粗提物；

(4)将肉桂多酚粗提物用50％～80％的丙酮或50％～80％的乙醇萃取，抽滤，滤液浓缩后加水得上柱液；

(5)上柱液上SP207树脂柱，用40％～55％乙醇洗脱，收集洗脱液，旋蒸至干，得肉桂多酚提取物；

本发明中的百分比均为重量百分比。上述涉及百分比的溶液均是指的水溶液。

步骤(1)中CO₂超临界萃取的温度为45℃～60℃，压力为32～35MP。更优选的温度为45℃～55℃，最优选为47℃～53℃。

步骤(2)中水或30％～70％乙醇的重量优选CO₂超临界萃取后残渣重量的8～12倍。CO₂超临界提取后的残渣可用水也可以使用30％～70％的乙醇水溶液提取，但水提成本较低。

步骤(2)中加热煎煮温度优选45℃～70℃。优选范围为45℃～60℃，更优选为45℃～55℃，最优选的条件为50℃～53℃。

步骤(4)中肉桂多酚粗提物可用纯净水或丙酮水溶液萃取，优选用50％～80％的丙酮萃取，更优选用80％丙酮萃取。用纯净水萃取后还需要进行醇沉，操作复杂、时间长。

步骤(4)中滤液浓缩后加适量体积的水制得总多酚浓度适当的上柱液。浓缩温度优选低于70℃，更优选的条件是低于60℃。所加水的量优选加水后上柱液中总多酚含量在1.5～5.0mg/ml，更优选为2～4.5mg/ml，进一步优选为3～4.0mg/ml。

步骤(5)中上柱液上SP207树脂柱后，优选先用0.1％乙酸冲洗，然后用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液。SP207树脂是一种聚合溴代苯乙烯系大孔吸附树脂，比纯苯乙烯聚合物疏水性更强，对非极性大分子有较大的吸附选择性。孔容积为：1.3ml/g；比表面积为：600m²/g；孔半径：

表观密度：780g/L-R；水含量：43～53％。SP207对肉桂多酚类物质最大吸附量达到54.7mg/g，同时能吸附水解多糖。0.1％乙酸水溶液可洗脱不含羟基的物质以及小分子的糖类物质。肉桂多酚类物质的洗脱剂优选为40％～55％乙醇，最优选为50％乙醇。70％～95％的乙醇能洗脱多糖和水溶性淀粉。

本发明的第(5)步骤中，最优选操作条件为SP207树脂床φ45×220mm，柱体积为350mL，上柱液的多酚浓度为3～4mg/mL，上柱吸附速度为2mL/min，洗脱速度为1d/s，50％乙醇洗脱体积为3BV。

上述制备方法得到的肉桂多酚其总多酚含量不低于26％。其为棕红色具有特殊香气的粉末，引湿性小，可在避光、密闭条件下室温保存，其保存期不少于24个月。其能溶于纯水、50％～80％丙酮水溶液和50％～75％乙醇水溶液，不能全溶于丙酮或无水乙醇。其有相当好的粉末流动性，能直接和辅料混合后压片，压成的肉桂多酚片稳定性和溶出度合格。该肉桂多酚提取物属于无毒物。

本发明的优选实施方式中，所述肉桂多酚提取物的HPLC图谱如图4所示。

本发明中的肉桂多酚提取物的制备方法具有工业化规模，产品稳定性好、易保存。用本发明方法制得的肉桂多酚具有增加胰岛素敏感性、促进胰岛素分泌、降低血糖的作用，同时具有调节血脂、改善肝功能的作用。本发明的肉桂多酚在治疗和预防2型糖尿病和调节血脂药品或保健品中有广泛的应用。

本发明的肉桂多酚提取物在35～140mg/kg/d的范围内能显著降低STZ致糖尿病大鼠血糖、调节血脂，并具有改善肝功能的作用。

本发明的肉桂多酚提取物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。具体说用本发明的肉桂多酚提取物制成的药品或保健品可为颗粒剂、片剂、冻干粉、胶囊、舌下含片或其它合适的形状。本发明的肉桂多酚提取物在制备成药品或保健品时可含有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中的肉桂多酚提取物的降血糖和降血脂有效剂量范围为35～140mg/kg/d(STZ致糖尿病大鼠)。本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效剂量为给予个体35～140mg/kg/d(STZ致糖尿病大鼠)的本发明肉桂多酚提取物。此外，本发明的活性物质还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的肉桂多酚提取物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物，尤其是人。

药理学试验证明本发明的肉桂多酚提取物，能有效降低血糖、调节血脂，从而预防和治疗2型糖尿病，并具有明显的改善肝功能的作用。下面是部分药理试验及结果：

本发明的肉桂多酚对链尿霉素(STZ)致SD大鼠糖尿病血糖、血脂的影响

一、实验材料

柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液(mol·L-1)组成如下：A.柠檬酸三钠母液(0.1mol·L-1)：29.4g溶解在1000ml蒸馏水中；B.柠檬酸母液(0.1mol·L-1)：21.0g溶解在1000ml蒸馏水中；C.工作液(pH 4.4)，A∶B＝1∶1.32(体积比)；链脲佐菌素溶液的配制：将链脲佐菌素(STZ)溶于工作液C中(冰浴条件下，临用前配制，5分钟内注射完毕)。

2.实验动物和饲料

SD大鼠，雄性，清洁级，体重180±10g，

基础饲料：由小麦粉、玉米粉、麦麸、大豆粉、鱼粉、骨粉及多种维生素组成。

高糖高脂饲料：基础饲料74.5％、蔗糖10％、猪油10％、胆固醇0.5％、蛋黄粉5％。

二、STZ致SD大鼠糖尿病模型的建立

1.动物模型建立

大鼠适应性饲养2天，室内温度保持在25℃，湿度在50％左右，明暗周期12h，自由饮水和进食。除正常对照组给予普通标准饲料外，其余均给予高脂高糖饲料喂养四周后测定口服葡萄糖耐量实验，然后禁食10～12h。一次性腹腔注射链脲霉素(STZ)40mg/kg，一周后，取禁食8h后大鼠眼角静脉丛取血用血糖试纸测空腹血糖，选择血糖值高于11.0mmol/L者视为造模成功。

2.实验动物分组及给药

本实验使用的肉桂多酚是按实施例1所述方法制备的，总多酚含量为27.87％，HPLC谱如图4。

将成模的2型糖尿病大鼠按空腹血糖值随机分组，每日1次灌胃给药，分别为二甲双胍组100mg/kg，肉桂多酚1(高剂量组，140mg/kg)，肉桂多酚2(低剂量组，35mg/kg)。模型组和空白对照组给予等体积的蒸馏水，连续灌胃4周。

3.血清的准备和血清生化检查

分别于第0天给药前，第7、11、21、28天给药后禁食8h，眼角静脉丛取血，低温离心(1500Xg，15min，4℃)，分离血清，分装于1.5mL冻存管中，-20℃冰箱保存，以待测定各个生化指标。

采用酶标仪按照各试剂盒的说明测定空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷草转氨酶(AST/GOT)和谷丙转氨酶水平。采用放免法测定血清胰岛素(FINS)水平。

4.运用Excel 2007进行数据分析，实验数据均以

表示，组间比较用t检验。

三、实验结果

1.体重变化

SD大鼠正常组、模型组和各用药组的体重变化如表1所示。

表1 大鼠体重的变化(n＝8)

组别	体重/g(第1天)	体重/g(第28天)
			正常组	249.2±9.1	369.8±11.3
模型组	243.8±19.2	203.9±10.5##
			二甲双胍组	238.4±30.6	259.8±14.3**
肉桂多酚1	237.0±20.6	264.4±13.4**
			肉桂多酚2	228.0±25.6	259.4±18.4**

注：与正常组比^##P＜0.01，与模型组相比^**P＜0.01

结果表明给药前正常组、模型组和各给药组之间比较直接差异无统计学意义(P＞0.05)。给药4周后，与正常组对照组相比，模型组的体重明显降低(P＜0.01)。与模型相比，二甲双胍组、肉桂多酚组体重变化显著(P＜0.01)。肉桂多酚的高低2个剂量组间直接差异无统计意义(P＞0.05)。

2.对空腹血糖(FPG)水平的影响

空腹血糖(FPG)水平的实验结果如表2所示。

表2 大鼠空腹血糖(FPG)的影响(n＝8)

注：与正常组比^##P＜0.01，与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

给药前，模型组与正常组比较FPG水平明显升高(P＜0.01)，且各给药组与模型组间差异无统计意义(P＞0.05)。给药2周至4周后，二甲双胍组血糖水平较模型组均明显降低(P＜0.01)，肉桂多酚1和2组较模型组均有所下降(P＜0.05)。给药4周后，肉桂多酚1和2组较模型组均显著下降(P＜0.01)。结果说明本发明的肉桂多酚能有效降低糖尿病大鼠空腹血糖，当饲喂量为肉桂多酚140mg/kg/d，28天后，血糖降低43.4％，其降血糖效果优于二甲双胍(-37.4％)，当饲喂量为肉桂多酚35mg/kg/d，28天后，血糖降低32.7％，降血糖效果显著。同时降血糖效果有时间和剂量依赖关系。

3.对血清胰岛素(FINS)水平的影响

糖尿病大鼠血清胰岛素(FINS)水平在给药前和给药4周后的变化结果列于表3中。

表3 大鼠血清胰岛素(FINS)的变化(n＝8)

组别	胰岛素(FINS)(μIU/mL)
		正常组	21.59±4.41
模型组	16.61±4.13#
		二甲双胍组	16.84±2.29
肉桂多酚1	20.17±2.72*

肉桂多酚2

21.68±2.78*

注：与正常组比^#P＜0.05，与模型组相比^*P＜0.05

结果表明给药4周后，模型组与正常组比较，胰岛素水平(FINS)降低(P＜0.05)。与模型组相比，二甲双胍组FINS变化不大(P＞0.05)，肉桂组FINS水平均升高(P＜0.05)。说明本发明的肉桂多酚能升高大鼠血清胰岛素，有促胰岛素分泌的作用，而，二甲双胍没有此作用。

4.对丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平的影响

糖尿病大鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平在给药前和给药4周后的变化结果列于表4中。

表4 丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)的变化(n＝8)

组别	ALT(IU/L)	AST(IU/L)
			正常组	36.97±19.54	102.64±27.30
模型组	76.74±19.35##	180.36±42.09##
			二甲双胍组	63.54±23.56	164.60±43.03
肉桂多酚1	44.97±8.95*	124.46±13.41**
			肉桂多酚2	50.62±15.99*	139.24±31.55**

注：与正常组比^##P＜0.01，与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

给药4周后，模型组与正常组比较，丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平均显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，二甲双胍组的ALT、AST变化不大，而肉桂提取物组ALT水平降低(P＜0.01)，AST水平显著降低(P＜0.01)。本实验显示，本发明的肉桂多酚在降低血糖的同时有明显的改善肝功能作用。

5.脂代谢作用的相关指标

5.1血清总胆固醇(TC)水平的变化

大鼠血清总胆固醇(TC)水平在给药前后的变化实验结果列于表5中。

表5 大鼠血清总胆固醇(TC)的影响(n＝8)

注：与正常组比^##P＜0.01，与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明模型组与正常组比较血清TC水平明显升高，有显著性差异(P＜0.01)，且各给药组与模型组间差异无统计意义(P＞0.05)。给药2周后，肉桂多酚1组的TC水平降低(P＜0.05)，给药3周后，各实验组TC水平均降低(P＜0.05)，给药4周后，二甲双胍组、肉桂多酚2个剂量组的TC水平均降低(P＜0.05)。结果说明本发明的肉桂多酚能降低糖尿病大鼠的血清总胆固醇(TC)水平。

5.2对血清甘油三酯(TG)水平的影响

大鼠血清甘油三酯(TG)在给药前后的影响实验结果列于表6中。

表6 大鼠血清甘油三酯(TG)的影响(n＝8)

注：与正常组比^##P＜0.01，与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果显示模型组与正常组比较血清TG水平明显升高，有显著性差异(P＜0.01)，且各给药组与模型组间差异无统计意义(P＞0.05)。给药3周后，二甲双胍组的TG水平显著降低(P＜0.01)，肉桂多酚1的TG水平降低(P＜0.05)。给药4周后，二甲双胍组、肉桂多酚2组的TG水平显著降低(P＜0.01)，肉桂多酚1组水平降低(P＜0.05)。结果说明本发明的肉桂多酚能降低糖尿病大鼠的血清甘油三酯(TG)水平。

5.3血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的变化

血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平在给药前后的变化结果列于表7中。

表7 大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响(n＝8)

注：与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，给药前模型组与模型组比较血清HDL-C水平变化不大(P＞0.05)，且各给药组与模型组间差异无统计意义(P＞0.05)。给药4周后，二甲双胍、肉桂多酚1组的HDL-C水平显著升高(P＜0.01)，肉桂多酚2的HDL-C水平升高(P＜0.05)。结果说明本发明的肉桂多酚能显著升高糖尿病大鼠的血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

5.4血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的变化

给药前，正常组与模型组之间血清LDL-C水平明显升高(P＜0.05)，且各给药组与模型组间差异无统计意义(P＞0.05)。给药3周后，肉桂多酚2组的血清LDL-C水平降低(P＜0.05)。给药4周后，各实验组HDL-C水平均降低(P＜0.05)。

表8 大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响(n＝8)

注：与正常组比##P＜0.01，与模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

以上实验结果表明，按本发明的肉桂总多酚提取物，能显著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖、升高血清胰岛素水平从而降低血糖。降低血清总胆固醇(TC)、血清甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，显著升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平从而调节血脂。还能降低血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)水平，改善肝功能。

综上所述，本发明肉桂多酚提取物能降低糖尿病大鼠血糖，改善其脂代谢紊乱，4周内疗效随治疗时间延长而疗效逐渐增强，呈明显的时效关系，并且对糖尿病大鼠的肝脏有保护作用。因此，肉桂多酚提取物可以用于预防或治疗糖尿病，改善其脂代谢紊乱。肉桂多酚提取物急性毒性实验

为进一步给临床安全用药提供剂量依据，本发明研究了肉桂多酚提取物急性毒性。

一、实验动物及饲养管理条件

实验动物：ICR小鼠，体重20-25g，雌雄各半。

饲养管理条件：实验室温度20-25℃；饲料为实验鼠颗粒饲料，自由饮水；垫料为刨花木屑。

肉桂多酚溶液：按本发明实施例1制备的肉多酚提取物用纯净水调配成肉桂提取物溶液，浓度为1.3333mg/ml。

二、实验方法

取小鼠10只，雌雄各半，作为空白对照组，禁食12h后以0.4ml/10g小鼠给予溶剂(乐百氏纯净水)。肉桂多酚组10只(雌雄各5只)，禁食12h以0.4ml/10g小鼠(最大给药容量)的容量灌胃给药。给药后即刻观察小鼠的行为活动和存活情况，连续观察14天。

三、实验结果：

空白对照组小鼠行为活动正常，14天内无死亡。给药组给药后观察小鼠活动减少，1小时内行为活动逐渐恢复正常，之后数天观察动物行为正常，14天内小鼠无一例死亡发生。体重变化见表9。

表9 给药前后小鼠体重的变化

注：与空白对照组比较，^*P＜0.05

此期间发现小鼠的生命状况良好，无死亡现象，所以预测实验无法测定半数致死量(LD50)，测定最大耐受量(MTD)肉桂为53.33g/kg。根据我国食品毒理学中采用的急性毒性分级的六级标准，本发明肉桂提取物属无毒。

尸检：给药后第14天将动物处死，尸检心、肝、脾、肺、肾、胃肠道等重要脏器，肉眼未见明显异常变化。各小组小鼠心脏、肾脏、肝脏与体重的比值见表10。

表10 各小组小鼠心脏、肾脏、肝脏与体重的比值

注：与空白对照组比较^*P＜0.05

实验数据显示本发明的肉桂多酚组与空白对照组的各脏器与体重的比值无显著性差异(P＞0.05)，提示肉桂多酚对小鼠各脏器无影响。

附图说明

图1是测定肉桂多酚用没食子酸对照品浓度和吸光度标准曲线

图2是实施例1中所述方法制备的肉桂多酚粗提物HPLC谱

图3是实施例1中所述SP207大孔吸附树脂纯化前上柱液HPLC谱

图4是实施例1中方法经SP207大孔吸附树脂纯化后的肉桂多酚提取物HPLC谱

具体实施方式

实施例1

肉桂多酚提取物的制备

肉桂的CO₂超临界提取

本实施例中使用德国伍德公司产CO₂超临界萃取机组，提取罐1500L×3，每个提取罐中加入40目的广西肉桂(Cinnam om um cassia Presl)450kg，控制压力33～34MPa，温度51℃，流量5T/h，连续提取3小时后出釜。共得肉桂油140kg。其中含肉桂醛约60％、香豆素约6％、油脂类物质约20％，其它物质14％。可作为香料或食品添加剂。

肉桂多酚粗提物的制备

上述CO₂超临界萃取后肉桂残渣120kg加入到1500L不锈钢反应釜中，加入去离子水1200L，加热升温至65℃，机械搅拌1.5小时，离心分离，滤液转移至浓缩釜，在0.05～0.1MPa、65℃浓缩至d＝1.05～1.1，喷雾干燥，得肉桂多酚粗提物。该提取物为红棕色具有肉桂的特殊香气，量为6.7kg，总多酚含量为5.6％。称取粗提物0.1g加10mL纯净水，超声振荡10分钟，取上清液20μl测HPLC谱，如图2。

肉桂多酚的纯化

称取270g SP207大孔树脂(三菱化学，上海摩速科学器材有限公司)，放置于大烧杯中，加入1000ml无水乙醇(约3倍树脂体积)浸泡8小时。去除漂浮物及杂质后湿法装柱，树脂床为φ4.5cm×22cm，柱体积约为350mL。流出乙醇至液面停留在树脂层上方3cm左右，用去离子水以2BV/H的流速通过树脂层，洗净乙醇。加入4％的HCL溶液，以5BV/H的流速2BV体积冲洗树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至洗脱液呈中性(pH试纸检测pH＝7)。加入5％的NaOH溶液，以5BV/H的流速2BV体积冲洗树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性备用。

称取按上述方法提取的肉桂粗提物100克，加入600mL80％丙酮水溶液，50℃回流2小时，无纺布过滤，滤渣再用400mL80％丙酮水溶液相同条件提取两次，合并三次提取滤液。50℃旋转蒸发回收丙酮，蒸发至300mL左右加水300mL，继续旋蒸至有沉淀析出，抽滤，沉淀用少量水在50℃加热荡洗抽滤，合并滤液，得滤液共850mL。直接吸取上述滤液测定总多酚浓度为：3.89mg/ml。其HPLC谱如图3。

上柱液850mL，以1mL/min流速全部流过树脂柱。上柱液流经树脂床后，加入1L0.1％乙酸水溶液，流速为2ml/min冲洗树脂柱。当酸水溶液液面到达树脂床上方约2～3cm时，加入50％乙醇水溶液洗脱，洗脱液体积为1000mL(3BV)，流速1d/s，收集洗脱液，60～65℃旋转蒸发至干，称重并检测多酚含量。得肉桂多酚样品重量为12克，总多酚含量为28.9％。样品的HPLC谱如图4。

肉桂提取物的总多酚含量测定

本发明中的肉桂提取物的主要质量控制是肉桂多酚，测定方法描述如下：

1.对照品溶液的配制

精确称取没食子酸(中国药品生物制品检定所)对照品0.0103g，加纯净水定容至100ml，配成103μg/ml的备用液。精确吸取备用液1、2、3、4、5、6、7、8ml于10ml容量瓶，定容到10ml，得不同浓度没食子酸的对照品溶液。

2.Folin-Ciocalteu测定法

分别精确吸取1ml对照品溶液于10ml容量瓶，加2mol/L的Folin-Ciocalteu显色剂(上海百季科技发展有限公司)0.5ml，然后加入1mol/LNa₂CO₃溶液3ml，室温静置15min，用纯净水定容至10ml。于725nm处测定其吸光度值(TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司)。用1ml纯净水代替对照品溶液，同上法操作作为空白溶液。

3.对照品标准曲线的绘制

对照品的浓度和吸光度的测定结果如表11所示。

表.11 没食子酸对照品浓度和吸光度测定结果

No.	Ab sorption	Concentration(μg/ml)
			1	0.128	1.03

2	0.238	2.06
			3	0.354	3.09
4	0.465	4.12
			5	0.585	5.15
6	0.676	6.18
			7	0.810	7.21
8	0.917	8.24

根据表11数据绘制标准曲线，如图1。

回归方程为：y＝0.1094x+0.0144

线性系数为：R²＝0.9994

4.样品多酚含量的测定

精确称取干燥的样品粉末0.1g，溶于10ml蒸馏水中，超声溶解30min；转移至10mL离心管中，2500rpm×30min，用移液管取上清液5mL至250ml容量瓶中，蒸馏水定容即得。测定吸光值，按照标准曲线计算出多酚浓度(μg/mL)，固体样品多酚百分含量按下列公式计算：

$W=\frac{C\×n\×V}{m}\×100\%$

式中：W-多酚的百分含量；C-测得多酚的体积浓度，g/mL；n-样品溶液配置成待测液的稀释倍数；V-样品溶液总体积，mL；m-样品的质量，g。

本发明中肉桂提取物的HPLC测定方法：

HPLC Agilent 1200

色谱分离柱：WondaSil C18，4.6×250mm，GL Sciences Inc.

检测温度：25℃；

流动相：乙腈/甲醇/水＝26/14/60，加甲酸至总甲酸浓度为0.1％；

流速：0.175mL/min；

检测波长：278nm；

0.22μm滤膜过滤，进样量20μL。

本发明的样品的HPLC图谱见图2、图3和图4。

实施例2

肉桂多酚提取物制备

肉桂的CO₂超临界提取

本实施例中使用德国伍德公司产CO₂超临界萃取机组，提取罐1500L×3，每个提取罐中加入40目的广西肉桂(Cinnam om um cassia Presl)450kg，控制压力31～32MPa，温度48℃，流量6T/h，连续提取3.5小时后出釜。共得肉桂油131kg。

肉桂多酚粗提物的制备

上述CO₂超临界萃取后肉桂残渣120kg加入到1500L不锈钢反应釜中，加入50％乙醇-水溶液1200L，加热升温至60℃，机械搅拌2小时，离心分离，滤液转移至浓缩釜，常压下65℃蒸去乙醇，减压至0.08～0.1MPa、60℃浓缩至d＝1.05～1.1，喷雾干燥，得粗提物。该提取物为红棕色具有肉桂的特殊香气，量为6.1kg，总多酚含量为5.1％。

肉桂多酚的纯化

称取250g SP207大孔树脂，按实施例1相同的方法处理，树脂床为φ4.5cm×20cm，柱体积约为320mL。

称取按上述方法提取的肉桂多酚粗提物100克，加入1000mL纯水，超声振荡0.5小时，无纺布过滤，滤渣再用500mL纯水相同条件提取，合并二次萃取滤液。体积约为1.35L，60℃旋转至体积约500mL，降温至室温，加550mL95％乙醇，4℃静置12小时，抽滤，滤液60℃蒸发回收乙醇至溶液无醇味，体积约为380mL，加纯净水至总体积为0.85L，抽滤，滤液作为上柱液。直接吸取上述滤液测定多酚浓度为：3.48mg/ml。

上柱液850mL，以1mL/min流速全部流过树脂柱。上柱液流经树脂床后，加入1L0.1％乙酸水溶液，流速为2ml/min冲洗树脂柱。当酸水溶液液面到达树脂床上方约2～3cm时，加入50％乙醇水溶液洗脱，洗脱液体积为1000mL(3BV)，流速1d/s，收集洗脱液，60～65℃旋转蒸发至干，称重并检测多酚含量。得肉桂多酚样品重量为10.5克，总多酚含量为26.5％。

实施例3

肉桂多酚提取物片的制备

处方：

硬脂酸镁：1g

羧甲基纤维素钠：9g

微晶纤维素：26g

淀粉：9g

肉桂多酚提取物(肉桂总多酚28％)：135g

按处方比例将肉桂花多酚和辅料混合均匀，单冲压片机，9号模具，0.65MPa压力下压片，得600片，300mg/片。肉桂多酚片的稳定性和溶出度合格。

Claims (7)

1.一种肉桂多酚提取物，其特征是由以下方法制备：

(1)肉桂药材粉碎后用CO₂超临界萃取去除挥发油；

(2)CO₂超临界萃取后残渣用水或30％～70％乙醇加热煎煮，水或30％～70％乙醇的重量是CO₂超临界萃取后残渣重量的8～12倍，加热煎煮温度是45℃～70℃；

(3)煎煮液离心分离，滤液真空浓缩后干燥得肉桂多酚粗提物；

(4)将肉桂多酚粗提物用50％～80％的丙酮或水萃取，抽滤，滤液浓缩后加水得上柱液；

(5)上柱液上SP207树脂柱，先用0.1％乙酸冲洗，再用40％～55％乙醇洗脱，收集洗脱液，旋蒸至干，得肉桂多酚提取物；

上述百分比均为重量百分比。

2.权利要求1的肉桂多酚提取物，其中步骤（4）中肉桂多酚粗提物用80％丙酮萃取。

3.权利要求1的肉桂多酚提取物，其中步骤（4）中滤液浓缩后加水得上柱液，加水后总多酚含量为1.5～5.0mg/ml。

4.权利要求1的肉桂多酚提取物，其中步骤（5）中上柱液上SP207树脂柱后，先用0.1％乙酸冲洗，然后用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液。

5.权利要求1的肉桂多酚提取物，其中步骤（1）中CO₂超临界萃取的温度为45℃～60℃，压力为32～35MPa。

6.权利要求1的肉桂多酚提取物，其中肉桂总多酚含量不低于26％。

7.权利要求1至6中任一项的肉桂多酚提取物用于制备治疗和/或预防2型糖尿病的药物或保健品的用途。 

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