CN102228539B - 刺玫果总黄酮提取物及其提取方法和其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种刺玫果总黄酮提取物及其提取方法和其医药用途,属于中药的有效药用部位中的提取物及其提取方法和其药物用途。将中药刺玫果干燥粉碎后用65-75%乙醇热回流提取,提取液上30-60目聚酰胺柱,经水洗脱无色后,继用65-75%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇可得到用于中药新药研究的原料药,采用紫外分光光度法测定其浸膏中总黄酮含量大于50%。本发明提取纯化的刺玫果总黄酮提取物,具有治疗冠心病、心肌缺血、心律不齐及高血脂等疾病的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的提取物及其提取方法和其药物用途。
背景技术
山刺玫(Rosa davurica Pall.),蔷薇科蔷薇属落叶灌木植物,主要分布于我国东北地区,其果实又名刺玫果,野蔷薇果,民间把它作为一种营养丰富的野果,大量采食,制成果酒、泡茶等,刺玫果味微酸,性温。传统医学将刺玫果列为补药,据《中华大辞典》称:刺玫果具有健脾理气、养血调经之功效。现代医学研究发现,刺玫果具有抗衰老、抗疲劳、耐缺氧,增强人体免疫功能作用,长期服用能显著提高人体中SOD含量。果肉内含有丰富的维生素,刺玫果是Vc含量最高的果实之一,还含有生物活性物质齐敦果酸和白桦脂酸。此外,刺玫果中还含有有机酸,黄酮类化合物、香豆素、甾醇类化合物、三萜类化合物、烯烃类、皂甙、挥发油、多种矿物质、微量元素。
刺玫果含有大量的活性物质,其中的黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、降低心肌耗氧量、防治血管硬化、降压、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌等作用。
张振杰,等对刺玫果萃取液进行了研究,发表了刺玫果胶囊的制备方法,并申请了专利,发明名称:刺玫果萃取胶囊,申请号:01109615.2,同时有许多关于刺玫果的研究报道。
国内外有少量有关刺玫果的生态学、活性成分提取、化学成分、药理作用的研究。未见基于醇提热回流法、聚酰胺纯化法,使刺玫果有效部位总黄酮含量>50%的报道;未见有刺玫果有效部位、其提取物中总黄酮含量>50%有抗心肌缺血、降血脂、抗心律失常作用的研究报道。
刺玫果自然资源丰富,药理活性广泛,但开发应用较少。
发明内容
本发明提供一种刺玫果总黄酮提取物及其提取方法和其医药用途,目的之一是提供刺玫果总黄酮提取物,其中总黄酮含量大于50%;目的之二是提供了该刺玫果总黄酮提取物的新的药物用途。
为实现上述发明目的,本发明采取刺玫果总黄酮提取方法如下:
a.将刺玫果干燥粉碎,用6-10倍量65-75%乙醇热回流提取3次,每次5h、3h、1h,过滤,合并提取液;
b.将步骤a得到的提取液上30-60目聚酰胺柱,经水洗至无色后,继用65-75%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇得浸膏,干燥至恒重。
通过采用上述刺玫果总黄酮提取方法,得到的刺玫果总黄酮提取物,其总黄酮含量大于50%,为浅黄色至褐色,粉末状,味苦,可溶于乙醇。
本发明刺玫果总黄酮提取物、其总黄酮含量大于50%在制备治疗冠心病,心肌缺血,高血脂,心律不齐的药物中的应用。
当本发明用于制备治疗冠心病,心肌缺血,高血脂,心律不齐的药物时,其口服或胃肠外给药,均是安全的,在口服情况下,其可以任何常规形式给药,例如散剂、粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片等;当该药肠胃外给药时,可采用任何常规形式,例如注射剂:如静脉内注射、软膏剂、栓剂、经皮给药、吸入剂等。
本发明制备治疗冠心病,高血脂,心肌缺血和心律不齐的药物是由有效部位或有效部位与固体或液体的赋形剂一起构成的,这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的,下面举几个具体例子,散剂是内服的粉末剂,它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁、碳酸氢钠、干燥酵母等;溶液剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等;软膏剂的赋形剂可以使用脂油、含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。
本发明的有益效果是,山刺玫为直立灌木,其果实每年都可以利用,资源非常丰富,经过研究发现刺玫果中含总黄酮达27%-30%之多,刺玫果提取物中总黄酮含量大于50%的提取、精制方法未见报道,其治疗冠心病,高血脂,心肌缺血和心律不齐的药物用途属首次发现。刺玫果总黄酮提取物、其总黄酮含量大于50%的特征为浅黄色至褐色,粉末状,味苦,可溶于乙醇。
有效物质的剂量可以根据服用方式,病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变,口服量为:100-200mg/次,每日2-3次服用;注射80-120mg/次,每日2-3次。
具体实施方式
实施例1:
a.将刺玫果干燥粉碎,用6倍量75%乙醇热回流提取3次,每次5h、3h、1h,过滤,合并提取液;
b.将步骤a得到的提取液上30目聚酰胺柱,经水洗至无色后,继用75%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇得浸膏,干燥至恒重。
实施例2:
a.将刺玫果干燥粉碎,用8倍量70%乙醇热回流提取3次,每次5h、3h、1h,过滤,合并提取液;
b.将步骤a得到的提取液上45目聚酰胺柱,经水洗至无色后,继用70%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇得浸膏,干燥至恒重。
实施例3:
a.将刺玫果干燥粉碎,用10倍量65%乙醇热回流提取3次,每次5h、3h、1h,过滤,合并提取液;
b.将步骤a得到的提取液上60目聚酰胺柱,经水洗至无色后,继用65%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇得浸膏,干燥至恒重。
由本发明实施例得到的提取物中总黄酮含量分析方法的实验例:
a对照品溶液的制备精密称取在60℃干燥至恒重的芦丁对照品20.8mg,置于100mL容量瓶中,加60%乙醇适量,超声15min使溶解,放冷,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得:每1mL含无水芦丁0.208mg的芦丁对照品溶液。
b样品溶液的制备取干浸膏样品,研细,取约0.3g,精密称定后置于50mL容量瓶中,加60%乙醇适量,超声使溶解,放冷并稀释至刻度,摇匀,滤过弃去初滤液,精密吸取续滤液10mL,置50mL容量瓶中,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
c检测波长的选择取芦丁对照品溶液、供试品溶液及空白溶液3mL,照分光光度法,在200-600nm之间进行光谱扫描,得芦丁的最大吸收波长为507nm,供试品最大吸收波长为502nm,故选用502nm为检测波长。
d线性关系考察精密量取对照品溶液(0.208mg·mL-1)及60%乙醇(配制空白溶液)1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL,分别置25mL容量瓶中各加60%乙醇10mL,摇匀,按C项下的测定方法,在502nm波长处测定吸收度。以浓度(C)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线,进行线性回归,得回归方程:A=10.489C+0.0001,R=0.9995。结果表明芦丁在8.32-49.92μg.mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。
e测定方法精密量取供试品溶液3mL,分别选自实施例1、实施例2和实施例3,置25mL容量瓶中,加入60%的乙醇10mL,摇匀,精密加入5%的亚硝酸钠溶液0.5mL,摇匀,放置6min,加入10%的硝酸铝溶液0.5mL,摇匀,放置6min,加入4%的氢氧化钠溶液5mL,然后加入60%的乙醇稀释至刻度,摇匀,放置10min,于502nm处测定吸光值,根据标准曲线计算其浓度,分别为56%、80%和68%。
本发明疗效可通过下面的药效学实验进一步说明。刺玫果总黄酮提取物、其中总黄酮含量大于50%,以下简称DRFFE。
实验例1、DRFFE抗大鼠心肌缺血实验
一、实验材料
1、动物Wistar大鼠,雌雄各半,体重220-260g,动物合格证号:SCXK-(吉)2007-0003,由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
2、药品及试剂DRFFE和刺玫果总黄酮粗提物(总黄酮含量为27%)均由吉林化工学院提供,黄褐色粉末状,用生理盐水配制成混悬液;生化试剂盒激酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)由中生北控生物科技股份有限公司生产,批号:090301.200912、090511.200911、090641.200912;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)由南京建成生物工程研究所生产,批号:20100408、20100408;红四氮唑(TTC),分析纯,上海惠世生化试剂有限公司生产,批号:100708;山玫胶囊,承德御室金丹药业有限公司生产,批号:100402;氯化钠注射液,哈尔滨三联药业有限公司生产,批号:100514B1;乙醚,分析纯,天津市北联精细化学品开发有限公司生产,批号:208。
3、仪器EOS-880半自动生化分析仪,意大利生产;UV-755B紫外分光光度计由上海精密科学仪器有限公司生产;BI-2000图像分析仪,成都泰盟科技有限公司生产。
二、实验方法
1、分组及给药剂量实验大鼠随机分为7组,每组12只。假手术对照组给予氯化钠溶液(生理盐水)10ml/kg;模型对照组给予生理盐水10ml/kg;阳性对照组给予山玫胶囊220mg/kg(2.2%);DRFFE小剂量组35mg/kg(0.35%,);DRFFE中剂量组70mg/kg(0.7%);DRFFE大剂量组140mg/kg(1.4%);刺玫果粗提物组140mg/kg(1.4%)。连续给药6d。于末次给药30min,制备心肌缺血模型。
2、手术操作方法大鼠乙醚全身麻醉,行开胸手术,采取冠状动脉前降支结扎24小时,造成心肌缺血模型。24小时后进行股动脉取血,离心取血清待测生化指标(CK、LDH、AST、SOD、MDA);开胸术取心脏剪除右心室,将左心室切心肌片5片,用TTC溶液染色1-3min,用BI-2000图像分析仪照相、测量心肌梗塞面积,计算心肌梗塞面积占左心室百分率。剪取冠脉结扎线下方小块心肌组织放入10%福尔马林溶液中固定,待做光学显微镜病理学检查。
三、实验结果
1、对心肌缺血大鼠血清酶含量的影响
CK:模型组血清CK含量与假手术组比较明显升高,有显著性差异,P<0.05;DRFFE大剂量组、刺玫果粗提物组与模型组比较,CK含量明显降低,有显著性差异,P<0.05;DRFFE小剂量组、中剂量组以及阳性药组与模型组比较,血清CK含量虽然有下降趋势,但统计学无明显差异,P>0.05,见表1。
LDH:模型组血清LDH含量与假手术组比较明显升高,有显著性差异,P<0.05;DRFFE大剂量组、刺玫果粗提物组以及阳性药组与模型组比较,LDH含量明显降低,有显著性差异,P<0.05;DRFFE小剂量组、中剂量组LDH含量虽然有下降趋势,但与模型组比较无明显差异,无统计学意义,P>0.05,见表1。
AST:模型组血清AST含量与假手术组比较明显升高,有统计学意义,P<0.05;DRFFE中剂量组、大剂量组与模型组比较,AST血清含量明显降低,有显著性差异,P<0.05;DRFFE小剂量组、刺玫果粗提物以及阳性药组与模型组比较,AST含量虽然有下降趋势,但与模型组比较均无明显差异,无统计学意义,P>0.05,见表1。
与假手术组比较#P<0.05与模型组比较*P<0.05**P<0.01
2、对心肌缺血大鼠血清SOD、MDA活性的影响
模型组血清SOD活性明显低于假手术组,而MDA含量明显高于假手术组,均有统计学意义,P<0.05;DRFFE小、中、大3个剂量组,刺玫果粗提物组以及阳性药组与模型组比较,血清SOD、MDA含量无明显差异,均无统计学意义,P>0.05,见表2。
与假手术组比较#P<0.05
3、对心肌缺血大鼠心肌梗塞面积的影响
模型组大鼠心肌梗塞面积明显大于假手术组,制备心肌缺血模型成功,有显著性统计学意义,P<0.001;DRFFE中剂量组、大剂量组与模型组比较,心肌梗塞面积明显小于模型组,有显著性差异,P<0.05;但DRFFE小剂量组、刺玫果粗提物以及阳性药组与模型组比较,心肌梗塞面积虽然有减少趋势,但统计学无明显差异,P>0.05,见表3。
与假手术组比较###P<0.001 与模型组比较*P<0.05
四、实验结论
1、DRFFE能降低实验性心肌缺血时释放的心肌三酶血清含量,减轻心肌组织损伤;
2、DRFFE高、中剂量组均能减少实验性心肌缺血导致的心肌梗塞面积,对心脏有保护作用;
3、DRFFE高、中剂量组对血清自由基(SOD、MDA)含量无明显影响;
4、DRFFE用做心脑血管治疗药物时,与阳性药比较,可降低用药剂量。
5、DRFFE与刺玫果粗提物相比,刺玫果粗提物只显示对血清酶CK、LDH有显著降低作用,而不具有DRFFE其它作用。
实验例2、DRFFE预防和治疗高血脂症的试验
一、材料与方法
1.1动物SD大鼠40只,雌雄各半,体重120-140g,由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.2药物刺玫果总黄酮提取物,总黄酮含量大于50%,简称,DRFFE:由吉林化工学院自制;阳性对照药:月见草油,白求恩医科大学制药厂生产。胆固醇粉(AR),上海市食品公司制药厂出品。
1.3高脂饲料及各种含药高脂饲料的配制
高脂饲料的配制:基础饲料100g中加入胆固醇0.4g,猪油2mL,在高脂饲料基础上加入不同含量的药物配制成含药的高脂饲料供实验室喂养。
二、对正常大鼠血脂水平的影响取大鼠40只,雌雄各半,禁食给水12h,称体质量,随机分为4组(各10只):正常对照组(生理盐水,1mL/100g)、阳性对照组(月见草油1.3g/100g)、刺玫果总黄酮提取物大剂量组(140mg/kg)和小剂量组(70g/kg),上述药物均灌胃(ig)给药,每日1次,共15d,实验过程中每周称体重1次,第16天摘除大鼠眼球,眼眶取血2-3mL,送生化检验,测血清中的TG和TC含量。
三、刺玫果总黄酮提取物(DRFFE)降血脂试验结果,试验结果见表4。
表4刺玫果总黄酮提取物(DRFFE)降血脂试验结果
与对照组比较#P<0.05
四、实验结论
实验结果表明,刺玫果总黄酮提取物(DRFFE)提取物有明显的降血脂作用。
实验例3、DRFFE抗心律失常的试验
一、实验材料
1.1实验动物:Wistar大鼠25只,体重230g±10g,雌雄兼用,吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。合格证号:SCXK-(吉)2007-0003。
1.2实验药品:氯化钡(天津市化学试剂三厂,AR);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司,AR);心得安片(盐酸普萘洛尔片)山西运鹏制药有限公司,批号:B090401;DRFFE:由吉林化工学院提供。
1.3仪器:日本光电公司RM-6000多导记录仪。
二、实验方法
Wistar大鼠25只,随机分为5组,每组5只。各组动物分别上午灌胃给药一次,给药体积5ml/kg。模型组给予等体积生理盐水,阳性药心得安组10mg/kg,DRFFE小、中、大剂量组剂量分别为40,80,160mg/kg。连续灌胃给药5天。于末次给药后1.0h用10%水合氯醛溶液麻醉,300mg/kg,ip;四肢连接ECG电极,用RM-6000多导记录仪记录标准II导联正常ECG。然后给予氯化钡3mg/kg(0.3%)舌下静脉快速注射给药,注射速度为5s,给药体积1ml/kg,诱发心律失常模型。记录20min各组动物心电图,计算室性心律失常的发生时间和持续时间。
实验数据以x±s表示,所有实验组数据与模型组比较,进行组间t检验统计学处理。
三、实验结果
模型组给予iv氯化钡后,多数即刻发生双相性室性心律失常,并且持续时间长;DRFFE中剂量组能明显缩短氯化钡诱发的室性心律失常持续时间,与模型组比较差异显著,p<0.05。其心律失常发生时间虽迟于模型组,但无统计学意义,p>0.05;DRFFE小剂量、大剂量组的心律失常发生时间和持续时间与模型组比较无显著性差异,p>0.05;阳性药心得安组1只动物发生心律失常,与模型组比较其发生时间及持续时间差异非常显著,p<0.01;p<0.001,见表5。
表5DRFFE对氯化钡致心律失常的影响(n=5,x±s)
*与模型组比较*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001
四、实验结论
DRFFE能明显缩短氯化钡诱发的大鼠室性心律失常持续时间。
Claims (1)
1.刺玫果总黄酮提取物在制备抗心律失常的药物中的应用,所述的刺玫果总黄酮提取物是由下述方法制备得到的:
a.将刺玫果干燥粉碎,用6-10倍量65-75%乙醇热回流提取3次,每次5h、3h、1h,过滤,合并提取液;
b.将步骤a得到的提取液上30-60目聚酰胺柱,经水洗至无色后,继用65-75%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇得浸膏,干澡至恒重;
其总黄酮含量大于50%。
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