CN104435034A - 一种三七总皂苷及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物学效果更好、纯度更高的三七总皂苷及其制备方法。三七药材经乙醇提取，减压浓缩，上大孔树脂，收集洗脱液，干燥后进一步经MCI树脂纯化，得精制三七总皂苷，五种单体皂苷R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量达95％以上，R1含量不少于7％、Rg1含量不少于35％、Re含量不少于3.5％、Rb1含量不少于42％、Rd含量不少于7％，各组分比例符合药典注射用三七总皂苷的药用标准。本发明方法所得三七总皂苷纯度高、生物活性高且易于产业化。

Description

一种三七总皂苷及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地说，本发明提供了一种具有治疗心脑血管疾病的三七总皂苷活性成分组合物及其制备方法和应用。

背景技术

心脑血管疾病是威胁人类生命和健康的最主要的疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。根据近年来的资料统计，我国每年心脑血管疾病死亡者占死亡病因的半数左右。心脑血管疾病的流行，与社会的发展和生活水平的提高紧密相关，心理压力过大、饮食结构不合理、缺乏运动、过量抽烟饮酒、肥胖等都是心脑血管疾病发病的诱因。心脑血管疾病包括冠心病、心绞痛、心肌梗塞、癖血型肺心病。缺血性脑病、脑血栓、高血压、高血脂等，这些疾病的主要发病原因是动脉硬化造成管腔狭窄、管道阻塞，从而导致脑供血不足，才引起头沉、头晕、头痛、胸闷等症状，严重者可导致脑中风及心肌梗塞的发生，心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超载、自由基损伤等多种变化。因此心脑血管疾病严重危害着我国人民的健康，对其早期的预防、及时治疗有着极其重要的意义。近年来，中药在治疗心脑血管疾病方面已经显示出了独特的优越性，中药疗效确切、持久、不良反应少，尤其以远期疗效满意而广泛应用于临床。大量的研究结果和临床实践证明，中药以其耐受性较好、毒副作用小等特点显示出其具有独特的优势，适合患者长期服用。

三七总皂苷为五加科人参属植物三七的主要有效活性成份，含有多种单体皂苷，其中所含人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1较多。研究资料证实，三七总皂苷具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝聚、延长凝血时间、降血脂、清除氧自由基、抗炎、抗氧化等作用。人参皂苷Rg1具有有效改善血液循环的血流动力学，降低血液粘度，降血脂，美容等功效。人参皂苷Rb1具有抗脂质过氧化作用，对脂质过氧化和超氧阴离子的产生均有抑制作用，同时还能增强肝脏抗氧化酶的活性；人参皂苷Rb1是人参促智作用的重要有效成份，对记忆的获得和再现过程有易化作用。

目前，从三七中精制总皂苷的工艺有一些报道和文献，但总体而言，主要问题是产品纯度不高或工艺不适于工业化生产。目前常用的三七总皂苷的生产纯化工艺主要是柱色谱法，有硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及大孔吸附树脂。硅胶柱色谱与凝胶柱色谱法可纯化得到高纯度的皂苷成分，但其操作复杂，费用高，不适合工艺化生产。大孔吸附树脂是目前工业化生产纯化三七总皂苷的普遍方法，但单一大孔树脂用于分离纯化总皂苷所得物含量不是很高。目前市场上三七总皂苷含量最高为85％，也有工艺报道含量能达到95％，虽然皂苷总量能达到95％但与三七药材中各组分比例发生了很大变化，药典中也将各组分的最低含量进行了控制，单纯提高含量生物活性不能保证。

涉及三七总皂苷的专利申请也较多。CN101829170A涉及一种三七总皂苷提取物及其制备方法，该提取物主要包括三七皂苷R1和人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的总含量占三七总皂苷提取物的重量百分比80％以上，从其具体实施分析可知，如想实现三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的总含量占三七总皂苷提取物的重量百分比90％以上，需要使用反向制备液相，制备成本相当高，不适合工业化生产；CN101697989A提供了一种采用D型大孔树脂柱吸附洗脱制备的三七总皂苷组合物，其中三七皂苷R1含量大于8.0％、人参皂苷Rg1含量大于25％、人参皂苷Re含量大于4.0％、人参皂苷Rb1含量大于25％，且三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re与人参皂苷Rb1的总重量不低于活性成份重量75％、85％或90％，三七总皂苷的纯度有待进一步提高；CN1857352A提供了一种三七总皂苷组合物，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re与人参皂苷Rb1的总量不低于55％，且人参皂苷Rd含量不得超过2.5％，该申请主要是通过对Rd的含量进行限制从而减少相关注射液的不良反应，但是该方法以牺牲三七总皂苷的整体药效为代价，不适合在相关口服制剂中使用；CN1919222A提供了一种三七皂苷的制备方法，该法制备的三七总皂苷中R1含量为2％～10％，人参皂苷Re含量为2～6％，人参皂苷Rg1含量为15％～40％，人参皂苷Rb1含量为15％～40％，人参皂苷Rd含量为5％～12％，其总皂苷含量在80％以上，该法的主要问题是产品纯度不高。

MCI树脂是近年最近几年日本三菱化学在Diaion和Sepabeads大孔树脂的基础上设计的新型树脂，粒径只有75-150微米，较小的颗粒有更高的色谱分离性能，用于分离天然产物有独特的效果，本申请发明人在研究发现，该树脂对三七总皂苷有独特的选择性吸附，其再生简单，可重复使用，减少成本，工艺重复性极佳。运用这一新的填料在三七总皂苷的纯化工艺中，极大的提高了精制后的三七总皂苷含量与生物活性。

发明内容

本发明一个目的是提供一种三七总皂苷的制备方法。

本发明的另一个目的提供一种高纯度三七总皂苷组合物。

本发明的第三个目的是提供三七总皂苷在制备治疗心脑血管疾病药物中的用途。

本发明是通过如下技术方案予以实施。

三七总皂苷的制备方法，包含如下步骤：

(1)三七药材经粉碎，加0-95％乙醇提取，浓缩提取液；

(2)步骤(1)所述提取液上大孔树脂，经水洗除杂，5-30％乙醇除杂，40-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得浓缩液；

(3)步骤(2)所述浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经水洗除杂，5-30％乙醇除杂，40-80％乙醇洗脱，收集洗脱液；

(4)步骤(3)所述洗脱液加入活性炭脱色，过滤，浓缩，干燥，得精制三七总皂苷。

其中，步骤(1)所述的乙醇提取可以是渗漉、冷浸、回流提取；步骤(2)所述大孔树脂选自D101、AB-8、ADS-17、HPD-600、SP825、LX-60中的一种。

本发明优选的技术方案是步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)所述的浓缩优选减压浓缩；步骤(1)所述的乙醇提取的乙醇浓度优选40-80％；步骤(2)和步骤(3)中所述乙醇除杂的乙醇浓度优选10-20％，乙醇体积优选2-10柱体积；步骤(2)和步骤(3)中所述乙醇洗脱的乙醇浓度优选50-70％，乙醇体积优选2-10柱体积；步骤(1)所述的提取液浓缩至在50℃条件下相对密度为1.05-1.10；步骤(2)所述的浓缩液在50℃条件下相对密度为1.05-1.10；步骤(4)所述的活性炭脱色，活性炭加入量为三七药材重量的0.01-0.1倍。

另外，本发明提供了一种由上述制备方法制备的治疗心脑血管疾病的三七总皂苷组合物，其特征在于活性成分由三七提取的三七总皂苷活性成份组成，其中三七皂苷R1含量不少于7％、人参皂苷Rg1含量不少于35％、人参皂苷Re含量不少于3.5％、人参皂苷Rb1含量不少于42％、人参皂苷Rd含量不少于7％，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的总重量不低于活性成分总重量的95％。

本发明还提供了一种本发明三七总皂苷组合物在制备治疗心脑血管药物中的应用。

本发明最后提供了一种三七总皂苷组合物制备的制剂，该制剂是由本发明三七总皂苷组合物和至少一种药学上可接受的辅料制备成液体制剂、固体和半固体制剂、气体制剂。其中，所述液体制剂包括口服液、混悬液、糖浆、注射液、药酒、酊剂，所述的固体和半固体制剂包括片剂、丸剂、膏剂、丹剂、散剂、颗粒剂、栓剂、粉剂、乳剂、咀嚼剂和胶囊剂，所述的气体制剂包括气雾剂和吸入剂。

本发明技术方案优点：所用MCI树脂可重复使用节约成本，且所用树脂类型经生产放大后工艺重现性良好，适合工业化生产。所得三七总皂苷组合物中五种单体皂苷R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量达95％以上，且各组分比例与天然三七药材活性成分比例相同，与药典中三七总皂苷各组分的比例也相同，生物活性高，稳定性好。

上述三七总皂苷的含量测定，参照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相A：乙腈，流动相B：水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为(色谱柱为4.6mm×150mm，5μm)1.0ml；检测波长203nm，柱温25℃。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5。理论板数按人参皂苷Rg1计应不低于6000。

对照提取物溶液的制备：精密称取减压干燥12小时以上的三七总皂苷对照提取物适量，加70％甲醇溶解并稀释制成每1ml含2.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

附图说明

图1：实施例2三七皂苷组合物高效液相色谱图，其中三七皂苷R1的保留时间19.637、人参皂苷Rg1的保留时间为26.593、人参皂苷Re的保留时间为27.203、人参皂苷Rb1的保留时间为37.413、Rd的保留时间为40.890。

具体实施方案

下述是结合具体实施例和实验例，进一步阐述本发明。但这些实施例和实验例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例和实验例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

第一部分：三七总皂苷组合物制备方法

实施例1

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加5倍量40％乙醇回流提取三次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上D101大孔树脂，经2柱体积纯化水水洗除杂、2柱体积5％乙醇除杂，收集2柱体积40％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经2柱体积纯化水水洗除杂、2柱体积5％乙醇除杂，收集2柱体积40％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入10g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.0％、人参皂苷Rg1含量为35.3％、人参皂苷Re含量为4.4％、人参皂苷Rb1含量为42.0％、人参皂苷Rd含量为7.0％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为95.7％，各组分含量均符合标准。

实施例2

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加6倍量50％乙醇回流提取三次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上AB-8大孔树脂，经5柱体积纯化水水洗除杂、5柱体积10％乙醇除杂，收集5柱体积50％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经8柱体积纯化水水洗除杂、8柱体积10％乙醇除杂，收集8柱体积60％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入80g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.6％、人参皂苷Rg1含量为35.5％、人参皂苷Re含量为4.9％、人参皂苷Rb1含量为42.7％、人参皂苷Rd含量为7.8％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为98.5％，各组分含量均符合标准。

实施例3

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加15倍量70％乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上SP825大孔树脂，经5柱体积纯化水水洗除杂、4柱体积20％乙醇除杂，收集4柱体积60％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经10柱体积纯化水水洗除杂、10柱体积20％乙醇除杂，收集6柱体积50％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入100g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.3％、人参皂苷Rg1含量为35.8％、人参皂苷Re含量为4.8％、人参皂苷Rb1含量为42.4％、人参皂苷Rd含量为8.1％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为98.4％，各组分含量均符合标准。

实施例4

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加24倍量80％乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上ADS-17大孔树脂，经10柱体积纯化水水洗除杂、10柱体积30％乙醇除杂，收集6柱体积70％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经5柱体积纯化水水洗除杂、10柱体积30％乙醇除杂，收集10柱体积60％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入70g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.1％、人参皂苷Rg1含量为36.1％、人参皂苷Re含量为4.2％、人参皂苷Rb1含量为42.8％、人参皂苷Rd含量为7.7％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为97.9％，各组分含量均符合标准。

实施例5

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加8倍量水回流提取三次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上HPD-600大孔树脂，经7柱体积纯化水水洗除杂、7柱体积10％乙醇除杂，收集2柱体积70％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经7柱体积纯化水水洗除杂、7柱体积10％乙醇除杂，收集7柱体积70％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入60g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.4％、人参皂苷Rg1含量为35.7％、人参皂苷Re含量为4.1％、人参皂苷Rb1含量为42.6％、人参皂苷Rd含量为7.9％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为97.7％，各组分含量均符合标准。

实施例6

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加15倍量95％乙醇冷浸提取，每次8小时，过滤，合并提取液减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上LX-60大孔树脂，经4柱体积纯化水水洗除杂、4柱体积20％乙醇除杂，收集4柱体积80％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经4柱体积纯化水水洗除杂、4柱体积20％乙醇除杂，收集10柱体积80％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入30g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为7.8％、人参皂苷Rg1含量为35.5％、人参皂苷Re含量为4.3％、人参皂苷Rb1含量为42.9％、人参皂苷Rd含量为7.0％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为97.4％，各组分含量均符合标准。

实施例7

三七药材1kg粉碎成粗粉，过筛，加15倍量60％乙醇冷浸提取，每次8小时，过滤，合并提取液减压浓缩至密度1.05-1.10(50℃)。提取液上HPD-600大孔树脂，经7柱体积纯化水水洗除杂、7柱体积20％乙醇除杂，收集7柱体积60％乙醇活性成分洗脱液，减压浓缩至相对密度1.05-1.10(50℃)。将浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经7柱体积纯化水水洗除杂、7柱体积20％乙醇除杂，收集7柱体积40％乙醇活性成分洗脱液。将洗脱液加入30g活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，得精制三七总皂苷。经测定三七皂苷R1含量为8.2％、人参皂苷Rg1含量为35.0％、人参皂苷Re含量为5.1％、人参皂苷Rb1含量为42.4％、人参皂苷Rd含量为7.4％，R1、Rg1、Re、Rb1、Rd总量为98.1％，各组分含量均符合标准。

第二部分 药效学实验

试验例1 对实验性大鼠缺血心肌的保护作用

1.实验材料

健康雄性Wastar大鼠，体重180～220g，清洁级，由维通利华动物实验中心提供。

本发明三七总皂苷组合物(自制)；对比例1(按专利CN101697989A实施例1公开的方法制备)；对比例2(按专利CN1919222A实施例2公开的方法制备)；对比例3(按专利CN1857352A实施例1公开的方法制备)；对比例4(按专利CN101829170A的实施例1的方法制备三七三醇组皂苷和三七二醇组皂苷，并按1:1的重量比混合)；对比例5(市售三七总皂苷，R1：Rg1：Rb为11:38:21，总含量为78.6％)。

试剂：乌拉坦、盐酸异丙肾上腺素、氯化钠注射液、CK、CK-MB试剂盒。

仪器：生理记录仪BL-420生理信号采集系统、离心机、半自动生化分析仪。

2.试验方法

a)分组及模型制备：

试验用药前各组大鼠先做心电图检查，弃去S-T段、T波有异常改变者和心率失常者，将大鼠随机分为空白对照和造模组，每组10只，每天分别灌胃：生理盐水、本发明三七总皂苷组合物(实施例1、实施例3、实施例5，20mg/kg/d)、对比例1(20mg/kg/d)、对比例2(20mg/kg/d)、对比例3(20mg/kg/d)、对比例4(20mg/kg/d)、对比例5(20mg/kg/d)，连续给药10天，于第10天灌药后3min，按照如下方法造模：将各组大鼠用20％乌拉坦5ml/kg腹腔注射浅麻醉后，背位固定，皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素，正常对照组给予等容量的生理盐水，连接心电图机，走纸速度50cm/s，标准电压10mm/mv，记录成膜后心电图变化。导联心电图，观察ST段的改变。具备以下条件之一者判断为心肌缺血阳性：1)S-T段水平向下或向上偏移≥0.1mv；2)T波高耸超过同导联R波的1/2；3)T波高耸伴S-T段移位。阴性判断标准：1)S-T段斜形偏移，或水平偏移<0.1mv；2)T波低平或双向倒置。以模型组大鼠心电图ST段抬高≥0.1mv作为造模成功的标志。

b)实验方法：

连续给药10天，于末次灌药后30min造模，造模前、造模后即刻、5min、10min、20min、30min时用生理记录仪导联心电图，并在6h后采血，离心取血清检测CK、CK-MB。

c)统计分析：

实验数据用均数±标准差表示，以t检验作统计学处理。

3结果

a)对J点位移的影响

本发明三七总皂苷组合物组与空白组比较有非常显著性差异；与模型组比较，在不同时间对J点位移有显著下降作用，且本发明三七总皂苷组合物的作用好于各对比例组。见表1。

表1 本发明三七总皂苷组合物对大鼠J点位移的影响

注：与模型组相比*P<0.05；**P<0.01

b)对异丙肾上腺素所致急性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB的影响

与空白组比较，本发明三七总皂苷组合物有非常显著性差异；与模型组比较，造模6h后，可使CK、CK-MB明显减少；与对比例组比较，本发明组合物的效果更好。表明本发明三七总皂苷组合物对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血损伤具有更好的保护作用。见表2。

表2 对异丙肾上腺素所致急性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB的影响

注：与模型组相比*P<0.05；**P<0.01

试验例2 对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

1.实验材料

健康SD大鼠，体重230～280g，清洁级，由维通利华动物实验中心提供。

本发明三七总皂苷组合物(自制)；对比例1(按专利CN101697989A实施例1公开的方法制备)；对比例2(按专利CN1919222A实施例2公开的方法制备)；对比例3(按专利CN1857352A实施例1公开的方法制备)；对比例4(按专利CN101829170A的实施例1的方法制备三七三醇组皂苷和三七二醇组皂苷，并按1:1的重量比混合)；对比例5(市售三七总皂苷，R1：Rg1：Rb为11:38:21，总含量为78.6％)。

试剂：氯代三苯基四氮唑、多聚甲醛、水合氯醛。

仪器：激光多普勒血流仪。

2.实验方法

a)分组及给药方法：

大鼠随机分为假手术组、模型对照组、本发明组合物组、对比例组。于手术前3d开始每天一次各组分别尾静脉注射给药，造模前0.5h进行第三次给药，造模后6h和12h分别进行第四、五次给药，及总共给药五次。模型组和假手术组大鼠给予注射生理盐水。

b)模型制备：

取0.235mm尼龙鱼线，截作每段8cm左右，头端0.5mm加热成光滑的球形，据插入端10mm、18mm、20mm三处分别用信号笔做标记，酒精清洁后置生理盐水中备用。将大鼠用10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，颈部正中切口，分离左侧总动脉、颈外动脉和颈内动脉，并分离翼腭动脉。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉近分叉处切口，插入栓线，避开翼突额动脉，插至大脑中动脉稍感阻力即可，其深度为17-20mm，动脉外用手术线绑扎固定，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。伤口和腹腔均注入少量抗生素后，缝合皮肤，回笼饲养。造模成功的标准：术后24h，每只取手术侧脑小片进行染色，变白色者为造模成功；动物手术后有明显手术侧Homer症及手术侧偏瘫体征。

检测指标：

1)脑含水量测定：造模24小时，快速断头取鼠大脑。取左侧半脑后半部分分别称湿重，置120℃烤箱烘干至恒重，按下列公式计算脑组织含水量：

脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％

2)脑组织匀浆测定超氧化物歧化酶、丙二醛的含量

脑组织匀浆液的制备：迅速断头取脑，取左侧半脑前小部分放于液氮中保存待测。从液氮中取出半脑称取100mg，置于9倍生理盐水中，用研磨器于冰块上研磨，制成100％(W/V)闹匀浆液，3500r/min，离心10min。

检测方法：MDA测定采用硫代巴比妥酸法；SOD活力检测采用黄嘌呤氧化法。

3)脑梗塞范围的测定：造模后24h大鼠，快速取全脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冰冻25min。然后行冠状切面取大脑中间一片，迅速置1％红四氮唑中，避光，37℃温孵20min，期间每隔7-8min翻动一次，染色后以4％多聚甲醛固定。染色结果：正常组织呈红色，损伤梗死组织呈白色。以称重法计算脑梗塞面积百分比。

3.结果

本发明三七总皂苷组合物组与模型组比较，脑含水量均明显下降，具有统计学意义(P<0.05)。脑组织中丙二醛含量明显降低，超氧化物歧化酶活性升高，脑梗死面积明显减少。本发明组合物组差异非常显著(P<0.01)，而对比例组显示有差异(P<0.05)。说明本发明三七总皂苷组合物对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用优于对比例组。见表3。

表3 本发明组合物对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

注：与模型组相比*P<0.05；**P<0.01

试验例3 降血脂实验

1.实验材料

昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由维通利华动物实验中心提供。

本发明三七总皂苷组合物(自制)；对比例1(按专利CN101697989A实施例1公开的方法制备)；对比例2(按专利CN1919222A实施例2公开的方法制备)；对比例3(按专利CN1857352A实施例1公开的方法制备)；对比例4(按专利CN101829170A的实施例1的方法制备三七三醇组皂苷和三七二醇组皂苷，并按1:1的重量比混合)；对比例5(市售三七总皂苷，R1：Rg1：Rb为11:38:21，总含量为78.6％)。

试剂：总胆固醇(TC)测试试剂盒；甘油三脂(TG)测定试剂盒。

仪器：B-260型恒温水浴锅；TDL 80-2B型低速离心机；THER-MO LABSYSTEM MK3型酶标仪。

2.试验方法

取昆明种小鼠，按体重随机分为正常对照组(16只)、高脂模型组(16只)、本发明组合物组(每组10只)、对比例组(每组10只)，每组雌雄各半。正常对照组喂普通饲料，其余3组饲喂高脂饲料(配方为：77.5％基础饲料，2％胆固醇，10％猪油，10％蛋黄粉，0.5％去氧胆酸钠)。小鼠每周称体重一次，喂养5周。5周后，随机取正常对照组和高脂模型组雌雄动物各3只，摘取眼球取血，测定血清TC、TG。正常对照组的血清TC、TG均低于高脂模型组，数据差异显著，提示小鼠的高脂血症模型已经形成，该批小鼠可用于正式试验。随后给各组小鼠等体积灌胃给药。各组药物均用1％羧甲基纤维素钠制成混悬液。给药3周后，各组动物均禁食12h，称重，摘取眼球取血，血液样品3000rpm离心10min，分离血清，按照总胆固醇和甘油三酯试剂盒说明书操作，测定TC、TG。所得数据用SPSS10.0统计软件进行统计，数据以表示。

3.结果

a)各组药物对高血脂症小鼠体重增长的影响

实验开始时各组小鼠体重均在18-20g左右，经过5周的高脂饲料造模，各组小鼠的体重变化不一(见表4)。可以看出：高脂模型组、本发明组合物组、对比例组的体重变化与正常对照组相比，均有明显增大，给药3周后，模型组体重升至最高，提示高脂模型组的保持，本发明组合物组和对比例组均能明显降低高脂模型组动物的体重。且本发明三七总皂苷组合物组体降低体重的效果最好。见表4。

表4 本发明中药组合物对体重变化表(g)

注：与模型组相比*P<0.05

b)各组药物对高血脂症小鼠血清TC、TG的影响结果

给药3周后，测定各组小鼠血清的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。结果见表5。

表5 本发明三七总皂苷组合物对小鼠血脂水平的影响

注：与模型组相比*P<0.05；**P<0.01

由表5可以看出，高脂模型组的TC、TG水平均比正常对照组明显升高，表明小鼠高脂血症模型造模成功。与模型组相比，本发明三七总皂苷组合物组和对比例组均可明显降低小鼠的TC、TG水平，且本发明三七总皂苷组合物组效果优于对比例组，表明本发明组合物组降血脂作用好于对比例组。

试验例4 降血糖实验

1.实验材料

昆明种小鼠，体重18～22g，雄性，由维通利华动物实验中心提供。

本发明三七总皂苷组合物(自制)；对比例1(按专利CN101697989A实施例1公开的方法制备)；对比例2(按专利CN1919222A实施例2公开的方法制备)；对比例3(按专利CN1857352A实施例1公开的方法制备)；对比例4(按专利CN101829170A的实施例1的方法制备三七三醇组皂苷和三七二醇组皂苷，并按1:1的重量比混合)；对比例5(市售三七总皂苷，R1：Rg1：Rb为11:38:21，总含量为78.6％)。

试剂：四氧嘧啶、胰岛素放射免疫分析药盒。

仪器：血糖/血酮仪及配套试纸、电热恒温水浴锅、电子天平、低速冷冻离心机、放射免疫计数器。

2.试验方法

a)糖尿病模型小鼠的制备：

雄性昆明小鼠适应性饲养1周后，随机抽取10只作为正常对照，其余小鼠禁食(不禁水)24小时后，将四氧嘧啶用生理盐水新鲜配成2％溶液，以200mg/kg剂量腹腔注射，72小时后剪尾取血检测血糖，以血糖在11.1mmol/L以上的小鼠为糖尿病模型小鼠，纳入实验。

b)分组及给药：

取糖尿病模型小鼠随机分组，每组10只。各组血糖值相近，其中1组为模型对照组，3组为本发明组合物组、5组为对比例组。各组小鼠均灌胃相应药物，正常对照组和模型对照组给予相应量的生理盐水，定期称量体重调整给药量，连续21天。

c)指标检测：

实验期间分别于0d、7d、14d、21d剪尾取血检测血糖。口服糖耐量实验在灌胃结束检测血糖后，将小鼠以2.5g/kg剂量灌服葡萄糖，并检测0min、30min、60min、120min血糖。小鼠于第22天眼眶取血，4℃,3000rpm离心10min分离血清，按照试剂盒说明书检测血清胰岛素水平。

实验数据均用SPSS软件进行统计学处理，各项指标结果以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。

3.结果

a)对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖的影响

小鼠腹腔注射四氧嘧啶后，血糖显著升高，给药7d、14d模型组小鼠血糖很高，与正常组比较具有显著性差异，说明四氧嘧啶致糖尿病模型成功，并在试验期间持续高血糖。给药7d后各给药组小鼠血糖开始下降，给药14d后，本发明组合物组小鼠血糖下降明显，与模型组比较有显著性差异。灌胃21d后本发明组合物比较有非常显著性差异(P<0.01)，对比例组有显著性差异(P<0.05)。结果提示本发明组合物具有较好的降血糖作用，且本发明组合物的降血糖效果优于对比例组。

口服糖耐实验表明，本发明三七总皂苷组合物能使实验小鼠糖耐受量有非常明显改善(P<0.01)，对比例组能使实验小鼠糖耐受量有明显改善(P<0.05)。结果提示本发明三七总皂苷的降血糖效果优于对比例组。见表6。

表6 对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01

b)对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血清胰岛素的影响

与正常对照对相比较，模型组小鼠的血清胰岛素水平明显降低，说明腹腔注射四氧嘧啶后，小鼠胰岛β细胞的功能受到破坏，造模成功；与模型对照组比较，本发明三七总皂苷组合物组与对比例组血清胰岛素水平均有不同程度的升高，其中本发明三七总皂苷组合物组具有非常显著性差异，而对比例组具有显著性差异，提示本发明组合物组对提升四氧嘧啶性糖尿病小鼠血清胰岛素的效果优于对比例组。结果见表7。

表7 本发明三七总皂苷组合物对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血清胰岛素的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01

试验例5 抗血栓形成实验

1.实验材料

SD大鼠，体重180.0～220.0g，雌雄兼用，由维通利华动物实验中心提供，动物实验前在动物房内(控制温度)饲养适应一周。

本发明三七总皂苷组合物(自制)；对比例1(按专利CN101697989A实施例1公开的方法制备)；对比例2(按专利CN1919222A实施例2公开的方法制备)；对比例3(按专利CN1857352A实施例1公开的方法制备)；对比例4(按专利CN101829170A的实施例1的方法制备三七三醇组皂苷和三七二醇组皂苷，并按1:1的重量比混合)；对比例5(市售三七总皂苷，R1：Rg1：Rb为11:38:21，总含量为78.6％)。

阿司匹林：白色片剂，50mg/片，中国医药公司上海分公司提供。戊巴比妥钠：白色粉末，中国医药(集团)上海化学试剂公司提供，用生理盐水配制成0.8％水溶液，备用。肝素钠：白色粉末，125u/mg，中国医药(集团)上海化学试剂公司提供，生理盐水配制成0.1％的溶液备用。枸橼酸钠：中国医药工业公司西南制药一厂提供，生理盐水配制成3.8％溶液备用。ADP：Sigma公司生产，pH 7.4磷酸缓冲液配制成200μmol/L浓度溶液备用。

MK4/HC血小板计数仪(美国Baker Instru-ments公司生产)，Labor aggregometer-153型双道血小板聚集仪(德国Labor GmbHHanburg公司生产)

2.试验方法

将大鼠随机分组，每组15只，即空白对照组、阿司匹林组(1％CMC-Na溶液研磨配成0.88mg/mL悬混液，按0.0044g/kg/d)、本发明三七总皂苷组(3组)、对比例组(5组)。空白对照组给同体积生理盐水。每天给药一次，连续7天。

体内血栓形成实验：各组大鼠第7天给药后1h，参照动-静脉旁路血栓形成法【张钧田.现代药理学实验方法.北京：北京医科大学出版社，1998；1216-1217】，用0.8％的戊巴比妥钠40mg/kg剂量腹腔注射麻醉，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。取三段聚乙烯塑料管，中间一段内径为2mm，长约8.5cm，两端的两段塑料管内径为1.5mm，各长10cm。在中段塑料管内放入一根长约7cm预先称重的4号手术丝线，其中一端露出塑料管0.5cm以固定位置，并保持在管中的丝线长度为6.5cm，将肝素钠溶液充满聚乙烯塑料管内，将塑料管的一端插入左侧颈外静脉后，将塑料管的另一端插入右侧颈总动脉，随即立刻开放血流。血流开放20分钟后，立即中断血流并迅速取出中段的丝线，称取丝线的重量，即为总重量。总重量减去丝线的重量即为血栓湿重。按下列公式计算血栓抑制率：

抑制率＝(对照组血栓湿重-实验组血栓湿重)/对照组血栓湿重×100％。将各组血栓湿重进行统计学比较。

血小板聚集抑制试验：在各组大鼠第7天给药1h后，用上述方法麻醉大鼠，颈总动脉插管放血，血液用3.8％枸橼酸钠按1:9比例抗凝，以500转/分离心5分钟，取上部血浆即为富血小板血浆(PRP)，余下部分再次以3500转/分离心15分钟，上清液为贫血小板血浆(PPP)，用血小板计数仪计数PRP血小板，用PPP调节PRP的血小板计数至3×10⁵个/mm²左右。样品管37℃保温3分钟后加入ADP 5μL(终浓度为5μmol/L)，搅拌子转速500r/min，记录加入ADP后的记录笔移动的行距，按下式计算聚集率：

聚集率(％)＝加入ADP的行程×100％/0～100％的行程

计算出各实验组的平均聚集率和标准差，并按下式计算各实验组的血小板聚集抑制率：

聚集抑制率(％)＝(空白对照组聚集率-实验组聚集率)/空白对照组聚集率×100％。

3.结果

a)对实验性血栓形成的影响

各给药组与空白对照组相比，均对血栓形成有明显的抑制作用，其结果见表8

表8 本发明三七总苷组合物对大鼠血栓形成的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01

(2)对血小板聚集性的影响

实验过程中，各组动物所取血样的血小板数均在3×10⁵个/mm²左右，无显著性差异。实验结果见表9。

表9 本发明中药组合物对大鼠血小板聚集率的影响

注：与对照组相比*P<0.05；**P<0.01

由上表可知，各给药组与空白对照组相比，对ADP诱导的大鼠血小板聚集均有明显的抑制作用。其中本发明三七总皂苷组合物组对血小板聚集抑制率(与对照组相比，**P<0.01)超过对比例组(与对照相比，*P<0.05)，提示本发明三七总皂苷组合物在抗血小板聚集方面效果优于对比例组。

Claims (11)

1.一种三七总皂苷的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)三七药材经粉碎，加0-95％乙醇提取，浓缩提取液；

(2)步骤(1)所述提取液上大孔树脂，经水洗除杂，5-30％乙醇除杂，40-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得浓缩液；

(3)步骤(2)所述浓缩液上MCI树脂柱进一步纯化，经水洗除杂，5-30％乙醇除杂，40-80％乙醇洗脱，收集洗脱液；

(4)步骤(3)所述洗脱液加入活性炭脱色，过滤，浓缩，干燥，得精制三七总皂苷。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的乙醇提取可以是渗漉、冷浸、回流提取；步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)所述的浓缩优选减压浓缩；步骤(1)所述的提取液浓缩至在50℃条件下相对密度为1.05-1.10；步骤(2)所述的浓缩液在50℃条件下相对密度为1.05-1.10。

3.根据权利要求1或2的制备方法，其特征在于所述大孔树脂选自D101、AB-8、ADS-17、HPD-600、SP825、LX-60中的一种。

4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的乙醇提取的乙醇浓度优选40-80％。

5.根据权利要求1、2或4的制备方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中所述乙醇除杂的乙醇浓度优选10-20％，乙醇体积优选2-10柱体积。

6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中所述乙醇洗脱的乙醇浓度优选50-70％，乙醇体积优选2-10柱体积。

7.根据权利要求1、2、4或6的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的活性炭脱色，活性炭加入量为三七药材重量的0.01-0.1倍。

8.根据权利要求1-7任意一项的制备方法制备的治疗心脑血管疾病的三七总皂苷组合物，其特征在于活性成分由三七提取的三七总皂苷活性成份组成，其中三七皂苷R1含量不少于7％、人参皂苷Rg1含量不少于35％、人参皂苷Re含量不少于3.5％、人参皂苷Rb1含量不少于42％、人参皂苷Rd含量不少于7％，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的总重量不低于活性成分总重量的95％。

9.权利要求8所述的三七总皂苷组合物在制备治疗心脑血管药物中的应用。

10.根据权利要求8所述的三七总皂苷组合物，其特征在于所述的组合物和至少一种药学上可接受的辅料制备成液体制剂、固体和半固体制剂、气体制剂。

11.根据权利要求10的三七总皂苷组合物，其特征在于所述液体制剂包括口服液、混悬液、糖浆、注射液、药酒、酊剂，所述的固体和半固体制剂包括片剂、丸剂、膏剂、丹剂、散剂、颗粒剂、栓剂、粉剂、乳剂、咀嚼剂和胶囊剂，所述的气体制剂包括气雾剂和吸入剂。