CN115192631A - 一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用 - Google Patents

一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用，属于中药提取技术领域，本发明采用药食同源的肉桂为原料，来源广泛，廉价易得，且安全性好，对人体无毒副作用。本发明的制备方法中，采用大孔树脂对肉桂水提物进行分离纯化，能够有效地提取得到肉桂中的活性成分，工艺简单，提取率高。本发明制备得到的肉桂提取物能够显著抑制PDE5A蛋白，从而具有治疗勃起功能障碍的作用。

Description

一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用
技术领域
本发明属于中药提取技术领域，尤其涉及一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用。
背景技术
勃起功能障碍(ED)是常见的男科疾病之一，ED对患者的生活质量，家庭稳定密切相关，也同样对患者的精神状态有较大的影响，并且ED也是许多其他疾病的早期预警信号。现有技术中，针对勃起功能障碍最有效的治疗药物是西地那非，对多种原因引起的ED临床有效率可达80％，西地那非通过选择性抑制磷酸二酯酶Ⅴ型(PDE5)活性，阻断cGMP而失去活性，从而增强阴茎勃起功能，但有大量报道证明西地那非存在不良反应，长期服用可能会引发不可预知的身体危害。而西地那非药理作用靶点PDE5的研究引起医学界的广泛关注。
肉桂是樟树科植物肉桂的干燥树皮，药食同源，除作为中药材治疗疾病外，还是一种重要的调味品，具有独特芳香气味，且无副作用。肉桂是一种传统中药，具有散寒止痛、活血通经、补火助阳的功效。近年来研究显示，肉桂具有多种药理作用，如具有扩血管作用，对心血管起保护作用；可抑制中枢神经系统，具有镇痛作用；治疗糖尿病的作用。然而，现有的研究没有报道过肉桂提取物对PDE5抑制活性或男性勃起功能障碍的治疗作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种肉桂提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的应用。
本发明还提供了一种肉桂提取物在制备PDE5抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述肉桂提取物的制备方法，包括以下步骤：
将肉桂与水混合，提取，过滤、浓缩滤液，将肉桂水提浓缩液过大孔树脂，依次用水、乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，即得肉桂提取物。
优选的，所述肉桂与水的质量比为1:12～18。
优选的，所述提取方式为煎煮，所述提取次数为1～3次，每次提取时间为1～3h。
优选的，所述肉桂为直径2～3cm的肉桂块。
优选的，所述大孔树脂的型号包括HPD-500、HPD-BJQH、HPD-725或HPD-826。
优选的，所述乙醇溶液的体积百分数50％～70％；所述所述乙醇洗脱液的酒精度为大于0。
优选的，所述乙醇洗脱液的酒精度为小于等于65％。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的肉桂提取物。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种肉桂提取物的制备方法及其肉桂提取物与应用，本发明采用药食同源的肉桂为原料，来源广泛，廉价易得，且安全性好，对人体无毒副作用。本发明的制备方法中，采用大孔树脂对肉桂水提物进行分离纯化，能够有效地提取得到肉桂中的活性成分，工艺简单，提取率高。本发明制备得到的肉桂提取物能够显著抑制PDE5A蛋白，从而治疗勃起功能障碍。
附图说明
图1为空白对照组、实施例1的肉桂水提浓缩物、实施例1的肉桂提取物以及阳性药西地那非组对蛋白PDE5A的调控作用；
图2为空白对照组、实施例1的肉桂水提浓缩物、实施例10的得到的第一段产物、第二段产物、第三段产物、第四段产物以及阳性药西地那非组对蛋白PDE5A的调控作用。
具体实施方式
本发明提供了一种肉桂提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的应用。
在本发明中，所述药物以肉桂提取物为有效成分，所述药物还优选的包括药学上可接受的辅料，如矫味剂、粘合剂、赋形剂等。所述的矫味剂优选的包括阿斯巴甜、蔗糖、单糖浆、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甜菊苷、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、酒石酸中的一种或多种。所述粘合剂优选的包括乙醇、淀粉浆、水、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。所述赋形剂优选的包括硬脂酸镁、乳糖、甘露醇、甘氨酸、葡萄糖、麦芽糖醇、海藻糖、海藻酸钠中的一种或多种。本发明的药物剂型优选的包括片剂、丸剂、膏剂、颗粒剂、溶液剂、胶囊剂、糖浆剂或喷雾剂。所述药物中肉桂提取物的含量优选为0.1％～99％。
本发明还提供了一种肉桂提取物在制备PDE5抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述肉桂提取物的制备方法，包括以下步骤：
将肉桂与水混合，提取，过滤、浓缩滤液，将肉桂水提浓缩液过大孔树脂，依次用水、乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，即得肉桂提取物。
在本发明中，将肉桂与水混合，所述肉桂与水的质量比优选为1:12～18，进一步优选为1:14～16。本发明将肉桂粉碎过筛，在煎煮后出现难以过滤的情况，故舍弃肉桂粉碎过筛的方式，本发明的肉桂优选为直径2～3cm的肉桂块，水提肉桂块后成功计算出固体得率。本发明的混合方式没有特殊限定，只要混合均匀即可，如可选为搅拌、震荡或斡旋。在本发明中，肉桂与水混合均匀后，提取。所述提取方式优选为煎煮，所述提取次数优选为1～3次，进一步优选为2次，每次提取时间优选为1～3h，进一步优选为1.5～2.5h。在本发明中，提取后，过滤、浓缩滤液。所述过滤可选为抽滤、过筛或离心，提取得到的上清液进行浓缩，所述浓缩可采用减压浓缩的方式，浓缩至1.00～1.10g/mL。本发明浓缩滤液得到肉桂水提浓缩液后，过大孔树脂，依次用水、乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，即得肉桂提取物。所述大孔树脂的型号优选的包括HPD-500、HPD-BJQH、HPD-725或HPD-826。本发明用水、乙醇溶液洗脱时，所述水的洗脱量优选为2～6倍柱体积，所述乙醇溶液的洗脱量优选为2～6倍柱体积。本发明采用水洗脱后，除去多糖、果胶、氨基酸等水溶性物质，所述乙醇溶液的体积百分数优选为50％～70％，所述乙醇洗脱液的酒精度优选为大于0，进一步的，所述乙醇洗脱液的酒精度优选为小于等于65％，本发明采用大孔树脂纯化后，能够有效地提取肉桂中的活性成分。本发明收集乙醇洗脱液后，还包括烘干干燥。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的肉桂提取物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，西地那非购自悦康药业集团股份有限公司，生产批号：200701B。SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0006。生理盐水购自北京锐业制药有限公司。胎牛血清为Solarbio产品，批号:C0227。PDE5A兔多克隆抗体购自Proteintech产品，批号：22624-1-AP。
实施例1
一种肉桂提取物的制备方法，步骤如下：
(1)称取100g直径为2.5cm的肉桂块装入3L圆底烧瓶中，加入饮片质量的15倍量水，加热煎煮2h，过300目筛过滤收集滤液，在药渣中加入15倍量水继续煎煮2h，过300目筛过滤，合并滤液，将滤液浓缩至500mL(密度为1.02g/mL)，得到肉桂水提浓缩液；
(2)将型号为HPD-500的大孔树脂按照95％乙醇-水-1N HCl-水-1NNaOH-水-95％乙醇的顺序进行清洗，然后将处理好的大孔树脂装于柱中，装柱体积为120mL，将步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液静置除杂后，所得滤液沿着柱壁缓慢倒入柱中，待滤液走完后，分别用5倍柱体积的水、5倍柱体积的70％乙醇洗涤滤液，收集酒精度大于0的洗脱液，浓缩干燥，得到肉桂提取物。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例是分别用2倍柱体积的水、2倍柱体积的70％乙醇洗涤滤液，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例5的区别在于，本实施例是分别用2倍柱体积的水、2倍柱体积的50％乙醇洗涤滤液，其余步骤与实施例5相同。
实施例4
本实施例与实施例5的区别在于，本实施例是分别用2倍柱体积的水、2倍柱体积的60％乙醇洗涤滤液，其余步骤与实施例5相同。
实施例5
本实施例与实施例2的区别在于，所述的大孔树脂型号为HPD-BJQH，其余步骤与实施例2相同。
实施例6
本实施例与实施例2的区别在于，所述的大孔树脂型号为HPD-725，其余步骤与实施例2相同。
实施例7
本实施例与实施例2的区别在于，所述的大孔树脂型号为HPD-826，其余步骤与实施例2相同。
实施例8
一种肉桂提取物的制备方法，步骤如下：
(1)称取100g直径为2cm的肉桂块装入3L圆底烧瓶中，加入饮片质量的18倍量水，加热煎煮3h，过300目筛过滤收集滤液，将滤液浓缩至500mL(密度为1.02g/mL)，得到肉桂水提浓缩液；
(2)将型号为HPD-500的大孔树脂按照95％乙醇-水-1N HCl-水-1NNaOH-水-95％乙醇的顺序进行清洗，然后将处理好的大孔树脂装于柱中，装柱体积为120mL，将步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液静置除杂后，所得滤液沿着柱壁缓慢倒入柱中，待滤液走完后，分别用4倍柱体积的水、4倍柱体积的70％乙醇洗涤滤液，收集酒精度大于0的洗脱液，浓缩干燥，得到肉桂提取物。
实施例9
一种肉桂提取物的制备方法，步骤如下：
(1)称取100g直径为3cm的肉桂块装入3L圆底烧瓶中，加入饮片质量的12倍量水，加热煎煮1.5h，过300目筛过滤收集滤液，在药渣中加入15倍量水继续煎煮1h，过300目筛过滤收集滤液，在药渣中加入15倍量水继续煎煮1h，过300目筛过滤收集滤液，合并滤液，将滤液浓缩至500mL(密度为1.02g/mL)，得到肉桂水提浓缩液；
(2)将型号为HPD-500的大孔树脂按照95％乙醇-水-1N HCl-水-1NNaOH-水-95％乙醇的顺序进行清洗，然后将处理好的大孔树脂装于柱中，装柱体积为120mL，将步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液静置除杂后，所得滤液沿着柱壁缓慢倒入柱中，待滤液走完后，分别用5倍柱体积的水、5倍柱体积的70％乙醇洗涤滤液，收集酒精度大于0的洗脱液，浓缩干燥，得到肉桂提取物。
实施例10
一种肉桂提取物的制备方法，步骤如下：
(1)称取10kg直径为2.5cm的肉桂块，加入饮片质量的15倍量水，加热煎煮2h，过滤收集滤液(过300目筛)，继续加入15倍量水将药渣煎煮2h，过滤合并滤液，将滤液浓缩至500mL，得到肉桂水提浓缩液；
(2)将型号为HPD-500的大孔树脂按照95％乙醇-水-1N HCl-水-1NNaOH-水-95％乙醇的顺序进行清洗，然后将处理好的大孔树脂装于柱中，装柱体积为6L，将步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液静置除杂后，所得滤液沿着柱壁缓慢倒入柱中，待药液走完后，先用2倍柱体积的水除去多糖、果胶、氨基酸等水溶性物质，然后用70％乙醇溶液洗脱，监测洗脱液酒精度，待洗脱液酒精度大于0后，收集酒精度为大于0到65％部分的洗脱液6L作为第一段产物，收集酒精度为66％～70％部分的洗脱液3L作为第二段产物，收集酒精度为70％部分的洗脱液9L作为第三段产物，继续收集酒精度为70％部分的洗脱液18L作为第四段产物，分别将每一段洗脱液浓缩干燥，得到肉桂提取物。
实施例11
将实施例1～10任意一项得到的肉桂提取物打粉过20目筛，然后向其中加入1％的阿斯巴甜矫味剂混合研磨均匀，倒入托盘并加适量95％乙醇溶液，制软材，至软材呈现“握之成团，压之即散”状态。过14目筛制粒，置60℃烘箱中干燥，取出，再过18目筛整粒，最后再向其中加入1％的硬脂酸镁，压片成型，每片重约1g，得到肉桂提取物片剂。
对比例1
将肉桂小块打粉，过50目筛，称取100g装入3L圆底烧瓶中，加入饮片质量的15倍量水，加热煎煮2h，抽滤收集滤液，继续加入15倍量水将药渣煎煮2h，抽滤合并滤液，将滤液浓缩至500mL，备用，取浓缩液50mL于蒸发皿中将其蒸干，计算出固体得率。
该对比例中肉桂粉末煎煮后出现难以过滤的情况，未能计算固体得率，故舍弃该方法。
试验例1
1)将实施例1步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液干燥，得到肉桂水提浓缩物。
2)通过称量，计算实施例1～7得到的肉桂提取物、实施例10肉桂提取物的总固体得率和实施例1步骤(1)得到肉桂水提浓缩物的固体得率，其中，固体得率＝得到目标物的质量÷加入肉桂块固体的质量×100％，所述目标物为肉桂提取物或肉桂水提浓缩物，结果见表1。
表1不同处理方式制得的目标物的固体得率结果
组别 固体得率
实施例1 3％
实施例2 3％
实施例3 2.66％
实施例4 3％
实施例5 2.63％
实施例6 3.06％
实施例7 2.61％
实施例10 1％
肉桂水提浓缩物 11.59％
试验例2
蛋白PDE5A与阴茎勃起功能密切相关，其蛋白的下调，激活阴茎海绵体充血，从而使阴茎勃起。本试验例在进行壮阳研究中，选用雄性SD大鼠及IMR-32细胞系，以期获得更为符合临床的研究效果。
1、实验动物
雄性SD大鼠5只，180～220g，SPF级。试验动物选择饲养在屏障环境，实验单位许可证编号SYXK(京)2019-0003，大鼠在实验前适应性饲养3天，温度22～24℃，相对湿度为45％～55％，12h明暗周期照明，动物自由饮用纯净水。
2、实验材料
(1)供试品：
样品一：实施例1中步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液于蒸发皿中将其蒸干，得到的肉桂水提浓缩物。样品二：实施例1制备得到的肉桂提取物。
(2)阳性对照药：西地那非。
3、给药剂量及配置
(1)供试品的剂量为1.8g/kg。
(2)阳性对照药的剂量
西地那非：依据人使用剂量60mg/人/天计算，按照人和动物间体表面积折算及推荐含药血清的制备浓度，计算得大鼠的给药剂量为0.3g/70kg×70kg×0.018/0.2kg＝0.027g/kg。
(3)药物的配置
(a)2.7mg/mL西地那非溶液
取西地那非1片(西地那非含量为30mg/片)，溶于11.11mL生理盐水，搅拌均匀，现配现用。
(b)180mg/mL供试品
称取1.8g样品一或样品二，溶于8mL生理盐水，并定容至10mL，混匀待用。
4、实验分组
壮阳实验中，动物给药分为三组，分别为空白组、西地那非组及肉桂组。制备含药血清后，细胞组同样分为血清空白组，含药血清西地那非组及含药血清肉桂组。
5、统计学处理
实验的组间差异比较采用One-wayANOVA检验，利用Graphpad Prism5软件进行统计分析及数据处理。
6、实验方法和结果
禁食12小时后，SD大鼠按1mL/100g灌胃给药。给药一小时后，对大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，分离得到含药血清。56℃水浴加热30分钟后，过0.22μm滤膜后置于-20℃保存待用。或直接按照10％浓度血清量配置培养基，置于4℃待用。
将配置好的血清空白溶液，含药血清西地那非溶液及含药血清肉桂溶液，分别加入含有20000个/细胞的神经母细胞瘤细胞的12孔板中，置于37℃培养箱、5％CO2孵育48小时后取出。
蛋白提取及Western Blot：将孔板取出，PBS清洗一次后，加入一定量的蛋白裂解液RIPA，低温反应30分钟后，吸取并加入离心管中，14000rpm离心10分钟后吸取上清，进行蛋白定量，调平蛋白浓度后将蛋白配置成相应的上样体积，加入上样缓冲液煮样。放入4℃冰箱待用。
按照蛋白大小配置相应下层胶，内层加入新配置的电泳液，外层加入回收电泳液，跑胶90V，20分钟后转为120V，90分钟。转膜条件为90mA，100分钟。将膜取出置于5％浓度脱脂奶粉中，摇床震荡1小时后，加入相对应抗体。置于4℃冰箱过夜。之后取出，用TBST洗膜三次，15分钟每次。再加入二抗室温震荡1小时。之后取出，用TBST洗膜三次，15分钟每次。具体结果如图1所示。
如图1可知，阳性药西地那非组及肉桂给药组的PDE5A蛋白表达水平均低于空白组，且西地那非、肉桂水提组(样品一)、肉桂过柱组(样品二)的蛋白下调较空白组相比分别降低了62.4％、51.8％和60.3％。可见肉桂过柱组(样品二)对蛋白PDE5A的抑制作用与阳性药西地那非相当。
试验例3
实施例1中步骤(1)得到的肉桂水提浓缩液于蒸发皿中将其蒸干，得到的肉桂水提浓缩物。
本试验例的供试品为实施例10制备得到第一段产物、第二段产物、第三段产物、第四段产物以及上述肉桂水提浓缩物。
本试验例的实验方法参见试验例2，结果见图2。
如图2可知，阳性药西地那非组及肉桂给药组的蛋白表达水平较空白组均有降低，且肉桂组在分段提取后蛋白下调较空白组下调明显的样品为肉桂第一段产物。
综上可知，本发明制备得到的肉桂提取物显著抑制了PDE5A的表达，尤其是肉桂第一段产物比阳性药西地那非效果更好，从而达到高效治疗勃起功能障碍的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.肉桂提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的应用。
2.肉桂提取物在制备PDE5抑制剂中的应用。
3.权利要求1或2所述肉桂提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将肉桂与水混合，提取，过滤、浓缩滤液，将肉桂水提浓缩液过大孔树脂，依次用水、乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，即得肉桂提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述肉桂与水的质量比为1:12～18。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取方式为煎煮，所述提取次数为1～3次，每次提取时间为1～3h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述肉桂为直径2～3cm的肉桂块。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂的型号包括HPD-500、HPD-BJQH、HPD-725或HPD-826。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积百分数为50％～70％；所述乙醇洗脱液的酒精度大于0。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇洗脱液的酒精度为小于等于65％。
10.一种权利要求3～9任意一项所述制备方法制备得到的肉桂提取物。
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