CN113827698A

CN113827698A - 一种促睡眠复合物及其应用

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Publication number: CN113827698A
Application number: CN202111111772.9A
Authority: CN
Inventors: 曹庸; 何泽琪; 梁曹雯; 陈媛媛; 戴伟杰
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明属于乳源有效成分提取应用技术领域，将牛乳酪蛋白促睡眠肽5‑60%、酸枣仁提取物5‑50%和百合提取物5‑50%，在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。此复合物具有较好的促睡眠效果，可降低血浆中觉醒物质5‑HT和DA含量，发挥促睡眠效果，而不影响血浆中NE水平。

Description

一种促睡眠复合物及其应用

技术领域

本发明属于乳源有效成分提取应用技术领域，将牛乳促睡眠肽、百合和酸枣仁复配成一种促睡眠复合产品。

背景技术

根据世界卫生组织调查，全世界约有30%的人存在失眠症状或睡眠功能障碍。我国目前有38%以上的人存在失眠症状，超过3亿人口有睡眠障碍，这已成为威胁人们健康的巨大隐患。

化学合成的镇静催眠药短期治疗有效，若长期使用，常伴有后遗效应、依赖性、反跳性失眠等不良反应。因此，寻找疗效安全可靠、毒副作用小、能模拟人“生理性睡眠”诱发物质的催眠药物，是睡眠医学的重要课题。目前研究表明，促睡眠主要是通过哺乳动物大脑的单胺类神经递质、氨基酸类神经递质、免疫因子调节、激素调节以及c-Fos蛋白等多方面因素共同作用。其中单胺类神经递质主要包括5-HT、DA、NE等对调节睡眠与觉醒均有重要作用，它们均归属于中枢神经系统。曾远明、李长清等人通过分析失眠患者和常人的脑电涨落图，进一步分析谱线变化，发现某些神经递质有着异常活动。神经递质间互相协同，共同参与睡眠-觉醒的调节过程，维持人体正常的昼夜节律，有效的调控睡眠周期。

酸枣仁的药理主要有镇静、催眠、镇痛、抗惊厥、降温、降压、降脂、抗缺氧、增强免疫功能以及对心脏的保护作用，起作用的主要是酸枣仁中的皂苷和黄酮。研究表明，酸枣仁皂苷作用于慢波睡眠。现代药理研究表明，百合具有镇静安神、止咳祛痰等药理作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明将特定比例的牛乳促睡眠肽结合酸枣仁和百合复配成一款促睡眠复合物，具有较好的促睡眠效果。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种促睡眠复合物，包括以下重量百分比的原料：牛乳酪蛋白促睡眠肽5-60%、酸枣仁提取物5-50%和百合提取物5-50%，更优选牛乳酪蛋白促睡眠肽20-40%、酸枣仁提取物20-40%和百合提取物20-40%；在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

进一步的，所述牛乳酪蛋白促睡眠肽由以下步骤制备而成：将牛乳酪蛋白与蒸馏水以 1：（5-20）的重量比混合，将混合后总重0.1-3%的胰蛋白酶加入，水解4-6小时，再将pH值调至5-6，离心取上清，然后，将所取上清液高温灭活，随后再离心收集上清液，冻干，得到乳源酪蛋白酶解物，低温保存备用；将所得乳源酪蛋白酶解物经旋转蒸发浓缩，得到牛乳多肽饱和水样，采用真空喷雾干燥，得到牛乳酪蛋白促睡眠肽粉末，4℃冷藏，备用。

优选的，所述酸枣仁提取物由以下步骤制备而成：将酸枣仁清理除杂后粉碎，过筛后加入连续相变萃取装置的萃取釜中，在原料堆密度0.39kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.7 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用70%乙醇进行低温连续相变萃取一次；在萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次；将提取液于60℃减压浓缩至固形物含量为 30%，喷雾干燥，得到酸枣仁提取物。

优选的，所述百合提取物由以下步骤制备而成：将百合清理除杂后粉碎，过10目筛；百合原料较硬，提取前先用70%（体积）乙醇浸泡 12h 至粉末变软；将百合原料及浸泡液装进连续相变萃取装置的 50 L 萃取釜中，在原料堆密度0.40kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用70%（体积）乙醇进行低温连续相变萃取一次；在萃取温度70 ℃、萃取压力 0.2 MPa、100L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次；将提取液于 60℃减压浓缩至固形物含量为 30%，喷雾干燥，得到百合提取物。

本发明具有以下积极有益效果：

本发明将牛乳促睡眠肽结合酸枣仁和百合复配成一款促睡眠复合物，该促睡眠肽复合物借助戊巴比妥钠模型进行研究，通过大鼠体内活性评价，验证了此复合物具有较好的促睡眠效果。并且在大鼠血浆中，促睡眠复合物可降低血浆中觉醒物质5-HT和DA含量，发挥促睡眠效果，而不影响大鼠血浆中NE水平。

附图说明

图1 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中5-HT含量的变化；

图2 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中DA含量的变化；

图3 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中NE含量的变化。

具体实施方式

为了更好的了解本发明，下面通过具体的实施例来说明本发明的技术方案。以下实施例中所用药品和试剂均为市购。

实施例1

一种促睡眠复合物，由以下步骤制成：

（1）将酪蛋白与蒸馏水以 1:10的重量比混合，将0.5%的胰蛋白酶加入牛乳酪蛋白中水解5小时，再将pH 值调至5-6，离心取上清，然后，将所取上清液高温灭活，随后离心收集上清液，冻干，得到乳源酪蛋白酶解物，-20℃保存备用；将所得乳源酪蛋白酶解物经旋转蒸发浓缩，得到牛乳多肽饱和水样，采用真空喷雾干燥，得到牛乳酪蛋白促睡眠肽粉末，4℃冷藏，备用；

（2）将酸枣仁清理除杂后粉碎，过20目筛后加入连续相变萃取装置的50 L 萃取釜中，在原料堆密度0.39kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.7 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h的条件下用70%（体积）乙醇进行低温连续相变萃取一次；在萃取温度70℃、萃取压力0.2MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次；将提取液于60℃减压浓缩至固形物含量为 30%，喷雾干燥，得到酸枣仁提取物；

（3）将百合清理除杂后粉碎，过10目筛；百合原料较硬，提取前先用70%（体积）乙醇浸泡 12h 至粉末变软；将百合原料及浸泡液装进连续相变萃取装置的 50 L 萃取釜中，在原料堆密度0.40kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用70%（体积）乙醇进行低温连续相变萃取一次；在萃取温度70 ℃、萃取压力 0.2 MPa、100L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次；将提取液于60℃减压浓缩至固形物含量为 30%，喷雾干燥，得到百合提取物；

（4）按以下重量比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽、酸枣仁提取物和百合提取物三者1：1：1，进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

一、合适失眠模型的选择和建立是评价物质促眠作用的重要手段。戊巴比妥钠模型作为对物质的促睡眠活性筛选的常用模型，本发明采用戊巴比妥钠模型进行研究，观察促睡眠复合物对戊巴比妥钠处理动物睡眠变化的影响，揭示其促睡眠活性。具体试验方法如下：

（1）构建戊巴比妥钠处理大鼠促睡眠模型

本实验中，我们运用该方法检测复配促睡眠肽产品是否具有催眠作用，然后进行促睡眠效果的深入的研究。具体方法是：动物注射具有催眠作用的阈剂量戊巴比妥钠（大鼠50 mg/kg)，观察翻正反射消失时间及恢复时间。翻正反射指正常生理情况下，动物四肢朝上背位放置后能迅速翻转过来的生理反射。如注射戊巴比妥钠等药物后，动物的这种特性会减弱或消失，故称为翻正反射消失。在实验中，从注射戊巴比妥钠到翻正反射消失发生这段时间，称为睡眠潜伏期。翻正反射消失发生到恢复这段时间，称为睡眠时间。本实验判断标准是动物翻转后1分钟内不能恢复原状，阳性即为翻正反射消失；反之，动物翻转后1分钟内立刻恢复原状，阳性为翻正反射恢复。在此模型基础上，我们根据待试药性质，提前给予促睡眠物质，观察其对戊巴比妥钠处理大鼠睡眠效应的影响，即通过睡眠潜伏期和睡眠时间来判断其效应。

SD大鼠，清洁级，体重200-250 g，雄性，由佛山医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2013-0002。实验室温度22±2℃，湿度55±5%，12h黑夜白天交替，动物自由获取食物和水。

（2）对阈剂量戊巴比妥钠致大鼠睡眠作用的影响

取大鼠48只，随机分成 6组，每组8只。百合和酸枣仁组（百合提取物：酸枣仁提取物=1:1）经灌胃途径给予（1000 mg/kg），促睡眠产品组（实施例1复合物）经灌胃途径给予（1000 mg/kg），褪黑素组给予褪黑素（400mg/kg），地西泮阳性组给予地西泮（3mg/kg），正常对照组给予3ml生理盐水，连续给药 7 天，末次给药 30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠50.00mg/kg，分别记录各组入睡的潜伏期及睡眠持续时间。

（3）对阈下剂量戊巴比妥钠致大鼠睡眠百分率的影响

预实验确定10%-20% 的大鼠睡眠的戊巴比妥钠阈下睡眠剂量。

取大鼠48只，随机分成 6组，每组8只，分组给药同上。于末次给药前12h禁食，前2h禁水，给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠 35 mg/kg，观察并记录发生睡眠大鼠的只数。以注射戊巴比妥钠后15 min内翻正反射现象不存在达 1 min以上者判定为阳性。末次给样品30 min后，各组均腹腔注射戊巴比妥钠（35.00 mg/kg），提起大鼠尾巴，将大鼠腹部朝上放在温暖（37℃）的垫块上。记录翻正反射消失的持续时间（翻正反射消失时间至翻正反射重复出现时间）和翻正反射消失的潜伏期。如果怀疑翻正反射是否真正恢复，于第一次翻正后立即重新背位放置，如在1 min之内又自动翻过来则前一次的时间即为恢复时间，否则以第二次翻过来的时间为准。

二、神经化学法检测脑组织中神经递质的含量

（1）试剂配置

标准品溶剂为0.01 mol/L高氯酸、0.50 mmol/L Na₂EDTA、0.1 g/L L-半胱氨酸的混合水溶液。组织裂解液为0.60 mol /L 高氯酸、0.50 mmol /L Na₂EDTA、0.1g/L L-半胱氨酸的混合水溶液。高氯酸沉淀剂为1.20mol/L K₂HPO4、2.00 mmol/L Na₂EDTA的混合水溶液。

（2）色谱条件和荧光检测参数

色谱柱为welch ultimate C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为柠檬酸-乙酸钠缓冲液(50 mmol/L 柠檬酸、50 mmol/L 乙酸钠、0.5 mmol/L 1-庚烷磺酸钠、5 mmol/L三乙胺、0.5 mmol/L Na₂EDTA)-甲醇(87∶13，v /v)(pH 3. 8)；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；发射波长为330nm，激发波长为 280 nm。

（3）标准储备液的配制

精确称取神经递质标准品，分别置于10 mL容量瓶中，加入标准品溶剂，振摇使其溶解并定容，分别制成质量浓度为 0.10mg /mL 的标准储备液，于4℃冰箱中保存，使用时用标准品溶剂逐级稀释至所需浓度。

（4）血液处理

从大鼠的眼静脉丛取血浆，冷冻离心15 min(12000 r/min，4℃)，取上清到2 ml离心管中，相同条件下再离心一次，取上清。放于-80℃冰箱备用。

检测前，拿出血清，室温解冻融化后，取100μl血清样品置于EP管中，加入等体积5%（v/v）高氯酸溶液，在室温下放置10 min，充分沉淀血清中的蛋白质，冷冻离心15 min(12000r/min，4℃)，然后将上清液转入另一个EP管中，相同条件下再次离心15 min，取上清检测分析。

三、试验结果

（1）睡眠潜伏期实验

在5:00pm—7:00pm间，给大鼠称重、腹腔注射戊巴比妥钠溶液。从注射完成到大鼠翻正反射消失的时间段为睡眠潜伏期。根据预实验确定使100%的大鼠进入睡眠的戊巴比妥钠剂量，采用此剂量进行正式实验。根据所用的浓度，配制0.5%的戊巴比妥钠溶液，以0.1ml/10g的剂量来注射。实验结果如表1：

表1 对戊巴比妥钠睡眠潜伏期的影响（M±SD）

百合和酸枣仁组与正常对照组相比，大鼠入睡时间缩短8.74%；促睡眠产品组，与正常对照组比较，大鼠的入睡时间缩短43.47%；褪黑素产品组的大鼠比正常对照组大鼠入睡时间缩短67.42%；地西泮的效果最佳，比正常对照组大鼠缩短119.32%。

结果表明，牛乳促睡眠肽和百合酸枣仁复配后，能显著地缩短大鼠入睡时间，大鼠的入睡时间缩短43.47%。

（2）延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

在5:00pm—7:00pm间，给大鼠称重、腹腔注射戊巴比妥钠溶液；从大鼠翻正反射消失到翻正反射恢复之间的时间为睡眠时间。溶液配置和注射处理同睡眠潜伏期实验的一样。结果如下表2：

表2 对戊巴比妥钠睡眠时间的影响（M±SD）

百合和酸枣仁组与正常对照组组相比，大鼠睡眠时间延长53.30%；促睡眠产品组，与正常对照组比较，大鼠睡眠时间延长116.00%；褪黑素产品组的大鼠比正常对照组组大鼠睡眠时间基本一样；地西泮的促睡眠效果最佳，比正常对照组组大鼠睡眠时间延长635.70%。

（3）戊巴比妥钠阈下睡眠剂量实验

预实验确定10%-20%的大鼠睡眠的戊巴比妥钠阈下睡眠剂量，确定35mg/kg，配制0.4%的戊巴比妥钠溶液，以0.1ml/10g的剂量来注射。结果如表3，与正常对照组组比，牛乳促睡眠产品组入睡率提高了12.50%，和地西泮组结果相同。

表3 牛乳促睡眠肽对戊巴比妥钠阈下睡眠量的影响

。

（4）牛乳促睡眠肽对阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中神经递质的影响

阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中5-HT含量的变化

与正常对照组比较，百合和酸枣仁组和促睡眠产品组大鼠血浆中单胺类神经递质5-HT显著性的降低（p<0.05），而褪黑素组大鼠血浆中的5-HT含量虽有降低，但没有显著性差异，地西泮组同样能显著降低大鼠血浆中5-HT水平（p<0.05）。结果表明，促睡眠产品降低血浆中5-HT含量达到促睡效果，结果见表4和图1。

表4 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中5-HT含量的变化（pg/ml）

。

阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中DA含量的变化

与正常对照组比较，促睡眠产品组和褪黑素组大鼠血浆中DA含量显著降低（p<0.01），而酸枣仁和百合组与地西泮组的DA含量，虽有差异，但无统计学的意义。结果表明，促睡眠产品组降低大鼠血浆中DA达到促睡眠的功效，结果见表5和图2。

表5 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中DA含量的变化（pg/ml）

。

阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中NE含量的变化

与正常对照组比较，促睡眠产品组、褪黑素组和地西泮组大鼠血浆中NE含量比对照组低，但无显著性影响，而百合和酸枣仁组大鼠血浆中NE含量高于对照组。结果表明，促睡眠产品不影响大鼠血浆中NE，结果见表6和图3。

表6 阈剂量戊巴比妥钠协同大鼠血浆中NE含量的变化（pg/ml）

。

综上所述，在大鼠血浆中，促睡眠产品降低血浆中觉醒物质5-HT和DA含量，发挥促睡眠效果；而不影响大鼠血浆中NE水平。

实施例2

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽5%、酸枣仁提取物50%和百合提取物45%，在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

实施例3

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽60%、酸枣仁提取物5%和百合提取物35%，在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

实施例4

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽45%、酸枣仁提取物5%和百合提取物50%，在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

实施例5

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽45%、酸枣仁提取物50%和百合提取物5%，在此比例范围内进行复配混合，即得本发明促睡眠复合物。

实施例6

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽40%、酸枣仁提取物40%和百合提取物20%。

实施例7

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽20%、酸枣仁提取物40%和百合提取物40%。

实施例8

一种促睡眠复合物，除以下步骤外与实施例制备方法相同：

（4）按以下重量百分比配备：牛乳酪蛋白促睡眠肽40%、酸枣仁提取物20%和百合提取物40%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促睡眠复合物，其特征在于：包括以下重量百分比的原料：牛乳酪蛋白促睡眠肽5-60%、酸枣仁提取物5-50%和百合提取物5-50%。

2.根据权利要求1所述的催睡眠复合物，其特征在于：包括以下重量百分比的原料：牛乳酪蛋白促睡眠肽20-40%、酸枣仁提取物20-40%和百合提取物20-40%。

3. 根据权利要求1所述的催睡眠复合物，其特征在于：所述牛乳酪蛋白促睡眠肽由以下步骤制备而成：将牛乳酪蛋白与蒸馏水以 1：（5-20）的重量比混合，将混合后总重0.1-3%的胰蛋白酶加入，水解4-6小时，再将pH 值调至5-6，离心取上清，然后，将所取上清液高温灭活，随后再次离心收集上清液，冻干，得到乳源酪蛋白酶解物，低温保存备用；将所得乳源酪蛋白酶解物进一步浓缩，得到牛乳多肽饱和水样，采用真空喷雾干燥，得到牛乳酪蛋白促睡眠肽粉末。

4.根据权利要求1所述的催睡眠复合物，其特征在于：所述酸枣仁提取物由以下步骤制备而成：将酸枣仁清理除杂后粉碎，过筛后加入连续相变萃取装置的萃取釜中进行两次低温连续相变萃取；将提取液浓缩，喷雾干燥，得到酸枣仁提取物。

5. 根据权利要求4所述的催睡眠复合物，其特征在于：低温连续相变萃取第一次在原料堆密度0.39kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.7 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用70%乙醇进行；低温连续相变萃取第二次在萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行。

6. 根据权利要求1所述的催睡眠复合物，其特征在于：所述百合提取物由以下步骤制备而成：将百合清理除杂后粉碎，过筛后先用乙醇浸泡 12h 至粉末变软；再将百合原料及浸泡液一起装进连续相变萃取装置的萃取釜中进行两次低温连续相变萃取；将提取液浓缩，喷雾干燥，得到百合提取物。

7. 根据权利要求6所述的催睡眠复合物，其特征在于：低温连续相变萃取第一次在原料堆密度0.40kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用70%乙醇进行；低温连续相变萃取第二次在萃取温度70℃、萃取压力 0.2 MPa、100L/h 流速、萃取时间 3h 的条件下用三级水进行。

8. 根据权利要求4或6所述的催睡眠复合物，其特征在于：所述将提取液浓缩为60℃减压浓缩至固形物含量为 30wt%。

9.权利要求1-8任一项所述催睡眠复合物在在制备促睡眠产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为食品或药品。