CN112138035B - 一种治疗性功能障碍的中药提取物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗性功能障碍的中药提取物的制备方法及应用。本发明将地耳草的提取物用于治疗性功能障碍，主要是勃起功能障碍、少精、弱精症等，另外本发明还公开了所述的地耳草提取物的制备方法以及该提取物具体为地耳草中提取的总黄酮类成分，其总黄酮的含量不低于30％；通过药理实验及临床观察，本发明所述的地耳草提取物对勃起功能障碍有显著效果，具有提高精子活力、数量和质量的作用，对少精症、弱精症状具有良好的改善效果。本发明制备得到的药物服用方便、天然、安全、无毒副作用，对勃起功能障碍、少精症、弱精症起效快、效果显著。

Description

一种治疗性功能障碍的中药提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种治疗性功能障碍的中药提取物的制备方法及应用。

背景技术

随着社会的发展，人们的工作节奏越来越快，生活压力也越来越大，越来越多的男性出现了性功能障碍。在性功能障碍中常见的有勃起功能障碍、少精症、弱精症等。

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是指阴茎持续不能达到和(或)维持足够的勃起以获得满意的性生活。据统计，目前全球约20％的成年男性患有ED，并且呈逐年上升趋势；此外，2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征和心理性因素等均可增加发生ED的风险。异致患者出现勃起功能障碍的因素有很多，如心理因素、身体条件因素、身体疾病、药物毒副作用以及环境因素等。临床上对ED的治疗主要是针对原发病的防治及心理上的疏导，其长期疗效不甚理想，从而严重影响着人们的生活质量，降低工作效率、增加医疗花费。这既给公众的身心健康带来严重影响，也给治疗手段带来了挑战。因此，提供有效的治疗手段是当务之急。

目前，ED的治疗方法大体分为非侵入性和侵入性两种：(1)非侵入性疗法：该法主要是药物治疗，用于临床一线治疗，最具有代表性的是磷酸二酯酶-5抑制剂(phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5-i)，主要有：西地那非、他达拉非、伐地那非和阿伐那非。这4种PDE5-i均有类似的疗效和副作用。西地那非和伐地那非拥有相同的半衰期，均为4h；而他达拉非的半衰期最长，达17.5h；阿伐那非的半衰期最短只有3h。伐地那非要谨慎用于Q-T间期延长患者。(2)侵入性疗法：该法包括阴茎海绵体内注射血管活性药物等，一般临床上用于二线治疗。海绵体内注射血管活性药物可以单独使用，也可以结合前列腺素E1、酚妥拉明、血管活性肠肽、罂粟碱和阿托品使用。还有一些侵入性的二线治疗方案，如尿道内前列腺素E1微球注入、植入真空负压吸引装置和阴茎假体植入术，这些侵入性疗法均给患者带来了痛苦和很多不良反应。

尽管目前用于ED治疗的方法很多，但这些疗法仍令许多患者感到不满意、不愿接受或不能忍受等。因此，如何获得一种使用方便、天然、安全、无副作用、起效快速效果显著的治疗勃起功能障碍的药物是业内亟待解决的技术问题。

少精症是指精液中的精子数目低于正常具有生养能力男性的一种疾病。即国际卫生组织规定男性的精子在每毫升不低于2千万，如果低于2千万就回为少精。由精子数减少而导致男性不育的发病率较高，是男性不育的重要原因之一。造成少精症的原因有生殖道感染、免疫因素、精索静脉曲张、内分泌异常、精浆异常、环境因素、全身性疾病、医源性及先天性因素如隐睾、纤毛不动综合征,以及特发性少精症等。还有一些环境因素也会导致少精的发生，如环境污染，电器辐射等等都会造成现代男性少精。

弱精症是指≥2次精液常规分析A级精子少于25％和A+B级精子小于50％，其他参数正常或基本正常。弱精症时，精子无力前行，难以穿过子宫颈管、子宫腔，直达输卵管与卵子结合，因而造成生育能力低下。导致弱精子症的常见原因有，睾丸生精上皮不完全成熟或受损变薄，产生的精子素质差，活动能力弱精液量少。

因此研究开发一种提高精子活力和数量治疗少弱精症、治疗勃起功能障碍改善性功能的药物具有较好的市场前景。

本申请所述的中药提取物为以地耳草为原料制备得到。地耳草又名田基黄，是藤黄科(Guttiferae)金丝桃属属多年生草本植物，具有清热解毒、消肿止痛的功能，可用于急慢性肝炎、泄泻、痢疾、毒蛇咬伤、疮痈肿痛、跌打损伤。目前并未见地耳草用于性功能障碍方面的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种治疗性功能障碍的中药提取物的制备方法及应用，旨在开发服用方便、天然、安全、无毒副作用、起效快、效果显著的治疗勃起功能障碍、少精、弱精症的药物。

本发明公开了一种地耳草提取物在制备治疗性功能障碍药物中的应用。

进一步，所述的地耳草提取物为地耳草总黄酮类成分，其总黄酮的含量不低于30％。

进一步，所述的性功能障碍为勃起功能障碍、少精、弱精中的任意一种或几种。

进一步，所述药物的剂型为口服制剂，如片剂或胶囊。

本发明还公开了一种治疗性功能障碍的地耳草提取物的制备方法，所述的制备方法为：将地耳草切成段，加乙醇溶液回流提取2～3次，第一次加入药材量10～12倍乙醇溶液，第二次加入8～10倍乙醇溶液，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至药液和药材的比例为1：1，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得。

一种治疗性功能障碍的地耳草提取物的制备方法，所述的制备方法为：将地耳草切成段，加纯化水回流提取2～3次，第一次加入药材量10～12倍量，第二次加入10倍量，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得。

一种治疗性功能障碍的地耳草提取物的制备方法，所述的制备方法为：将地耳草切成段，加纯化水回流提取2～3次，第一次加入药材量10～12倍量，第二次加入8～10倍量，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至药液和药材的比例为1：1，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得。

一种治疗性功能障碍的地耳草提取物的制备方法，所述的制备方法为：将地耳草切成段，加1％氢氧化钠醇溶液回流提取2次，第一次加入药材量12倍，第二次加入10倍，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至药液和药材的比例为1：1，浓缩液加盐酸调pH至中性，离心，离心液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得。

一种治疗性功能障碍的地耳草提取物的制备方法，所述的制备方法为：将地耳草粉粹，加纯化水回流提取2次，第一次加入药材量12倍，第二次加入10倍，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液常压浓缩至药液和药材的比例为1：1，浓缩液用2倍乙酸乙酯萃取两次，取上层液，减压浓缩回收乙酸乙酯，并将浓缩液放入鼓风干燥箱中干燥即得。

一种中药提取物在制备治疗性功能障碍药物中的应用，其特征在于，所述的中药提取物包含地耳草提取物。

在本发明中，所述药物的剂型为口服制剂，如片剂或胶囊，采用的辅料为常规辅料，如交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、微晶纤维素、异麦芽酮糖醇、二氧化硅、羧甲基淀粉钠等，辅料的用量为本领域常规用量。

本发明的有益效果

本发明提供了一种中药提取物在制备改善性功能或少弱精症的药物中的应用，所述中药提取物为地耳草总黄酮类成分。经药理研究发现，本发明所述的中药提取物能够提高勃起功能障碍大鼠及小鼠的交配能力，增加捕捉次数和射精次数，缩短勃起潜伏期，同时能有效提高其精子密度、活力和活率，对少弱精症状具有良好的改善效果，能改善性腺轴靶器官萎缩的趋势，显著增加肾阳虚证雄性小鼠体内促肾上腺皮质激素的分泌，增加其精子数，并且可以改善氢化可的松所致的性腺轴靶器官的病理变化。通过对临床治疗观察，结果显示通过服用本发明所述的药物，临床治疗总有效率能达到90％，可见本发明所述的药物对性功能障碍中勃起功能障碍有显著性的疗效，并且长期服用无明显毒副作用。

附图说明

图1是ATCH标准曲线图；

图2各组小鼠肾脏HE染色病理切片，其中A.空白对照组；B.模型对照组；C.高剂量组D.中剂量组E.低剂量组F.金匮肾气丸组；

图3各组小鼠睾丸HE染色病理切片，其中A.空白对照组；B.模型对照组；C.高剂量组D.中剂量组E.低剂量组F.金匮肾气丸组；

图4各组小鼠附睾HE染色病理切片图，其中A.空白对照组；B.模型对照组；C.高剂量组D.中剂量组E.低剂量组F.金匮肾气丸组；

图5各组小鼠精囊腺HE染色病理切片图，其中A.空白对照组；B.模型对照组；C.高剂量组D.中剂量组E.低剂量组F.金匮肾气丸组；

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1

地耳草，切成段，加乙醇溶液回流提取2次，第一次加入药材量12倍乙醇溶液，第二次加入10倍乙醇溶液，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为1.9％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为56.3％，得到提取物A。

实施例2

地耳草，切成段，加乙醇溶液回流提取2次，第一次加入药材量10倍乙醇溶液，第二次加入10倍乙醇溶液，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为1.5％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为50.8％，得到提取物B。

实施例3

地耳草，切成段，加乙醇溶液回流提取2次，第一次加入药材量10倍乙醇溶液，第二次加入8倍乙醇溶液，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为1.2％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为47.1％，得到提取物C。

实施例4

地耳草，切成段，加纯化水回流提取2次，第一次加入药材量12倍量，第二次加入10倍量，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液上大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为2.5％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为39.3％，得到提取物D。

实施例5

地耳草，切成段，加1％氢氧化钠醇溶液回流提取2次，第一次加入药材量12倍，第二次加入10倍，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液减压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液加盐酸调pH至中性，离心，离心液浓缩回收溶剂，放入真空干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为10.2％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为36.4％，得到提取物E。

实施例6

地耳草，粉粹，加纯化水回流提取2次，第一次加入药材量12倍，第二次加入10倍，每次提取1小时，200目筛网滤过，得滤液，滤液常压浓缩至1：1(药液：药材)，浓缩液用2倍乙酸乙酯萃取两次，取上层液，减压浓缩回收乙酸乙酯，并将浓缩液放入鼓风干燥箱中干燥即得，测定其干膏收率为3.9％，参照《中国药典》2015年版药典一部山楂叶含量测定项下总黄酮测定法，采用紫外可见分光光法测定。本品按干燥品计算，含总黄酮以槲皮苷(C₂₁H₂₀O₁₁)计含量为54.3％，得到提取物F。

实施例7

将实施例1所制备的提取物A加入辅料制备为胶囊剂E，具体制备工艺如下：

①混合、制粒

按配方比例称取地耳草提取物A150g、微晶纤维素141g，混合均匀，得混合粉；将75％乙醇溶液加入混合粉中，搅拌混合5分钟制软材，过16目筛制粒，得湿颗粒；

②干燥、整粒

湿颗粒60～70℃干燥至水分≤5％，过14目筛整粒，得颗粒；

③总混

将羧甲淀粉钠6g加入颗粒中，混合10分钟，再加入硬脂酸镁3g，继续混合10min，混合均匀，得总混物料；

④填充、抛光

总混物料用0^#明胶空心胶囊填充，每粒装0.3g/粒，抛光，得胶囊G。

实施例8

将实施例2所制备的提取物B加入辅料制备为胶囊剂F，具体制备工艺如下：

①混合、制粒

按配方比例称取地耳草提取物B 200g、微晶纤维素70g、二氧化硅15g，混合均匀，得混合粉；将85％乙醇溶液加入混合粉中，搅拌混合5分钟制软材，过16目筛制粒，得湿颗粒；

②干燥、整粒

湿颗粒60～70℃干燥至水分≤5％，过14目筛整粒，得颗粒；

③总混

将羧甲淀粉钠12g加入颗粒中，混合10min，再加入硬脂酸镁3g，继续混合5min，混合均匀，得总混物料；

④填充、抛光

总混物料用0^#明胶空心胶囊填充，每粒装0.3g/粒，抛光，得胶囊H。

实施例9

将实施例1所制备的提取物A加入辅料制备为片剂G，具体制备工艺如下：

①混合、制粒

按配方比例称取地耳草提取物A200g、微晶纤维素275g、交联聚维酮10g，混合均匀，得混合粉；将70％乙醇溶液加入混合粉中，搅拌混合5分钟制软材，过20目筛制粒，得湿颗粒；

②干燥、整粒

湿颗粒60～70℃干燥至水分≤5％，过20目筛整粒，得颗粒；

③总混

将硬脂酸镁5g加入颗粒中，混合5分钟，混合均匀，得总混物料；

④压片

总混物料用压片机压片，得素片；

⑤包衣

胃溶型薄膜包衣预混剂10g配制成14％的包衣液。素片置包衣锅内预热至38～45℃，用上述包衣液进行薄膜包衣，包衣结束后用冷风吹冷，降温后收料，得包衣片G。

实施例10地耳草提取物在制备治疗性功能障碍或少弱精症的药物中的应用

1材料与方法

1.1材料

氢化可的松，成都艾科达化学试剂有限公司(纯度98％)；金匮肾气丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；补佳乐(戊酸雌二醇)，拜耳医药保健有限公司；生理盐水，成都市科龙化工试剂厂；雌、雄SD大鼠，体重180-220g，购于成都达硕实验动物有限公司；超纯水：Water purifier实验室专用超纯水机。电子分析天平：YP1201N，上海精密科学仪器有限公司；精子质量检测系统：WLJY-9000型，北京伟力新世纪科技发展有限公司。

1.2方法

SD雄性大鼠，随机分成6组，每组动物10只。分别为空白对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性对照组、地耳草提取物B低剂量组、地耳草提取物B中剂量组、地耳草提取物B高剂量组，具体的情况见表1。第四天开始给药，除正常组外，其余组皮下注射氢化可的松25mg/kg，每日1次，连续7天，造模同时给药。雌鼠于交配前14天手术切除卵巢，交配前48h皮下注射戊酸雌二醇(20μg/只)和4h皮下注射黄体酮(500μg/只)，使之发情时间同步。

表1地耳草提取物B对勃起功能障碍大鼠交配能力的影响试验计量设计

给予受试样品第30天，灌胃1h后观察30min内大鼠交配能力(捕捉潜伏期、捕捉次数、交配潜伏期、交配次数)。

实验结束后称重并处死，即刻称取包皮腺、睾丸、前列腺-精囊腺等器官重量，计算生殖器官脏器系数。

将附睾取出后用生理盐水冲洗干净，一侧附睾尾部放入3ml 37℃生理盐水中，剪碎，放置1分钟左右，取少量精子混悬液，加入缓冲液中，37℃恒温水中存放5分钟，取少量加到预温计数板上，采用WLJY-9000型精子质量检测系统(Computer-aided spermanalysis，CASA)，进行精子质量检查，将精子混悬液涂于计数载玻片上，选取4个视野，2分钟内完成测试。

1.3数据统计方法

数据采用

表示，应用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料数据若方差齐或经转换后方差齐，则采用单因素方差分析，组间比较用LSD法，若方差不齐，数据经转换后方差仍不齐，采用秩和检验进行统计分析。检验水平α＝0.05。

2结果及分析

2.1交配试验结果

与空白对照组比较，模型对照组捕捉潜伏期、交配潜伏期增长，具有非常显著的统计学差异(P<0.01)，捕捉次数、交配次数减少，具有统计学显著性差异。地耳草提取物给药3个给药组的动物的捕捉次数均明显增加(P<0.01)。与模型对照组比较，试验组的动物的捕捉潜伏期缩短，均具有统计学差异(P<0.05)，中剂量组P<0.01有非常显著的统计学差异。与模型对照组比较，阳性对照组、地耳草提取物低、中剂量试验组的交配潜伏期缩短，均具有统计学差异(P<0.05)，低、中剂量组P<0.01有非常显著的统计学差异。与模型对照组比较，阳性对照组、低、中、高剂量组交配次数交配次数增加，均具有统计学差异(P<0.05)，其中阳性对照及给药低、中剂量组P<0.01具有非常显著的统计学差异，详细情况见表3。

表2地耳草提取物对勃起功能障碍大鼠交配能力的影响(n＝10)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与正常对照组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

2.2精子数量、活力及活动率结果

与空白对照组比较，模型对照组动物精子数量和活动率下降、精子密度下降具有非常显著的统计学差异(P<0.01)。与模型对照组比较，阳性对照组动物的精子数量增加、精子活动率升高；低剂量组精子活力增加具有统计学差异(P<0.05)；中、高剂量组动物的精子活动率上升、精子活力、精子密度明显增多，均具有非常显著的统计学差异(P<0.01)，测定结果见表3。

表3地耳草提取物对少、弱精大鼠精液常规的影响(n＝10)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与正常对照组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

2.3生殖器官脏器重及脏器系数结果

未见各试验组间睾丸、附睾及其脏器系数有统计学意义上的差异，见表4。

表4地耳草提取物对大鼠生殖器官脏器重和脏器系数的影响(n＝10)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与正常对照组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

实施例11地耳草提取物在制备治疗性功能障碍或少弱精症的药物中的应用

1材料与方法

1.1材料

地耳草提取物样品，批号：180910，成都南山药业有限公司。金匮肾气丸，批号：19030922，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂。氢化可的松注射液，批号：20190701，山西省芮城科龙兽药有限公司。苯甲酸雌二醇注射液，批号：190504，上海全宇生物科技(驻马店)动物药业有限公司。小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA酶联免疫试剂盒，批号：SW85JFAUH3,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

SPF级KM小鼠，雄性，体重20～25g，雌性，体重18～23g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物质量合格证号：SCXK(川)2015-030。(1)YP30002型电子天平，上海越平科学仪器有限公司。DW-86L338(J)型医用低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司。EMaxPlus酶标仪，美国Molecular Devices公司。UPH-I-10T超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。HH-S6型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。SmartSpin-12型高速离心机，宁波拓普森科学仪器有限公司。L500台式低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。85-2控温磁力搅拌器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2方法

将所有雄性小鼠按体重随机分为6组，每组14只，分别为空白对照组、模型对照组、地耳草提取物样品高剂量组、地耳草提取物样品中剂量组、地耳草提取物样品低剂量组、金匮肾气丸组(阳性药物对照组)。

取地耳草提取物样品适量，加入纯净水，配制成20mg/ml的混悬液。成人体重照50kg计，地耳草提取物样品成人一日用量为1.2g，即0.024g/kg。一般小鼠体重以20g计，灌药体积为0.4ml。小鼠高剂量为成人剂量的24倍，即为0.576g/kg，则药液浓度为0.0288g/ml；小鼠中剂量(临床等效剂量)为成人剂量的12倍，即为0.288g/kg，则药液浓度为0.0144g/ml；小鼠低剂量为成人剂量的6倍，即为0.144g/kg，即药液浓度为0.0072g/ml。灌胃前用磁力搅拌器搅拌使之充分混匀，地耳草提取物样品混悬液临用现配。

将金匮肾气丸粉碎成细粉，过6号筛，尽量全部通过，避免不均匀。成人体重照50kg计，金匮肾气丸成人一日用量为10g，即0.2g/kg，所配制的金匮肾气丸药液为小鼠中剂量，则为成人剂量的12倍，即为2.4g/kg，一般小鼠体重计为20g，灌药量为0.4ml，药液浓度则为0.12g/ml。灌胃药液用纯净水临用现配。

空白对照组、模型对照组每天灌胃等体积纯净水，其余各组小鼠每天灌胃相应药液0.4mg/kg，每天1次，连续灌胃14天。

从第15天起，除空白对照组外，其余各组在小鼠臀部肌肉注射氢化可的松25mg/kg/天造模，连续造模给药10天。造模同时，除空白对照组、模型对照组灌胃等体积纯净水外，其余各组灌胃相应体积药液，每天给药1次，连续10天，其中地耳草提取物样品高剂量组为0.576g/kg,中剂量组为0.288g/kg，低剂量组为0.144g/kg，金匮肾气丸组为2.4g/kg。

第24天晚上进行小鼠交配实验观察，第25天进行动物眼眶采血、处死动物，剖取相应的组织器官。

在实验过程中，每隔一周观察小鼠的一般体征，包括体重、尿量(通过垫料干湿程度间接反映)、大便干湿情况等。

在实验前(预饲养期)、给药第1、7、14、19、25天对各组小鼠体重称量，计算与前一个时间点体重改变的情况。

眼球取血后，摘取各小鼠肾脏、睾丸、附睾、精囊腺等，称定重量，计算各器官或组织的脏器指数，计算公式为：脏器指数＝脏器重量/体重，单位mg/g。

各组动物末次给药后，晚上20:00开始，将雄鼠置于纸箱中熟悉环境，10分钟后放入3只发情雌鼠(提前三天连续按0.05ml/只的剂量肌注苯甲酸雌二醇注射液)，通过红外数码摄像头拍摄，连续记录30分钟。回放视频，在电脑中观察并记录：自投入雌鼠第一次出现跨骑的时间为跨骑潜伏时间，30分钟内跨骑的次数，计算每分钟的平均骑跨次数。

小鼠眼眶静脉丛采血，将血液样品放置两小时凝固后，离心机以转速3000r/min离心10min，取上清液，将血清放-70℃贮藏，用酶联免疫吸附法测定血清中ACTH的含量，具体操作按试剂盒说明进行。

将各脏器用福尔马林溶液进行固定，HE染色后在显微镜下进行观察，病理观察由四川诺瓦斯生物科技有限公司完成。

1.3数据统计方法

采用统计软件SPSS 26.0进行数据分析，各组数据均以均数加减标准差(x±s)表示，满足方差齐性用LSD检验，不满足方差齐性，则采用Dunnett’s T3检验。分析结果均以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

备注：各组动物有个别死亡，并剔除部分样本(溶血、量少、离群值等)，在体重、脏器指数、血清检测统计统一为10只/组，在病理检测统一为8只/组。

2结果及分析

2.1对小鼠体重增长变化的影响

在造模前，各组小鼠体重都有所增长，且各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)；第22天，除空白对照组外，其余各组体重均有下降。模型对照组与空白对照组相比，体重差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组相比较，地耳草提取物样品高剂量、中剂量、低剂量组体重和金匮肾气丸组的体重差异无统计学意义(P>0.05)，但体重下降率均低于模型对照组；第28天，除空白对照组外，其余各组体重仍在下降。模型对照组与空白对照组相比，体重差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组相比较，地耳草提取物样品高剂量组的体重差异无统计学意义(P>0.05),地耳草提取物样品中剂量、低剂量组体重和金匮肾气丸组的体重差异有统计学意义(P<0.01)且体重下降率均低于模型对照组。初步判断地耳草提取物样品和金匮肾气丸对肾阳虚小鼠体重降低，都有一定的改善作用，结果见表5。

表5地耳草提取物样品对小鼠体重变化值的影响(

g,n＝10)

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，**P<0.01。

2.2对脏器指数的影响

与空白对照组相比，模型对照组肾指数明显低于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01)，地耳草提取物样品高剂量、低剂量组的肾指数高于模型对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与空白对照组相比较，模型对照组小鼠睾丸指数明显高于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组相比，地耳草提取物样品高剂量、中剂量、低剂量组和金匮肾气丸组的睾丸指数均小于模型对照组，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01，P<0.01，P<0.01)；与空白对照组相比，模型对照组附睾指数低于空白对照组，差异不具有统计学意义(P>0.05)，与模型对照组相比，地耳草提取物样品高剂量、中剂量、低剂量组的附睾指数明显高于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.05)，金匮肾气丸组的附睾指数略高于模型对照组，其差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组相比，模型对照组精囊腺指数高于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组相比，地耳草提取物样品高剂量、中剂量组和金匮肾气丸组的精囊腺指数明显低于模型对照组，其差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，说明地耳草提取物样品有改变肾脏萎缩、附睾萎缩睾丸膨胀、精囊腺膨胀的趋势。对各脏器指数的影响结果见表6。

表6地耳草提取物样品对小鼠各脏器指数的影响(

mg/g)

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3对肾阳虚小鼠交配能力的影响

与空白对照组相比，模型对照组骑跨潜伏时间明显长于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组相比，地耳草提取物样品低剂量组的骑跨潜伏时间低于模型对照组，但其差异不具有统计学意义(P>0.05)，地耳草提取物样品高剂量、中剂量组与金贵肾气丸组的骑跨潜伏时间明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.05)；与空白对照组相比较，模型对照组每分钟平均骑跨次数明显低于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组相比，地耳草提取物样品低剂量组的每分钟平均骑跨次数高于模型对照组，但其差异不具有统计学意义(P>0.05)，地耳草提取物样品高剂量、中剂量组与金贵肾气丸组的每分钟平均骑跨次数明显高于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，说明地耳草提取物样品和金匮肾气丸均可提高肾阳虚小鼠的交配能力，见表7。

表7地耳草提取物样品对肾阳虚小鼠交配能力的影响

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4对血清中ACTH的影响

与空白对照组相比，模型对照组血清中ACTH低于空白对照组，其差异具有统计学意义(P<0.05),与模型对照组相比，各给药组血清中ACTH含量都高于模型对照组，差异均具有统计学意义(均P<0.01)，证明地耳草提取物样品能够有效增加肾阳虚小鼠血清中的ACTH，改善肾阳虚证，见表8。

表8地耳草提取物样品对小鼠血清中ACTH水平的影响

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，**P<0.01。

ATCH标曲回归方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r^2＝0.9649，标准曲线见图1。

2.5病理切片观察

2.5.1肾脏切片

空白对照组小鼠肾组织组织被膜完整，皮髓质分界清晰，皮质肾小管排列紧密，分界清晰，上皮细胞形态正常，肾小球数量丰富，结构未见明显改变，未见明显异常；模型对照组肾脏组织被膜完整，皮髓质分界清晰，皮髓质交界处少量肾小管、集合管扩张，皮质及髓质均可见淤血，间质较多红细胞，局部可见大量肾小管上皮细胞胞核固缩深染，细胞分界不清，部分胞质疏松淡染，少量肾小管上皮细胞脱落，少量肾小管管腔内可见嗜酸性团块；地耳草提取物样品高剂量组肾脏组织被膜完整，皮髓质分界清晰，皮质肾小管排列紧密，分界清晰，上皮细胞形态正常，间质可见淤血，肾小球数量丰富，结构未见明显改变，未见其它明显异常；地耳草提取物样品中剂量组肾脏组织被膜完整，皮髓质分界清晰，皮质少量肾小管内充满嗜酸性蛋白液，形成管型，皮质轻度淤血，间质可见少量红细胞，肾小球数量丰富，结构未见明显改变，未见其它明显异常；地耳草提取物样品低剂量组肾脏组织被膜完整，皮髓质交界处少量集合管扩张，肾小管上皮细胞形态正常，皮质及髓质均可见淤血，间质较多红细胞，肾小球数量丰富，结构未见明显改变，未见其它明显异常；金匮肾气丸组肾脏组织被膜完整，皮髓质分界清晰，皮质肾小管排列紧密，分界清晰，上皮细胞形态正常，肾小球数量丰富，结构未见明显改变，未见明显异常，结果见图2。

2.5.2睾丸切片

空白对照组组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，管腔内生精细胞、支持细胞数量丰富，排列疏松，并可见长梭形精子，未见其它明显异常；模型对照组小鼠组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，少量曲精小管内生精细胞、支持细胞数量减少，排列紊乱，局部曲精小管内可见生精细胞脱落，未见其它明显异常；地耳草提取物样品高剂量组睾丸组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，管腔内生精细胞、支持细胞数量丰富，排列较疏松，并可见长梭形精子，未见其它明显异常；地耳草提取物样品中剂量组睾丸组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，间隙增宽，个别曲精小管内生精细胞数量减少，排列疏松，未见其它明显异常；地耳草提取物样品低剂量组睾丸组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，曲精小管内生精细胞、支持细胞排列较紊乱疏松，少量曲精小管内可见生精细胞脱落入管腔，未见其它明显异常；金匮肾气丸组睾丸组织外膜完整，曲精小管分界清晰，排列较疏松，管腔内生精细胞、支持细胞数量丰富，排列较疏松，并可见长梭形精子，未见其它明显异常，结果见图3。

2.5.3附睾切片

空白对照组组织附睾管结构清晰，管腔内精子数量丰富，上皮为假复层柱状上皮，上皮细胞排列规则，形态正常，未见明显异常；模型对照组组织附睾管结构清晰，管腔内精子数量明显减少或消失，局部管腔内可见嗜酸性蛋白液，上皮为假复层柱状上皮，上皮细胞较厚、排列规则，未见其它明显异常；地耳草提取物样品高剂量组组织附睾管结构清晰，管腔内精子数量丰富，上皮为假复层柱状上皮，上皮细胞排列规则，形态正常，未见明显异常；地耳草提取物样品中剂量组组织附睾管结构清晰，局部管腔内精子数量明显减少或消失，少量管腔内可见嗜酸性絮状物，上皮为假复层柱状上皮，少量上皮细胞肿胀，胞质疏松淡染，未见其它明显异常；地耳草提取物样品低剂量组组织附睾管结构清晰，局部管腔内精子数量明显减少或消失，少量管腔内可见嗜酸性蛋白液，上皮为假复层柱状上皮，上皮细胞较厚、排列规则，未见其它明显异常；金匮肾气丸组组织附睾管结构清晰，管腔内精子数量丰富，上皮为假复层柱状上皮，上皮细胞排列规则，形态正常，未见明显异常，结果见图4。

2.5.4精囊腺切片

空白对照组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，上皮细胞排列紧密，形态正常，腔内充满嗜酸性物质，未见明显异常；模型对照组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，少量上皮细胞肿胀，胞质疏松淡染或呈空泡状，腔内充满嗜酸性物质，肌层可见少量不规则空洞，局部肌层少量血管淤血扩张，未见其它明显异常；地耳草提取物样品高剂量组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，上皮细胞排列紧密，形态正常，腔内充满嗜酸性物质，未见明显异常；地耳草提取物样品中剂量组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，较多上皮细胞肿胀，胞质疏松淡染或呈空泡状，腔内充满嗜酸性物质，肌层可见少量不规则空洞，未见其它明显异常；地耳草提取物样品低剂量组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，较多上皮细胞肿胀，胞质疏松淡染或呈空泡状，腔内充满嗜酸性物质，肌层可见少量不规则空洞，未见其它明显异常；金匮肾气丸组组织各层结构清晰，黏膜层可见较多皱襞，黏膜层上皮为单层柱状上皮，上皮细胞排列紧密，形态正常，腔内充满嗜酸性物质，未见明显异常，结果见图5。

2.6.结论

肾阳虚在临床上主要表现为神疲乏力、精神不振、活力底下、畏寒肢冷、四肢发凉、腰膝酸痛、性功能减退、阳痿、早泄、小便清长、尿少或夜尿频多，或咳喘痰鸣、小腹牵引睾丸坠胀疼痛、阴囊收缩、须发易脱落、早白，形体虚胖或羸瘦，而地耳草提取物样品可改善上述症状。本实验通过注射氢化可的松注射液造成小鼠肾阳虚，后探究地耳草提取物样品在改善肾阳虚症状方面的作用，从以上实验结果可知，地耳草提取物样品能改善性腺轴靶器官萎缩的趋势，能显著增加肾阳虚证雄性小鼠体内促肾上腺皮质激素的分泌，增加其精子数，并且可以改善氢化可的松所致的性腺轴靶器官的病理变化，可知地耳草提取物样品在改善肾阳虚证方面具有一定的作用。本实验主要针对下丘脑-垂体-性腺轴研究地耳草提取物样品在改善肾阳虚证方面的作用，还可进一步从代谢组学方面探讨地耳草提取物样品改善肾阳虚的作用机制。

实施例12本发明所述药物在临床上的观察应用

为了验证本药物治疗勃起功能障碍的疗效，做了病例试验，选取有勃起障碍的患者共30例，年龄在30岁到70岁之间，均为已婚或者是有固定性伴侣，并且均有性经验。患者的外生殖器、睾丸、前列腺以及附睾等均没有发现有器质性病变。排除恶性肿瘤患者、精神病史患者、吸毒或者酒精依赖患者。采用数字随机表法随机将患者分为三组，每组10人。

观察并记录患者的国际勃起功能指数调查问卷评分、性交不成功次数与成功次数的改变情况。疗效判断标准：治愈--阴茎能够正常勃起，坚挺有力,顺利完成性交。有效--阴茎能够勃起，时好时坏，能勉强进行性交。无效--勃起状况虽有改善，但性交不成功。

治疗方法：服用胶囊G(依据实施例7所述方法制备得到)，每日3次，连续服用1个月。

治疗结果：通过服用本发明所述的药物，最终在临床30例病例中其治愈22例，治愈率为73.3％，有效5例，有效率为16.7％，总有效为27例，总有效率为90％，可见本发明所述的药物对性功能障碍中勃起功能障碍有显著性的疗效。

典型病例

病例1，胡某，男，48岁，临床症状主要表现为阴茎勃起不坚，尿频，早泄。连续服用地耳草总黄酮胶囊1个月后精神状态改善，治愈，可以正常勃起，晨勃显著。未见副作用。

病例2，任某，男，36岁，临床症状主要表现为阳痿不举，对性生活失去兴趣，伴有头晕乏力，腰膝酸软。连续服用地耳草总黄酮胶囊5周后开始好转，精神状态较前佳，有效。晨勃明显，可以正常勃起持续10min，未见副作用。

病例3，吴某，男，48岁，临床症状主要表现为性欲冷淡，阴茎勃起不坚，连续服用地耳草总黄酮胶囊1个月后性欲增强，晨勃显著，可以正常勃起，治愈。未见副作用。

病例4，李某，男，37岁，临床症状主要表现为阳痿不举，畏寒肢冷。连续服用地耳草总黄酮胶囊3周后开始好转，症状大幅度减轻，4周后晨勃明显，可以正常勃起持续15min，治愈。未见副作用。

病例5，鲁某，男，52岁，临床症状主要表现为阳痿不举。连续服用地耳草总黄酮胶囊5周后开始好转，症状大幅度减轻，6周后晨勃明显，可以正常勃起持续5min，有效，大便次数较前多。

病例6，黄某，男，55岁，临床症状主要表现为阴茎勃起不坚，早泄。连续服用地耳草总黄酮胶囊5周后精神状态改善，治愈，可以正常勃起持续10min，晨勃显著。未见副作用。

病例7，章某，男，57岁，临床症状主要表现为阳痿不举。连续服用地耳草总黄酮胶囊5周后开始好转，6周后晨勃显著，尿量增加200ml/d，有效。没有发现副作用。

病例8，但某，男，43岁，临床症状主要表现为性欲冷淡，阴茎勃起不坚，连续服用地耳草总黄酮胶囊1个月后性欲增强，晨勃显著，可以正常勃起持续13min，治愈。未见副作用。

病例9，杨某，男，70岁，阳痿近20年，长时间没有正常性生活，伴有腰膝酸软等症状。连续服用地耳草总黄酮胶囊2个月后晨勃显著，可以正常勃起，有效。未见副作用。

病例10，刘某，男，46岁，阳痿不举，长时间没有正常性生活，有腰膝酸软、身体乏力等症状。连续服用地耳草总黄酮胶囊2个月后精神状态好转，晨勃显著，可以正常勃起进行性生活，治愈。未见副作用。

病例11，唐某，男，53岁，临床症状主要表现为性欲冷淡，阳痿不举，长时间没有性生活，疲倦乏力，嗜睡。连续富有地耳草总黄酮胶囊2个月后精神状态有所好转，偶见晨勃，仍无法正常完成性生活，无效。未见副作用。

病例12，许某，男，32岁，阳痿不举，长时间没有正常性生活，连续服用地耳草总黄酮胶囊1个月后性欲增强，晨勃显著，可以正常勃起持续20min，治愈。未见副作用。

病例13，龙某，男，38岁，阳痿近10年，长时间没有正常性生活，连续服用地耳草总黄酮胶囊5周后性欲增强，晨勃显著，可以正常勃起持续10min，治愈。未见副作用。

病例14，祝某，男，27岁，临床症状主要表现为阴茎勃起不坚，早泄。连续服用地耳草总黄酮胶囊1个月后精神状态改善，可以正常勃起，晨勃显著，有效。未见副作用。

病例15，李某，男，42岁，临床症状主要表现为性欲冷淡，阴茎勃起不坚，连续服用地耳草总黄酮胶囊4周后性欲增强，晨勃显著，可以正常勃起持续13min，治愈。未见副作用。

从上述临床典型病例可见，本发明在临床上可以显著有效地治疗勃起功能障碍患者，使其勃起硬度增加、勃起持续时间延长正常完成性生活极大地改善了患者的生活质量，且所有病例均未发现副作用。

综上，本发明采用公认的交配试验和勃起试验进行性功能评价，采用少弱精子模型评价其对提高精子数量和活力的影响，动物模型科学有效；同时通过临床病例研究证明，地耳草提取物各组分之间协同增效，可以增加捕捉次数和射精次数，缩短勃起潜伏期，具有改善性功能的效果，且同时具有提高精子活力和数量作用，对少弱精症状具有良好的改善效果。因此，地耳草提取物可有效改善性功能障碍和少弱精症。

Claims (2)

1.一种地耳草提取物在制备治疗性功能障碍药物中的应用，其特征在于：所述性功能障碍为勃起功能障碍、少精、弱精中的任意一种或几种；所述的地耳草提取物为地耳草中提取的总黄酮类成分，其总黄酮的含量不低于30％。

2.根据权利要求1所述的一种地耳草提取物在制备治疗性功能障碍药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服制剂。

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