CN105267944A - 一种用于糖尿病及其并发症的水蛭小肽有效部位药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防或治疗糖尿病及其并发症的水蛭小肽有效部位组合物，属于中药领域。该组合物是由从水蛭中提取的水蛭小肽、从黄芪中提取的黄芪总皂苷、从枸杞子中提取枸杞子总多糖和从山茱萸中提取的山茱萸总苷按一定配比组成，加入药剂学常规辅料，制成各种剂型，临床可用于预防或治疗糖尿病及其并发症。

Description

一种用于糖尿病及其并发症的水蛭小肽有效部位药物

技术领域

本发明涉及一种具有预防或治疗糖尿病及其并发症作用的水蛭小肽有效部位组合物及其制备方法，具体地说从水蛭、黄芪、枸杞子、山茱萸中提取的中药有效部位组合物及其制备方法，属于中药领域。

背景技术

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一种由多种原因引起糖代谢紊乱的终身性内分泌疾病，目前世界范同内DM患者人数约2.4亿人，估计到2025年，将达到3.5亿人。糖尿病引起的糖代谢紊乱，导致微血管病变，继而引起一系列糖尿病并发症，包括糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病和糖尿病足等。其中糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）和糖尿病视网膜病变(diabeticratinopathy，DR)是糖尿病常见且严重的并发症。糖尿病病人一旦发生肾病变，出现持续性尿蛋白，则病情逐渐发展直至肾功能衰竭，最终死亡。糖尿病视网膜病变是DM最常见和严重的并发症之一，是DM代谢紊乱、内分泌及血液系统损害在视网膜上的反映，是致盲的主要原因之一。糖尿病及其并发症正在对人类健康构成严重威胁！

现代医学治疗本病采用降糖药和胰岛素制剂，虽可使血糖迅速下降，但长期应用易产生抗药性和依赖性，特别是当并发症产生之后，单纯控制血糖并不能完全阻止其病理进程的继续。WHO糖尿病专家委员会指出：许多地区用中药治疗糖尿病有效，需要对这些疗法进行有条理的研究，以确定他们治疗糖尿病的机理。因此，国内外学者都在致力于寻求高效、安全、服用方便的糖尿病新药。

糖尿病属于中医学消渴病范畴，中医历代医书记载的“消渴病”即主要指糖尿病。首先，在《内经》中即有消渴病的较完整的记载，在《金匮》中已列有消渴病专篇。宋代则创立了三消分治的理论，金元时期已形成燥热与阴虚两大学说。明清以后又进一步充实了气虚、脾肾阳虚及痰湿的病理内容，开拓了从肝论治的先河。近代在大量临床研究及实验研究中已取得许多成就，已确立了较为统一的分为阴虚火旺、气阴两虚、阴阳两虚、血瘀气滞等的辨证标准及相应的治则与方药，药物研究也证明了多种中药的降糖作用，临床上已有效地减少了西药降糖药物的剂量，提高了机体对胰岛素的利用率，尤其是活血化瘀法、补肾法的运用，进一步展示了中医药治疗糖尿病的科学性和优越性，体会到阴虚是糖尿病发生的关键，气虚是其迁延的症结，血瘀是其合并症发生的重要原因，而且临床糖尿病患者气阴两虚多兼血瘀。有鉴于此，确立了益气养阴、活血化瘀治疗Ⅱ型糖尿病气阴两虚证的治疗大法，通过系统的临床观察与实验研究，证明其治疗糖尿病的良好疗效，并揭示了其治疗糖尿病的机理，为中医药防治糖尿病提供了科学依据。

而现阶段的中药复方，有效成分含量较低，服用量较大，药效较差。而用有效成分组方能源于中药高于中药，使用剂量小，有效成分可控，是一种非常理想的药物。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有预防或治疗糖尿病及其并发症的水蛭小肽有效部位组合物；

本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法和用途。

本发明的第一目的：以水蛭小肽、黄芪总皂苷、枸杞子多糖和山茱萸总苷为原料，加入适当药用辅料，制成相关的剂型。

本发明药物的组合物的原料药的组成及配比为：水蛭小肽3～9重量份、黄芪总皂苷1～3重量份、枸杞子总多糖10～20重量份和山茱萸总苷2～4重量份。

本发明中药药物组合物优选的组成及配比为：水蛭小肽6重量份；黄芪总皂苷2重量份；枸杞子多糖15重量份；山茱萸总苷5重量份。

上述水蛭小肽有效部位中总小肽的含量不低于提取物的50%，总皂苷有效部位中总皂苷不低于提取物的30%，总多糖有效部位中总多糖不低于提取物的5%，总苷有效部位中总苷不低于提取物的10%。

该药物组合物可以加入相应辅料，制成丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂中的任一种。然后可以再加入其他具有预防或治疗糖尿病及其并发症的有效部位、有效成分、化学合成品或者半合成品，然后再加入相应辅料，制成丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂中的任一种。

本发明中药组合物的制备方法包括以下步骤：

①水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加5～20倍量水匀浆5～15分钟，加热煮沸5～30分钟，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量0.5%～10%的胃蛋白酶，在30℃～45℃条件下酶解1～6小时，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至7～10，加入底物量0.5%～10%的胰蛋白酶，在45℃～55℃条件下酶解1～6小时，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸5～15分钟，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1%～3%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

②黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加5～20倍量60%～80%乙醇，回流提取1～3次，每次1～3小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10～12，用高速离心机离心(3000～5000r/min，10～30min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量:生药量=1:1～1:5，g/g，上样时柱流速10～40ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%～40%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以60%～80%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

③枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加5～20倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂1～3次，每次1～3小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加5～20倍量70%～90%乙醇回流1～2次，每次0.5～1.5小时，过滤，滤渣加5～20倍量水加热回流提取1～3次，每次1～3小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

④山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，6～10倍量水浸泡过夜，煎煮提取1～3次，每次1～3小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量:生药量=1:1～1:5，g/g，上样时柱流速10～40ml/min)流出液弃去，先用3～5倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以4～6倍量25%～40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%；

按照各有效部位的重量配比取上述四份有效部位，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。

增加：各树脂的型号可以是D101大孔树脂、D201大孔树脂、AB-8大孔树脂，001×2.5、001×7、001×15型阳离子交换树脂。

总小肽、总皂苷、总多糖、总苷含量测定方法为：

总小肽的含量测定方法为：取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每毫升含0.25mg的溶液，即得。精密量取对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置具塞试管中，各精密加水至1.0ml，再分别精密加碱性铜试液1．0ml，摇匀，各精密加入福林酚试液［取福林试液储备液(1→16)］4．0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5min，取出，置冷水浴中冷却10min，迅速测定，以0管为空白，照紫外－可见分光光度法，在650nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，牛血清白蛋白质量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。精密量取提取液1ml，别置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；照标准曲线的制备项下自分别精密加碱性铜试液1.0ml起，依法测定吸光度，从回归方程中计算多肽的含量。

总皂苷含量测定方法为：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。精密量取对照品溶液50，100，150，200，250ul分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂，残渣加新鲜配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，于70℃水浴中保温15min，取出，流水冷却，加5ml冰醋酸，摇匀，以随行试剂为空白，照紫外－可见分光光度法，于540nm波长出测定吸收度。以吸光度为纵坐标，取样浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。称取样品20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液；照标准曲线的制备项下自分别置具塞试管中起，依法测定吸光度，从回归方程中计算总皂苷的含量。

总多糖测定方法：取无水葡萄糖对照品25mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水适量溶解，稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水葡萄糖0.1mg)。精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，分别加水补至2.0ml，各精密加入5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，摇匀，放置10分钟，置40℃水浴中保温15分钟，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA)，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。称取样品100mg，精密称定，置250ml量瓶中，用水定容，摇匀，精密量取1ml，置具塞试管中，加水1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“各精密加入5％苯酚溶液1ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。

总苷含量测定方法：准确称取齐墩果酸9.80mg，用甲醇溶解定容至10ml，制成标准溶液。吸取标准溶液30、60、90、120和150μl，分别加入到5支干燥具塞试管中，水浴蒸干，各加入0.2ml5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸，于60℃恒温水浴20min，置冰浴中3min，加入5.0ml冰醋酸，摇匀，随行试剂空白，在545nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，齐墩果酸微克数为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。取样品5mg，用甲醇溶解定容到10ml，精密吸取100ul，照标准曲线制备项下的方法，自“置干燥具塞试管中”起，依法测定吸光度，从从回归方程中计算总苷的含量。

经过发明人的对比优选后，确定了上述有效部位的最佳重量配比为水蛭小肽6重量份；黄芪总皂苷2重量份；枸杞子多糖15重量份；山茱萸总苷3重量份。按照比例取上述水蛭小肽、黄芪总皂苷、枸杞子多糖和山茱萸总苷，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。

本发明药物组合物可制成的剂型为片剂、胶囊剂。

以上所说的药剂学常规辅料包括但不限于润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁；崩解剂，如羧甲淀粉钠；粘合剂，如纤维素衍生物；赋形剂，如乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸镁，微晶纤维素、羊毛脂、凡士林、蜂腊、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等。

本发明有效部位组合物用于预防或治疗糖尿病及其并发症。

有益效果

本发明中药组合物，是按传统中医药理论同时结合现代医学研究成果组方而成，具备中医学特色，同时符合现代医学的治疗原则。

糖代谢紊乱是糖尿病的重要病理生理学基础，是糖尿病患者血糖失衡的重要原因之一。现代研究表明，血糖升高和胰岛素分泌减少是Ⅱ型糖尿病的主要特征。体内长期持续的高血糖状态可通过氧化应激或非氧化应激反应等途径诱发胰岛细胞凋亡，导致细胞数量减少，胰岛素分泌量降低；另外，高血糖或游离脂肪酸所造成的氧化应激或非氧化应激损伤可导致胰岛细胞合成和分泌胰岛素的功能受损，单个细胞分泌的胰岛素减少。糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变的患者都存在着不同程度的高粘、高凝、高脂血症。因此，调节糖代谢、维持血糖平衡、改善血液粘度是预防和治疗糖尿病及其并发症的一个重要途径。

本发明以传统中医理论为指导思想，同时结合国内外的相关研究成果，在预防和治疗糖尿病及其并发症方面效果显著。方中以黄芪为君，黄芪味甘，性微温，有益气固表、敛汗固脱、利水消肿的功效，为预防和治疗糖尿病及其并发症的常用药，故为君；现代药理研究表明，黄芪可以调节血糖水平，改善血管功能，改变肾脏的血流动力学，保护残余肾功能，延缓糖尿病肾病的病程。水蛭味咸，性平，为传统的破瘀活血药物，具有抗凝、抗粘和降低血脂作用，服用水蛭提取物，不仅可以改善血液流变学指标，而且能够增强纤溶活性及减轻氧自由基损伤等。山茱萸，味酸涩，性微温，具有补益肝肾，收敛固涩的作用。现代药理学研究发现，山茱萸有对高糖致RMC增殖的作用，其中山茱萸总苷能延缓小鼠肾病变的进程及降低肾病变的严重程度。枸杞子，味甘，性平，具有滋补肝肾，益精明目的作用。现代研究结果表明，枸杞总多糖可有效控制糖尿病大鼠的血糖水平，提高其机体胰岛素水平。

本发明产品成分明确，疗效稳定，服用量小，安全性高，不仅符合传统中医药治疗糖尿病的组方原则，而且符合中药现代化的发展要求，对推动医药产业从仿制向自主创新转变以及对推动我国中药国际化具有重要意义。经查阅相关文献和专利，未检索到以水蛭、黄芪、枸杞子、山茱萸的有效部位做为原料，生产加工并制成适宜药物制剂用于糖尿病及其并发症预防及治疗或辅助治疗的报道。

为进一步验证本发明的药理作用，用本发明片剂进行动物药效学实验。

试验内容：对大鼠糖尿病的治疗作用。

1试剂、样品和动物

1.1试剂

四氧嘧啶；盐酸氯氨酮注射液，上海第一制药厂生产；血糖试剂盒，北京中生生物工程高技术公司生产；胰岛素放免试剂盒，中国原子能科学研究院提供；胰高血糖素放免试剂盒，中国原子能科学研究院提供。

1.2供试样品

样品1：（本发明片剂）

水蛭小肽的制备：取水蛭1kg，适当粉碎，加10倍量水匀浆10min，加热煮沸15min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量10%的胃蛋白酶，在40℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8.0，加入底物量10%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽（含量50%）；取黄芪饮片10kg，适当粉碎，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10～12，用高速离心机离心(3000～5000r/min，10～30min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：2，g/g，上样时柱流速30ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用40%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)（含量90%）；取枸杞子5kg，适当粉碎，加10倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂2次，每次1小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加10倍量80%乙醇回流2次，每次1小时，过滤，滤渣加10倍量水加热回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品（含量10%）；取山茱萸粗粉6kg，8倍量水浸泡过夜，煎煮提取2次，每次1小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：2，g/g，上样时柱流速30ml/min)流出液弃去，先用3倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以5倍量30%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品（含量10%）。

取水蛭小肽120g、黄芪总皂苷40g、枸杞总多糖300g、山茱萸总苷60g，加入微晶纤维素120g、羧甲淀粉钠10g、淀粉20g、硬脂酸镁10g，制成片剂，每片0.25g。

样品2：（本发明胶囊剂）

采用样品1制备的有效部位原料。

取水蛭小肽60g、黄芪总皂苷20g、枸杞总多糖150g、山茱萸总苷30g，加入淀粉至300g，制成胶囊剂1000粒，每粒0.3g。

样品3：

采用样品1制备的有效部位原料。

取水蛭小肽20g、黄芪总皂苷15g、枸杞总多糖170g、山茱萸总苷65g，加入淀粉至300g，制成胶囊剂1000粒，每粒0.3g。

样品4：

采用样品1制备的有效部位原料。

取水蛭小肽80g、黄芪总皂苷40g、枸杞总多糖130g、山茱萸总苷10g，加入淀粉至300g，制成胶囊剂1000粒，每粒0.3g。

给药前，取上述相应制剂，研细，采用纯水配制成所需要的药物浓度。

1.3实验动物

Wistar大白鼠40只，雌雄各半，由山东中医药大学试验动物中心提供。

2.实验方法

选取体重180--220g的wises大鼠35只，随机分成正常对照组((5只)和四氧嘧啶组(30只)。每5只为一笼喂养，称重，染色标号。实验前大鼠禁食〔不禁水)6h，各鼠以2m1/kg的剂量腹腔注射盐酸氯胺酮注射液(2m1：0.1g氯氨酮)，麻醉完全以后，乙醇擦拭大鼠尾部以利J血管扩张，四氧嘧啶组尾静脉迅速（不超过30’）推注2%的四氧嘧啶溶液(以PH为4.003的苯二甲酸氢钾为溶剂，临用现溶)，剂量为40mg/kg；正常对照组尾静脉推注相同体积的0.9%灭菌生理盐水。

造模48h后，禁食(不禁水)6h，各鼠装入固定筒内，固定在试管架上，在37℃左右的高温环境里断尾取血约1ml，用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。造模组中选取血糖高于9.99mmo1/L(180mg/dl)者作为成功的糖尿病病理模型，并依血糖水平分层，再随机分为7组：生理盐水组、本药物样品1、2、3、4组、消渴丸组、每组5只，各组大鼠平均血糖差值不超过1.11mmol/L(20mg/d1)，重新染色标号；正常对照组5只，于造模组成功分组后第一次采血的同时，同样采血作治疗前血糖指标测定。各组均喂以基础饲料(总热量3.7keal/g，含碳水化合物53%、脂肪9%、蛋白质20%)，食量不限，自由饮水，每日换笼1次，换水两次，每周称重一次。

①正常对照组：以0.9%灭菌生理盐水20ml/kg用量灌胃，每日1次。

②生理盐水组：以0.9%灭菌生理盐水20ml/kg用量灌胃，每日1次。

③④⑤⑥本药物样品1、2、3、4组：以50%的本药物溶液20ml/kg用量灌胃，每日1次。

⑦消渴丸组：以3.5%的消渴丸混悬液20ml/kg用量灌胃，每日1次。其剂量为消渴丸0.7g/kg，相当于成人口量的5倍。

以上七组在糖尿病动物模型复布师助分组后，当天即开始灌胃给药，每日1次，连续4周。4周后采血复查血糖等指标。断颈处死动物，摘取肝脏，用于检测肝糖元含量。

观察指标及测定方法

1.血糖（BG）含量：葡萄糖氧化酶法，按试剂盒说明操作。

2.肝糖元含量：蒽酮法测定。

3.血浆胰岛素含量：放射免疫法，按试剂盒说明操作。

4.血浆胰高血糖素含量：放射免疫法，按试剂盒说明操作。

结果见表：

表1本药物对糖尿病大鼠BG（mmol/L）水平的影响（X±s）

注：与疗前比较*P＜0.01；与疗前比较▲P＜0.01；与生理盐水组比较△P＜0.01；与消渴丸组比☆P＞0.05。

由表1可知，Alloxan所致的糖尿病大鼠FBG水平显著增高，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01），表明Alloxan所致的糖尿病大鼠模型成功。样品1、2、3、4组，FBG水平下降，与疗前自身对照及疗后生理盐水组比较，均具有极显著差异（P＜0.01），表明本药物具有明显降低高血糖的效果；样品1、2与消渴丸组相比，无显著性差异（P＞0.05），表明样品1、2的降糖作用与消渴丸相当。样品3、4较差，证明本发明疗效好，不在本发明比例的药物疗效较差。

表2本药物对糖尿病大鼠肝糖元含量的影响（X±s）

注：与正常对照组比**P＜0.01；与生理盐水相比▲P＞0.05；▲▲P＜0.05、▲▲▲P＜0.01

由表2可知，生理盐水组的肝糖元含量明显低于正常对照组（P＜0.01），说明Alloxan所致糖尿病大鼠存在着明显的肝糖元合成功能减弱，消渴丸组对大鼠肝糖元变化不明显，与生理盐水组无差异（P＞0.05），本药物样品1、2优于样品3、4，证明本发明疗效好，不在本发明比例的药物疗效较差。

表3本药物对糖尿病大鼠血清INS的影响（X±s）

注：与正常对照组比较**P＜0.01；与生理盐水组比较▲P＜0.05▲▲P＜0.01；与消渴丸组比☆P＜0.05。

由表3可知，用Alloxan造模的糖尿病大鼠血清胰岛素水平明显下降，与正常对照组比有显著性差异（P＜0.01），经相应药物治疗后血清胰岛素水平上升，而以消渴丸升高最为显著，样品1、2次之，样品3、4组又次之，与生理盐水组相比均有显著性差异（P＜0.05~0.01），表明本药物具有促进胰岛素分泌的作用。证明本发明疗效好，不在本发明比例的药物疗效较差。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步阐明本发明的技术方案，但是本发明申请所要保护的内容不仅仅如此。实际生产中的用量不仅限于实例中的药物用量，可以用吨、千克、克等计量单位，但是各原料药物的用量配比仍依据本方明的技术方案。

实施例1：

处方：水蛭小肽1.2kg、黄芪总皂苷0.4kg、枸杞总多糖3kg、山茱萸总苷0.6kg

制法：水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加10倍量水匀浆10min，加热煮沸10min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量8%的胃蛋白酶，在37℃条件下酶解1h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8，加入底物量8%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解3h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加10倍量80%乙醇，回流提取2小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10，用高速离心机离心(4500r/min，20min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：2，g/g，上样时柱流速20ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加10倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂2次，每次2小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加10倍量70%乙醇回流2次，每次1小时，过滤，滤渣加10倍量水加热回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，8倍量水浸泡过夜，煎煮提取3次，每次2小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：3，g/g，上样时柱流速30ml/min)流出液弃去，先用4倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以5倍量30%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%。

加入微晶纤维素1.2kg、羧甲淀粉钠0.1kg、淀粉0.2kg、硬脂酸镁0.1kg，制成片剂，每片0.25g。

实施例2：

处方：取水蛭小肽80g、黄芪总皂苷20g、枸杞总多糖140g、山茱萸总苷40g

制法：水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加15倍量水匀浆15min，加热煮沸30min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量10%的胃蛋白酶，在37℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至9，加入底物量10%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入3%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加20倍量60%乙醇，回流提取3小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至11，用高速离心机离心(4000r/min，10min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：1，g/g，上样时柱流速10ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以60%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加5倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂3次，每次1小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加20倍量70%乙醇回流2次，每次1.5小时，过滤，滤渣加5倍量水加热回流提取3次，每次1小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，10倍量水浸泡过夜，煎煮提取3次，每次3小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：4，g/g，上样时柱流速20ml/min)流出液弃去，先用5倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以6倍量40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%。

加入淀粉至300g，混匀，制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

实施例3：

处方：取水蛭小肽300g、黄芪总皂苷300g、枸杞总多糖1600g、山茱萸总苷400g。

制法：水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加5倍量水匀浆55min，加热煮沸5min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量0.5%的胃蛋白酶，在30℃条件下酶解1h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8，加入底物量0.5%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解3h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸5min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加5倍量60%乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10，用高速离心机离心(3000r/min，10min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：3，g/g，上样时柱流速20ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用35%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加20倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂3次，每次1小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加20倍量70%乙醇回流2次，每次1小时，过滤，滤渣加10倍量水加热回流提取3次，每次1小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，7倍量水浸泡过夜，煎煮提取3次，每次2小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：3，g/g，上样时柱流速20ml/min)流出液弃去，先用5倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以6倍量25%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%。

取上述各有效部位，粉碎，混合，加大豆油至3000g，混匀，压制成软胶囊，制成6000粒，即得。

实施例4：

处方：水蛭小肽1.1kg、黄芪总皂苷0.5kg、枸杞总多糖3kg、山茱萸总苷0.6kg

制法：水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加8倍量水匀浆10min，加热煮沸10min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量10%的胃蛋白酶，在37℃条件下酶解1h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8，加入底物量8%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解3h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加8倍量80%乙醇，回流提取2小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10，用高速离心机离心(4000r/min，20min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：3，g/g，上样时柱流速20ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加10倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂2次，每次2小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加10倍量70%乙醇回流2次，每次1小时，过滤，滤渣加10倍量水加热回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，10倍量水浸泡过夜，煎煮提取3次，每次2小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：4，g/g，上样时柱流速20ml/min)流出液弃去，先用4倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以6倍量40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%。

加入微晶纤维素1.2kg、羧甲淀粉钠0.1kg、淀粉0.2kg、硬脂酸镁0.1kg，制成片剂，每片0.25g。

实施例5：

处方：取水蛭小肽70g、黄芪总皂苷30g、枸杞总多糖150g、山茱萸总苷30g

制法：水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加10倍量水匀浆15min，加热煮沸30min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量10%的胃蛋白酶，在37℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至9，加入底物量10%的胰蛋白酶，在45℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入3%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加10倍量60%乙醇，回流提取3小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至11，用高速离心机离心(4000r/min，10min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量：生药量=1：4，g/g，上样时柱流速10ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以60%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加10倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂3次，每次1小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加20倍量70%乙醇回流2次，每次1.5小时，过滤，滤渣加5倍量水加热回流提取3次，每次1小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，10倍量水浸泡过夜，煎煮提取3次，每次3小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量：生药量=1：4，3g/g，上样时柱流速20ml/min)流出液弃去，先用5倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以6倍量40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%。

加入淀粉至300g，混匀，制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

实施例6：

取实施例1所制片剂治疗NIDDM患者300例，男性205例，女性95例，年龄最小者35岁，最大者65岁，病程最长15年，最短1年，其中门诊病人90例，住院病人210例。治疗方案：口服，1次4粒，一日3次，均于饭前半小时服。每4周为1个疗程，观察3个疗程。患者在用药期间，停用其它治疗糖尿病的药物。记录主要临床症状，并发症及舌、脉象变化；治疗前及治疗后测定空腹血糖、24小时尿糖定量（限于住院病人）、血脂、血压、体重、血流变等指标；部分患者做血清胰岛素释放试验，查眼底、心电图、肝肾功能，血、尿常规。结果：治愈32例，显效65例，有效193例，总有效率为：96.7%。

Claims (4)

1.一种用于预防或治疗糖尿病及其并发症的水蛭小肽有效部位组合物，其特征在于是由从水蛭中提取的水蛭小肽、从黄芪中提取的黄芪总皂苷、从枸杞子中提取枸杞总多糖和从山茱萸中提取的山茱萸总苷组成的，其中，各有效部位的重量配比为：

水蛭小肽3～9重量份

黄芪总皂苷1～3重量份

枸杞子总多糖10～20重量份

山茱萸总苷2～4重量份。

2.如权利要求1所述的水蛭小肽有效部位组合物，其特征在于各有效部位的重量配比为：水蛭小肽6重量份、黄芪总皂苷2重量份、枸杞子总多糖15重量份、山茱萸总苷3重量份。

3.如权利要求1或2所述的水蛭小肽有效部位组合物，其特征在于其制备方法包含以下步骤：

水蛭小肽的制备：取水蛭，适当粉碎，加5～20倍量水匀浆5～15分钟，加热煮沸5～30分钟，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量0.5%～10%的胃蛋白酶，在30℃～45℃条件下酶解1～6小时，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至7～10，加入底物量0.5%～10%的胰蛋白酶，在45℃～55℃条件下酶解1～6小时，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸5～15分钟，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1%～3%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得水蛭小肽；其中水蛭小肽的含量为50%～90%；

黄芪总皂苷的制备：取黄芪饮片，适当粉碎，加5～20倍量60%～80%乙醇，回流提取1～3次，每次1～3小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，再加水使成相对密度为1.01～1.04(20℃)的药液，搅拌下加入氢氧化钙调pH至10～12，用高速离心机离心(3000～5000r/min，10～30min)得上清液，将上清液加入预先处理好的D10l大孔吸附树脂柱中（D101大孔吸附树脂量:生药量=1:1～1:5，g/g，上样时柱流速10～40ml/min)，流出液弃去，先用清水洗脱至流出液近无色，继用30%～40%乙醇洗脱至流出液呈淡黄色，以上流出液均弃去，再以60%～80%乙醇洗脱，收集洗脱液至薄层层析检查无黄芪甲苷斑点，减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷粗品(黄褐色)，其中黄芪甲苷的含量为30%～50%；

枸杞子总多糖的制备：取枸杞子，适当粉碎，加5～20倍量石油醚（60～90℃）回流脱脂1～3次，每次1～3小时，直至溶液无色，过滤，滤渣挥干溶剂后，加5～20倍量70%～90%乙醇回流1～2次，每次0.5～1.5小时，过滤，滤渣加5～20倍量水加热回流提取1～3次，每次1～3小时，过滤，滤液减压干燥，得枸杞多糖粗品；其中枸杞多糖的含量为5%～15%；

山茱萸总苷的制备：取山茱萸粗粉，6～10倍量水浸泡过夜，煎煮提取1～3次，每次1～3小时，滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍量乙醇搅匀，冷藏过夜，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得山茱萸提取液，将山茱萸提取液加入预先处理好的AB-8大孔吸附树脂中（AB-8大孔吸附树脂量:生药量=1:1～1:5，g/g，上样时柱流速10～40ml/min)流出液弃去，先用3～5倍量蒸馏水洗脱，流出液均弃去，再以4～6倍量25%～40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，低温干燥，得山茱萸总苷粗品；其中马钱苷的含量为10%～30%；

按照各有效部位的重量配比取上述四份有效部位，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。

4.权利要求1或2所述的水蛭小肽有效部位组合物用于预防或治疗糖尿病及其并发症。