CN108379404A - 一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术 - Google Patents
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Abstract
本技术方案公开了一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，所述神经细胞损伤修复药物是按如下方法制备的：以鸢尾、狭叶五味子、红花为原料，提取，分离，纯化，即得螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A、红花黄酮苷B组成的神经细胞损伤修复药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，具体是涉及一种由鸢尾、狭叶五味子、红花组成的配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术。
背景技术
中药来自植物、动物、矿物，是药物的重要组成部分。早在商代初期，人们就从中药中提取制备有效部位，用于防病治病，如中药煎汤内服或外用；明代《本草纲目》详细记载了用升华法等制备、纯化樟脑的过程；《白猿记》记述了从新鲜草乌中提取分离得到结晶形乌头碱的方法；《医学入门》中记载了用发酵法从五倍子中制备没食子酸的过程，这是世界上最早制备有机酸的记载。这些都说明了我国古代药学家在中药化学领域的突出贡献。据国外文献记载，1805年德国药师塞图尔从阿片中提取的吗啡碱，被认为是中药中第一个天然活性成分；20世纪50年代初，从印度民间草药萝芙木中发现了降压成分利血平；20世纪50年代末期，从长春花中得到了抗癌成分长春花碱；特别是紫杉醇的问世被誉为20世纪90年代国际上抗癌三大成就之一，是一种非常有发展前途的抗癌新药。近几十年来，随着先进的科学技术、分离分析方法的不断发展，各种色谱技术的广泛应用，中药化学成分的提取、分离和纯化技术也有了很大进步，亲水性成分、微量成分、类似结构的复杂混合物成分的分离已经不再困难；同时红外、核磁共振、质谱的等波谱新技术的问世，使结构鉴定工作趋向微量、快速和准确，研究中药化学成分的周期大大缩短。
据文献报道，目前我国有中草药资源8000多种，少数民族用药3000多种，其中绝大部分是植物药，少数为动物药和矿物药，如此丰富的资源为进一步开发中药有效成分提供了雄厚的物质基础。但是建国前，受整个国家的经济实力及科学技术综合发展水平等条件的限制，中药化学研究基本没有什么突破，更没有建立起中药化学制药工业。建国以来，尤其近一、二十年来，与其它各项科学事业一样，中药化学迎来了蓬勃发展的新时代。麻黄素、芦丁、西地兰等十几种中药产品的工业生产已经进行多年，甾体激素类药物的原料——薯芋皂苷元的工业生产及其资源开发研究更取得巨大的成就，不仅保证国内需要，还有大量出口。文献报道，目前已在涉及到的500多种药材中，发现了8000多种化合物。除原有的中国科学院上海药物研究所、昆明植物所、中国医学科学院药物研究所及药用植物资源开发所外，全国各地的医药院校、卫生部门几乎也都普遍设立了从事中药化学的研究机构。中药化学在中药现代化的进程中发挥着前所未有的作用，并成为医药高等院校的必修课程。近十年来，随着对外开放政策的贯彻执行，大大地推动了我国科学界与国外同行间的学术交流及人员交往，中药化学则是在药学及化学领域中与国外人员交往最为频繁、学术交流最为活跃的一个学科。这对提高我国研究水平，促进研究队伍的成长起到了重要作用。目前，我国中药化学研究工作的步伐已经大大加快，研究水平也有很大提高，加上我国丰富的资源，相信在21世纪一定能对人类的健康事业作出更大的贡献。
神经系统疾病目前已成为国内外学者重点关注医学领域，而神经性疼痛是指由中枢或外周神经系统原发性病变或功能障碍而引起的疼痛综合征。可由外伤或/和疾病致末梢神经、脊髓后根、脊髓及其以上中枢神经某些部位损伤而引发。根据神经损伤的病因、性质和程度不同，在临床上分为中枢神经疼痛和外周神经损伤所致的周围神经疼痛两大类。中枢神经疼痛简称中枢痛，为中枢神经系统的疼痛传导通路发生损害或功能障碍而引起的原发性疼痛，常见于脊髓的创伤或脑血管疾病，多发性硬化症和肿瘤等。周围神经疼痛系外伤、缺血、压迫、感染、炎症、代谢等因素损伤外周神经所致，如幻肢痛，带状疱疹后神经痛，多发性神经炎，糖尿病性周围神经痛等。据估计，这种疾病正折磨着全球2.8%-4.7%的人口，流行病学显示普通人群的发生率为6%-7.7%。糖尿病神经痛和带状疱疹后继发疼痛是成人神经痛最普遍的形式，发生率分别为13%-37%和10%-40%，随着人口的老龄化发生率更高，年发病率为12/10万。神经性疼痛综合征在老年人中的发病率不断提高：一方面是癌症、HIV、糖尿病和其它经常引发神经性疼痛的疾病患者中长期存活的病人增多；另一方面，药物和外科手术治疗肿瘤和其它疾病时也可以产生神经性疼痛。发病时患者通常有灼烧般疼痛、有刺痛感或有如电击的痛感，非常剧烈，如刀剜般的剧痛。这种痛感，是突然地发作，痛的部位及其范围，限于该神经的支配领域。发作时，压下神经靠近表皮的部位，就会感到剧烈的疼痛。神经性疼痛会对患者的生活产生重大的影响，它夺去了很多人的工作、走路甚至穿衣的能力。目前市场上没有一种安全有效的药物能缓解这类患者的痛苦。治疗多用抗惊厥药、阿片类药物、和抗抑郁药物治疗，但多数产品并不是专门针对神经性疼痛的，大多数对大部分患者无效或只能适度缓解疼痛，且会引起不良反应。因此，提高神经性疼痛的治疗与预防水平、改善神经性疼痛病人生活质量，开发防治神经性疼痛的药物意义重大。
红花，（拉丁学名：Carthamus tinctorius L.），别名：红蓝花、刺红花，菊科、红花属植物，干燥的管状花，橙红色，花管狭细，先端5裂，裂片狭线形，花药黄色，联合成管，高出裂片之外，其中央有柱头露出。具特异香气，味微苦。以花片长、色鲜红、质柔软者为佳。主产河南、湖南、四川、新疆、西藏等地。活血通经，散瘀止痛，有助于治经闭、痛经、恶露不行、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌打损伤、疮疡肿痛疗效。有活血化瘀，散湿去肿的功效，避免孕妇使用，否则会造成流产。
鸢尾，为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorum Maxim的根茎。夏、秋季采收，除去须根，晒干。性寒，味辛、苦；有毒。功能主治：消积、破瘀，行水，解毒。用于食滞胀满、症瘕积聚、肿毒、痔瘘、跌打损伤。生于林下、山脚及溪边的潮湿地。我国大部分地区有栽培，主产广东、广西、四川。
狭叶五味子，为木兰目五味子科植物狭叶五味子lancifolia Schisandralancifolia的干燥成熟果实。微苦、涩，温。祛瘀消肿，止血接骨。用于跌打损伤，骨折，外伤出血。果实：酸、涩，温。用于肾虚。落叶木质藤本，全株无毛，小枝褐色，具纵细条凸起。当年生幼枝伸长或不伸长成短枝。芽鳞纸质，内芽鳞三角状卵形，长3-5毫米，先端短硬尖，早落。叶纸质，狭椭圆形或披针形，长4-10厘米，宽1.5-2.5厘米，先端渐尖，基部阔楔形或狭楔形，下延至叶柄成狭翅，上半部边缘具不明显的胼胝质浅齿，两面绿色，中脉及侧脉凹下，侧脉每边4-6条。花1-2朵，腋生于当年短枝上，花梗基部有叶状小苞片；雄花：花梗长2-5厘米，花被片6-8，淡黄色，薄肉质具干膜边缘，椭圆形或近圆形，中间最大的一片，长3.5-5.5毫米；雄蕊群倒卵圆形，高2.5-3.5毫米，花托椭圆状卵圆形，顶端伸长短圆柱形，具圆形盾状附属物；雄蕊10-15枚，花托上部的雄蕊贴生于花托顶端无花丝；下部的具长0.2-0.5的花丝，花药长0.6-1.3毫米，两药室近平行，内侧向开裂，药隔宽阔，近圆形，约与花药等长，具不明显的腺点；雌花：花梗和花被片与雄花的相同；雌蕊群近卵圆形，长1.5-3.5毫米，雌蕊15-25枚，子房椭体圆形或卵圆形，稍弯，长1.7-3毫米，花柱长0.5-1毫米，紧接向下伸长成平的附属体。聚合果柄纤细，长3-8厘米，成熟小浆果红色，椭圆体形，长6-9毫米，种子扁椭圆体形，长3.5-3.9毫米，种皮有不明显的皱纹，种脐稍凹入。花期5-7月，果期8-9月。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由鸢尾、狭叶五味子、红花组成的配方中提取纯化神经细胞损伤修复药物的技术。本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所用鸢尾，为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorum Maxim的根茎；狭叶五味子，为忍冬科狭叶五味子属植物狭叶五味子Viburnum dilatatum Thunb.的茎叶；红花，菊科红花属植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥的管状花。
一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，是通过如下步骤实现的:
（1）取鸢尾1重量份、狭叶五味子8重量份、红花2重量份，混匀粉碎成粗粉，用95%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，95%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用50%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，50%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液E，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液E与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，干燥，得提取物A；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比65%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比5:95、12:88、20:80的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第3-12色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物D；
（5）将步骤（2）得到的提取物A通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比25:75的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第4-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（6）将步骤（4）得到的提取物D与步骤（5）得到的提取物F合并，即得神经细胞损伤修复药物。
一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于所述的神经细胞损伤修复药物同时含有螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A、红花黄酮苷B。
一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的50%以上。
一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的神经细胞损伤修复药物可以用于制备神经细胞损伤修复药物。
一种神经细胞损伤修复药物，其特征在于同时含有螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A、红花黄酮苷B。
一种神经细胞损伤修复药物，其特征在于神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的50%以上。
本发明首次建立了鸢尾、狭叶五味子、红花配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，采用MCI 凝胶-硅胶干柱相结合的方法，尤其是硅胶干柱用含水乙醇洗脱技术，实现了配方中神经细胞损伤修复药物的成功提取纯化制备，该有效部位同时含有螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B，且总含量占总有效部位的50%以上。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对鸢尾、狭叶五味子、红花配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：鸢尾、狭叶五味子、红花配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化
（1）取鸢尾1重量份、狭叶五味子8重量份、红花2重量份，混匀粉碎成粗粉，用95%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，95%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用50%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，50%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液E，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液E与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，干燥，得提取物A；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比65%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比5:95、12:88、20:80的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第3-12色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物D；
（5）将步骤（2）得到的提取物A通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比25:75的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第4-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（6）将步骤（4）得到的提取物D与步骤（5）得到的提取物F合并，即得神经细胞损伤修复药物。
神经细胞损伤修复药物的成分分离及结构鉴定：
取神经细胞损伤修复药物，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到5个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为螺鸢尾特醛F(spirioidotectal F)、螺鸢尾特醛B(spirioidotectal B)、狭叶五味子宁E（lancifoninE）、红花黄酮苷A(saffloflavoneside A)、红花黄酮苷B(saffloflavoneside B)。经HPLC检测，神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的50%以上。
实施例2：鸢尾、狭叶五味子、红花配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化
（1）取鸢尾1重量份、狭叶五味子6重量份、红花2重量份，混匀粉碎成粗粉，用95%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，95%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用50%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，50%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液E，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液E与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，干燥，得提取物A；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比65%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比5:95、12:88、20:80的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第3-12色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物D；
（5）将步骤（2）得到的提取物A通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比25:75的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第4-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（6）将步骤（4）得到的提取物D与步骤（5）得到的提取物F合并，即得神经细胞损伤修复药物。
神经细胞损伤修复药物的成分分离及结构鉴定：
取神经细胞损伤修复药物，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到4个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为螺鸢尾特醛B(spirioidotectal B)、狭叶五味子宁E（lancifonin E）、红花黄酮苷A(saffloflavonesideA)、红花黄酮苷B(saffloflavoneside B)。经HPLC检测，神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的40%以上。
实施例3：鸢尾、狭叶五味子、红花配方中神经细胞损伤修复药物的提取纯化
（1）取鸢尾6重量份、狭叶五味子25重量份、红花1重量份，混匀粉碎成粗粉，用95%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，95%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用50%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，50%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液E，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液E与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，干燥，得提取物A；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比65%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比5:95、12:88、20:80的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第3-12色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物D；
（5）将步骤（2）得到的提取物A通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比25:75的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第4-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（6）将步骤（4）得到的提取物D与步骤（5）得到的提取物F合并，即得神经细胞损伤修复药物。
神经细胞损伤修复药物的成分分离及结构鉴定：
取神经细胞损伤修复药物，甲醇溶解， 200-300目硅胶拌样，干燥，研匀，先经过硅胶柱色谱，再结合聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱，分离纯化，分别得到4个化合物，经过经理化常数、质谱及核磁共振色谱等光谱数据、化学反应等方法,分别确证为螺鸢尾特醛F(spirioidotectal F)、螺鸢尾特醛B(spirioidotectal B)、狭叶五味子宁E（lancifoninE）、红花黄酮苷A(saffloflavoneside A)。经HPLC检测，神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A的总含量占总有效部位的60%以上。
实验例1、对谷氨酸致PC12细胞损伤的影响试验研究
1.试验材料
1.1药物及试剂
样品：实施例1-3神经细胞损伤修复药物
细胞系：PC12细胞系（（来源：Rattμs norvegicμs肾上腺嗜铬细胞瘤，南京凯基生物科技发展有限公司提供。）；
试剂：H-DMEM细胞培养基（Hyclone， 赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（以色列Bioind）；胰酶细胞消化液（碧云天）,青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司），柠檬酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司），多聚甲醛（solarbio），L-谷氨酸（Klonetech，Japan）。
1.2试验仪器
立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS,上海申安）；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化）；二氧化碳培养箱（BB16μV/BB5060μV，HERAEμS）；台式离心机（H3，Sigma）；酶标仪(Mμltiskan MK3,Thermo Scientific)；电热恒温鼓风干燥箱（101，上海鹏顺科学仪器有限公司）；倒置显微镜（XDS-1B，重庆光学仪器厂）；水浴恒温振荡器（SHZ-82，金坛市医疗仪器厂）；移液器（Gilson，Eppendorf）；培养瓶（Corning）；96孔板（Costar,μSA）
2.试验方法
以谷氨酸制备PC12细胞化学损伤模型，采用噻唑蓝（MTT）法于570nm处测定吸收值，观察候选药物对PC12细胞损伤的修复作用。使用SOD、NO、LDH、MDA试剂盒检测各指标含量，阐明各药的作用机理。
造模：30mmol/l的谷氨酸（此为加样终浓度，溶于不完全培养基中）作用于PC12细胞24h。
分组：空白组、化学损伤模型组、化学损伤+药物组。
3.试验内容
3.1细胞培养
从超低温冰箱中取冻存的PC12细胞复苏于培养瓶中，以含10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养。待PC12细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，调零孔不加细胞。
3.2细胞损伤
待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，无菌PBS液清洗2遍，除调零组、空白对照组外，每孔加入终浓度为30mmol/l的谷氨酸（溶于不完全培养基中）于培养箱内培养24h，即造成PC12细胞损伤模型。
3.3加药修复
弃掉培养基，用无菌PBS液清洗2遍，给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的 DMEM培养基100μl，每个浓度的药物加6孔。以不含药物的DMEM培养基为空白对照组。然后将细胞置入37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h。
3.4指标测定
3.4.1 MTT法测定细胞存活率
弃掉培养基后每孔加入100μl无血清DMEM培养基，再于每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4 h。弃掉培养基加入100μlDMSO用酶标仪于570nm测定OD值，计算细胞存活率：
3.4.2 SOD、LDH含量测定
给药后24小时用无菌管收集细胞上清液，离心20分钟（2000r/min），仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定LDH含量。
给药后24小时弃去上清，加2%Trion-100X，于4℃静置12小时后混匀细胞悬液，离心20分钟（2000r/min），仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定SOD含量。
4.试验结果
所有数据以X±SD表示，单因素方差分析及LSD多组均数两两比较组间差异的显著性，P<0.05为差异显著。
4.1对损伤的PC12细胞存活率的影响
结果显示，实施例1神经细胞损伤修复药物对神经细胞损伤具有很好的修复功能，与模型组无显著性差异，细胞存活率由58%提高至89%。实施例2、实施例3神经细胞损伤修复药物对神经细胞损伤修复作用与模型组无显著性差异。与模型组相比，实施例1神经细胞损伤修复药物使细胞 SOD活力显著增加，LDH浓度显著降低，实施例2、实施例3神经细胞损伤修复药物对SOD活力及LDH浓度影响显著弱于实施例1。
Claims (6)
1.一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于按如下步骤制备:
（1）取鸢尾1重量份、狭叶五味子8重量份、红花2重量份，混匀粉碎成粗粉，用95%乙醇为溶剂提取3次，每次室温浸泡提取4小时，95%乙醇用量为药材总重量的12倍，滤过，合并滤液得提取液A；提取后的药渣再用50%乙醇为溶剂提取2次，每次加热回流提取1.5小时，50%乙醇用量为药材总重量的10倍，滤过，合并滤液得提取液B；提取后的药渣再用水为溶剂加热回流提取1.5小时，滤过，合并滤液得提取液E；
（2）将步骤（1）得到的提取液E在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液E，将步骤（1）得到的提取液B在80℃减压浓缩，浓缩至密度为1.18的浓缩液B，将浓缩液E与浓缩液B合并，得浓缩液C；将步骤（1）得到的提取液A在50℃减压浓缩，干燥，得提取物A；
（3）将步骤（2）得到的浓缩液C中加入95%乙醇，使乙醇重量占比65%，放置24小时，滤过，滤液在50℃减压浓缩，浓缩至无乙醇，得浓缩液D；
（4）将步骤（3）得到的浓缩液D通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比5:95、12:88、20:80的乙醇-水依次洗脱，合计洗脱量为15个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱的第3-12色谱柱体积的流出液，回收溶剂，低温干燥得提取物D；
（5）将步骤（2）得到的提取物A通过MCI 凝胶色谱柱吸附，用水洗脱，洗脱量为5个色谱柱体积，水洗脱液弃去，再用体积比25:75的乙醇-水洗脱，洗脱量为10个色谱柱体积，洗脱液直接通过与MCI 凝胶色谱柱相同色谱柱体积的硅胶色谱柱干柱，收集通过硅胶色谱柱干柱第4-10色谱柱体积的的流出液，回收溶剂，低温干燥，得提取物F；
（6）将步骤（4）得到的提取物D与步骤（5）得到的提取物F合并，即得神经细胞损伤修复药物。
2.根据权利要求1所述一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于所述的神经细胞损伤修复药物同时含有螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A、红花黄酮苷B。
3.根据权利要求1所述一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的50%以上。
4.根据权利要求1所述一种神经细胞损伤修复药物的提取纯化技术，其特征在于用该提取纯化技术得到的神经细胞损伤修复药物可以用于制备神经细胞损伤修复药物。
5.一种神经细胞损伤修复药物，其特征在于同时含有螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A、红花黄酮苷B。
6.根据权利要求5所述一种神经细胞损伤修复药物，其特征在于神经细胞损伤修复药物中螺鸢尾特醛F、螺鸢尾特醛B、狭叶五味子宁E、红花黄酮苷A及红花黄酮苷B的总含量占总有效部位的50%以上。
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| CN109010391A (zh) * | 2018-09-08 | 2018-12-18 | 济南昊雨青田医药技术有限公司 | 一种新鲜榛子叶活性成分的提取纯化及制备技术 |
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