CN109662970B - 一种羊毛甾烷型的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，具体地涉及一种羊毛甾烷型三萜的提取工艺及其在制备抑制血管生成药物的应用。本发明优点在于：提供了金刚纂中得到的三萜类化合物的新用途，实验表明，该化合物对HUVEC迁移、大鼠动脉环均具有明显的抑制作用，说明其具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂应用于肿瘤、关节炎、黄斑病变、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。

Description

一种羊毛甾烷型的应用

三萜技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地涉及一种从金刚纂中提取的化合物，该化合物具有抑制新生血管的生成药物的应用。

背景技术

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。

血管生成是人体内最基本和最重要的生理过程，也是维持机体稳定与完整性，组织和器官功能的重要方式。血管生成在正常生理情况下，仅发生于胚胎发育、创伤修复、妊娠或月经周期的卵巢和子宫内膜，但许多疾病如肿瘤、眼部新血管形成、关节炎、皮肤疾患等可出现持续的、不可控制的血管生成。

恶性肿瘤为世界性的严重危害人类生命健康的常见病之一，其危害已超过心脑血管疾病而成为人类第一位死亡原因，世界卫生组织已称其为人类生命的头号杀手。肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱发的为实体瘤的后续生长及转移提供物质基础的毛细血管新生以及肿瘤中微循环网的形成。肿瘤血管的生成为肿瘤提供了必须的营养成分并排出细胞代谢废物，从而促进了肿瘤的快速生长，甚至通过新生血管进行转移。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。

类风湿关节炎晚期关节科出现不同程度侵蚀性改变及进行性强硬和畸形，而在类风湿性关节炎的发病过程中，血管增生是RA早期的表现，先于其他症状的出现。血管增生为滑膜细胞提供了更多的营养物质，同时也是更多的细胞因子、炎性因子浸润滑膜，这些都促进并维持了血管翳的形成。新生血管生成在疾病的发展过程中起了至关重要的作用。因此，抑制这一过程，将有效的治疗类风湿关节炎。

大戟属隶属于的大戟科，现暂分5个亚科，我国共有4个亚科，包括叶下珠亚科、大戟亚科、铁觅菜亚科和巴豆亚科。本科共约300属5000多种，起源于第三纪，在其生态分布上除北极及寒冷的高山带以外，遍布于全世界，主要产于热带和亚热带地区。它们分布在极不同的地方，既有极特殊的沙漠型的肉浆植物，也有湿生植物，还有不少是热带森林乔木，甚至许多是分布广泛的田间杂草。大戟科的分布中心是印度与马来西亚地区和巴西。中国约72属450余种，遍布中国各省区，主要产于西南至台湾。

金刚纂(Euphorbia antiquorum)为大戟科大戟属植物，归属于大戟亚属，别名百步回阳、紫木通、小青龙、圆金刚一《云南中草药》；火殃簕一《生草药性略要》；霸王鞭一《浙江药用植物志》；千年剑、金刚树一《南方主要有毒植物》等。多生长于村舍附近或园地附近，多作观赏或绿篱植物进行栽培。原产印度、斯里兰卡等地，今世界各地均有栽培。金刚纂的植物形态为多年生灌木。茎为肉质直立，内含白色粘稠的乳汁；老茎为圆柱状，小枝绿色肉质有3-5条厚而作波浪形的翅，翅的凹陷处多有一对锐刺。单叶互生，多生在枝端，有短柄，由翅边生出，为倒卵形，叶面深绿，背面颜色稍浅。金刚纂为我国传统的傣药，药用部位为茎部，主要药用方法有两种：去其刺，鲜用；切片，晒干，炮制后使用。根据中医古书记载，金刚纂(E.antiquorum)为我国传统傣药，其茎具有通便、消肿、杀虫之效。可治疗膨胀，急性肠胃炎、肿毒、济癫、大疮、皮肤病。其叶具有解毒行癖、消热化滞之功效。可治疗热带泄泻、跌打积癖无名肿毒、疹秽吐泻转筋、疗疮、霍乱。

金刚纂的相关研究很少，目前已有的金刚纂专利只有7篇，其中介绍植物的嫁接方法三篇。另4篇中其中一篇是介绍金刚纂可以治疗动物病毒感染，及制备动物抗病毒药物上的用途，另3篇是金刚纂抗肿瘤活性的专利，但主要是针对抑制肿瘤增殖方面进行的研究，对血管新生暂无报道。

本研究从金刚纂中分离出的一个三萜化合物(kansenonol)，并对抑制血管新生作用进行研究，结果证实本研究从金刚纂中分离出的化合物具有良好的血管新生抑制作用，并可抑制肿瘤的生长，改善类风湿关节炎。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种三萜类化合物在制备血管生成药物中的应用。

一种羊毛甾烷型三萜在制备新生血管抑制剂中的应用，其特征在于，所述的

三萜化合物具有如下结构：

所述的化合在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是通过HUVEC细胞Tranwell迁移实验和大鼠动脉环实验进行筛选，结果发现化合物具有非常优异的血管生成抑制作用。

优选地，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

有益效果：

本发明提供了金刚纂提取物中三萜类化合物的新用途，实验表明，三萜类化合物对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移、大鼠动脉环均有明显的抑制作用，说明其具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂使用。本发明首次发现金刚纂中三萜类化合物的抗血管生成作用，能够作为血管生成抑制剂应用于肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。

附图说明

图1是三萜对HUVEC迁移作用的抑制作用，其中A为HUVEC迁移图，B为迁移细胞数，C为迁移抑制率。

图2是三萜对大鼠动脉环的抑制作用

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1化合物提取、分离

1、提取和分离

将金刚纂2.0kg茎叶阴干粉碎，并用95％的乙醇浸泡3次，每次7天，提取液合并，减压浓缩得到浸膏(200g)，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部分(80g)。用MCI-gel(30％-100％)进行分离，其中第2部分用硅胶进行分离，洗脱剂为石油醚-丙酮(20:1-1:1)，选择第3部分，用反相液相色谱进行分离，用乙腈/水(64:36,3mL/min)进行洗脱，27分钟进行收集，得到该化合物。

2、化合物的结构鉴定

白色无定形粉末；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δin ppm,J in Hz):δ_H 3.29(1H,dd,J＝4.6,11.6,H-3),5.59(1H,m,H-28a),5.59(1H,m,H-28b),0.75(3H,s,H-18),1.08(3H,s,H-19),0.84(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),1.31(3H,s,H-26),1.31(3H,s,H-27),1.00(3H,s,H-28),0.97(3H,s,H-29),1.89(3H,s,H-30)；¹³C NMR(δin ppm,inCDCl₃at 125MHz):δ_C 34.7(C-1),27.5(C-2),78.2(C-3),39.0(C-4),48.2(C-5),35.9(C-6),198.4(C-7),139.0(C-8),165.4(C-9),39.4(C-10),23.8(C-11),30.0(C-12),44.8(C-13),47.8(C-14),31.5(C-15),28.6(C-16),48.3(C-17),16.0(C-18),18.7(C-19),35.9(C-20),19.2(C-21),38.4(C-22),125.6(C-23),139.6(C-24),70.9(C-25),30.0(C-26),30.1(C-27),27.4(C-28),15.2(C-29),24.6(C-30)。

实施例2化合物对内皮细胞迁移的抑制

一、实验材料、仪器与试剂

1实验材料

1.1药品：本实验室分离的化合物(kansenonol)

Avastin

1.2细胞株：

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由本课题组保存。

2主要试验试剂配制方法

2.1 DMEM配制方法：取10.4g DMEM干粉，2g NaHCO₃，50mg青霉素，100mg链霉素，ddH₂O 800mL，磁力搅拌器使其充分混匀，HCl调pH至7.4，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃保存备用。

2.2 PBS液配制方法：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加水定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存备用。

2.3胰蛋白酶配制方法：以PBS液溶解，4℃搅拌过夜，0.22μm微孔过滤器过滤除菌，4℃保存备用。使用浓度为0.25％。

二、实验方法

1供试品的制备

称取样品适量，用DMSO溶解成100mg/mL的原液，取一定量的原液用DMEM培养基配制为100μg/mL的母液，并用灭菌的0.22μm有机系滤头过滤除菌。用无血清的DMEM培养基倍比稀释5个梯度的供试品溶液。

将Avastin作为阳性对照，用无血清的DMEM培养基稀释成10μg/mL，用无血清的DMEM培养液依次稀释10倍。

2细胞培养

正常人血管内皮细胞均用10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO₂培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

3细胞悬液的制备

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化液消化，进行细胞计数，用10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成每mL中含2×10⁴个细胞浓度的细胞悬液。

4细胞给药

在24孔板每个孔加入600μL含血清的DMEM培养基，并向transwell小室中分别加入不同浓度的供试品溶液，100μL/孔，每个剂量做2个复孔；阳性对照组Avastin同样给药；阴性对照组加无血清DMEM培养液100μL/孔。最后在transwell小室中加入100μL细胞悬液，将24孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

5细胞染色及测定

24孔板培养24h后弃去孔板中含血清的DMEM培养基与transwell小室中的无血清DMEM培养基，并用灭菌后的PBS清洗，加入600μL无水乙醇固定细胞30min，将transwell小室倒扣晾干后，在小室的外侧膜上滴加结晶紫染液，染液的量能完全覆盖小室外侧膜即可，常温染色15min。将小室外侧膜在清水中漂洗，用棉签轻轻擦掉小室膜上层未迁移细胞。将小室倒扣晾干，每个小室选择4个视野拍照，统计分析迁移细胞数目。

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化液消化，进行细胞计数，用10％胎牛血清的1640培养基稀释成每mL中含3×10⁴个细胞浓度的细胞悬液。

三、实验结果

请参照附图1，附图1是三萜(kansenonol)对HUVEC迁移作用的抑制作用，结果表明在25、50μg/ml时，其可明显的抑制HUVEC迁移，并在50μg/ml抑制率可以达到49％。

实施例3化合物对大鼠动脉环形成的抑制作用

一、实验材料、仪器与试剂

1实验材料

1.1药品：本实验室分离的化合物(kansenonol)

1.2动物：

SD大鼠，SPF级，雌性，体重(250)g

2主要试验试剂配制方法

2.1 DMEM配制方法：取10.4g DMEM干粉，2g NaHCO₃，50mg青霉素，100mg链霉素，ddH₂O 800mL，磁力搅拌器使其充分混匀，HCl调pH至7.4，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃保存备用。

2.2 PBS液配制方法：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加水定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存备用。

2.3基质胶溶液：Matrigel用无血清ECM培养基1:1稀释使用。

二、实验方法

处死大鼠，取动脉，放入含高抗PBS液中清洗，用眼科手术剪及镊子去除脉管外纤维和脂肪组织；切取1～2mm长的动脉环，用含高抗的PBS液清洗数遍；按小管形成的方法，配制培养混合胶和试验药液，在预冷的96孔细胞培养板中，每孔加入预先融化的Matrigel 60μl(提前12h将Matrigel放入4℃冰箱中融化，使用前用培养基稀释2倍)，将胸主动脉环放入胶中包埋；37℃聚合1h，使胶凝固；用含5％FBS的ECM培养液配制指定浓度的药液，每孔加入药液100μl，每个浓度至少3个复孔，96孔板放培养箱内常规培养；隔天更换新鲜培养基并加药；自第6日起每日取出，倒置显微镜下观察动脉环附近内皮细胞和新生血管的生成情况，随机选择5个面积拍照并倒置显微镜下计数微血管样结构，并绘制生长曲线。

三、实验结果

请参照附图2，附图2是三萜(kansenonol)对大鼠动脉环的抑制作用。如图2所示，化合物在50μg/ml时，可明显抑制大鼠动脉新生血管的形成。

实施例4化合物对黑色素瘤C57BL/6黑鼠的体内抗肿瘤活性

1实验方案

1.1肿瘤细胞培养

取B₁₆F₁₀细胞复苏，接种于细胞培养瓶中，补足5mL含10％FBS的DMEM培养基，放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每两天传代一次。实验中应选择生长状态良好，处于对数生长期，传代五代以内的细胞用于实验。

1.2动物模型建立

将培养的细胞用PBS洗涤，0.25％胰蛋白酶进行消化，收集消化液。用10mL离心管1000rpm/min离心5min收集细胞，弃上清，将细胞重悬于PBS，进行细胞计数并调整细胞浓度为5×10⁶个/mL。在小鼠右体侧皮下接种细胞悬液0.1mL，每只小鼠注射细胞总数为5×10⁵个。当肿瘤的平均体积达到60～80mm³时，按给药种类随机将小鼠分组，阴性组12只，其余组每组9只。

1.3给药方案

化合物对鼠源B₁₆F₁₀黑色素瘤C₅₇BL/₆黑鼠移植瘤的体内抗肿瘤作用具体给药方案如表1，皮下给药，给药两周：

表1给药方案

1.4疗效评价

使用测量瘤径的方法，动态观察动物移植瘤肿瘤的生长状况。C₅₇BL/₆鼠皮下注射给药，给药14天。肿瘤直径的测量次数为每隔一天测一次。为第1d，3d，5d，7d，9d，11d，13d测量。给药体积为0.2mL/只/次。阴性对照组皮下注射等量生理盐水。给药14d后，脱颈处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：

TV＝0.52×a×b²

其中a、b分别表示长和宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0，其中V0为分笼时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，公式如下：

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

根据肿瘤重量称量的结果计算肿瘤抑制率(antitumor inhibition ratio)为：

肿瘤抑制率＝(m-mt)/m×100％

m为阴性组平均瘤重，mt为治疗组平均瘤重。

统计学处理：应用SPSS 17.0软件对数据进行分析，以(mean±SD)表示结果，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。

2实验结果

表2对黑色素瘤生长的抑制作用

结果：见表2，紫杉醇对小鼠移植瘤抑瘤率为57.47％，对实验动物的体重具有显著性的影响；化合物高中低三组对小鼠移植瘤的抑瘤率分别为44.79％，38.91％，38.51％。化合物对小鼠黑色素瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，3组加药组对B₁₆F₁₀的生长有显著的抑制作用，各实验小鼠体重均略有降低。

Claims (2)

1.一种羊毛甾烷型三萜在制备新生血管抑制剂中的应用，其特征在于，所述的三萜化合物具有如下结构：

。

2.根据权利要求1所述的化合物在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

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