发明内容
本发明的一个目的在于公开一种具有抑制肿瘤作用的药物组合物,本发明的另一个目的在于公开上述药物组合物的制备方法及其用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
本发明药物组合物的原料药组成为:
高良姜 5-30重量份 香附 2-10重量份 穿山龙 5-30重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 10-15重量份 香附 3-9重量份 穿山龙 10-15重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 12重量份 香附 6重量份 穿山龙 12重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 13重量份 香附 7重量份 穿山龙 14重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 6重量份 香附 8重量份 穿山龙 6重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 29重量份 香附 4重量份 穿山龙 29重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 29重量份 香附 4重量份 穿山龙 6重量份。
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
高良姜 6重量份 香附 4重量份 穿山龙 29重量份。
本发明药物组合物的制备方法为:
高良姜、香附以蒸汽蒸馏提取挥发油备用,药液过滤;穿山龙用60-90%乙醇回流两次,回收乙醇,与过滤后的高良姜、香附药液合并,干燥,加入辅料制粒、整粒,加入高良姜、香附提取的挥发油,按照制剂学常规方法制成各种剂型:颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、丸剂、口服液。
本发明药物组合物的制备方法优选为:
高良姜、香附以蒸汽蒸馏提取挥发油备用,药液过滤;穿山龙用75%乙醇回流两次,回收乙醇,与过滤后的高良姜、香附药液合并,干燥,加入辅料制粒、整粒,加入高良姜、香附提取的挥发油,按照制剂学常规方法制成常规剂型:颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、丸剂、口服液。
中医药在中晚期肿瘤综合治疗占有重要角色,已形成我国肿瘤治疗的特色医疗之一。其特征是依据患者体质、临床表现、肿瘤生长部位以及肿瘤分期提供个体化辨证施治方案。本发明药物组合物是依据恶性肿瘤“寒凝血瘀”病机特征拟定的方剂,急性毒性实验显示无明显毒性。本发明药物组合物源自良附丸,良附丸方出自清·谢元庆的《良方集腋》,是治疗症见胃脘疼痛,胸闷胁痛的寒凝气滞型胃脘痛的常用中成药,其中高良姜,味辛大热,温中暖胃,香附,疏肝开郁,行气止痛,两药相配,一散寒凝,一行气滞,共奏行气疏肝,散寒止痛之功,适用慢性胃炎、胃及十二指溃疡等属气滞寒凝者。本发明药物组合物主要用于胃癌食管癌中属寒凝气滞者的治疗。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 本发明药物组合物药物血清体外抑制肿瘤细胞活性实验
1.实验材料
1.1药物
待试药品本发明药物组合物(褐色粉末浸膏)是根据实施例1所述的制备方法制备而成,由北京博诺瑞特科技发展有限公司与西安星华药物研究所制备并提供;环磷酰胺(CTX)系江苏恒瑞医药股份有限公司生产(批号06052021)。
1.2细胞系
人正常肝细胞系(LO2)、人肝癌细胞系(BEL7402)、人胃癌细胞系(BGC-823)、人食管癌细胞系(ECA-109)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)。
1.3动物
Waster大鼠、雄性,180-200g;购自军事医学科学院实验动物中心(合格证号SCXK-(军)2002-001),实验前于北京国家药物安全评价中心GPS实验室适应一周,饲养条件为:22±30℃,光暗周期12h/12h,自由摄食、饮水。
1.4试剂
RPMI1640培养基(GIBCO)、胎牛血清(华美公司)、胰蛋白酶(华美公司)、环磷酰胺(MTT(Sigma))等购自北京欣经科生物技术有限公司。
2.试验方法
2.1制备含药血清
Wister雄性大鼠25只,180-200g,按体重随机分为5组,每组5只,即对照组、本发明药物组合物高、中、低剂量组和CTX组;实验前禁食12小时,本发明药物组合物高、中、低剂量组分别用按10g.d-1.kg-1、5g.d-1.kg-1、2.5g.d-1.kg-1剂量口服灌胃(给药中剂量=临床常用量×动物等效面积×培养基内血清稀释度,以此为中剂量,高剂量乘以2,低剂量除以2),CTX组按100mg.d-1.kg-1剂量口服灌胃(临床常用量×动物等效面积×培养基内血清稀释度),对照组给予相同体积的生理盐水,每日一次,连灌一周;于末次灌胃后一小时在无菌条件下自腹主动脉采血,4℃下静置过夜,3500r/min离心30min,分离血清,0.22μm微孔滤膜无菌过滤,置于-20℃冰箱保存备用,临用前56℃灭活30分钟。
2.2细胞传代与MTT实验
细胞株常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,37℃,5%CO2,在饱和湿度的培养箱中传代培养;取对数生长期以上的贴壁细胞先消化后用新鲜培养液(RPMI1640培养液)配制成1×104个/mL,96孔板各孔加100μL,置37℃,5%CO2培养箱内培养;24h后换成无血清的培养基加受试血清,受试血清加入各孔内,每孔10μL,同一浓度设3孔,对照孔加10μl正常血清,调零孔为100μl培养液;继续培养72h后,每孔加5mg/mL的MTT溶液100μL,置培养箱内4h后,每孔加100μL溶解液,在培养箱内过夜,用全自动酶标仪测570nm处OD值即A值;
2.3计算与统计学处理
细胞生长抑制率计算公式:生长抑制率=((对照组A值-含药血清组A值)/对照组A值)×100%;统计学处理使用SPSS10.0统计软件;统计数据以
表示,并经t检验当P<0.05时被认为有统计意义。
3.实验结果
用全自动酶标仪测定药物血清作用72小时后肿瘤细胞的OD值,依据公式计算肿瘤细胞生长抑制率,实验各组A值以及肿瘤细胞生长抑制率结果见表1和表2:
表1实验各组A值比较(n=3)
分组 |
人正常肝细胞系 |
人肝癌细胞系 |
人胃癌细胞系 |
人食管癌细胞系 |
人乳腺癌细胞系 |
对照实验组环磷酰胺组待试药品高剂量待试药品中剂量待试药品低剂量 |
0.82±0.150.57±0.11*0.77±0.080.93±0.070.93±0.05 |
1.09±0.160.79±0.15*0.86±0.060.81±0.08*1.15±0.19 |
0.75±0.130.39±0.14**0.44±0.06**0.52±0.08*0.61±0.10 |
0.86±0.050.42±0.02**0.44±0.10**0.63±0.13*0.78±0.04 |
1.30±0.080.81±0.16*0.99±0.161.07±0.091.19±0.33 |
实验各组与对照组相比,*P<0.05;**P<0.01
对表1分析显示:本发明药物组合物各剂量组对人正常肝细胞(LO2细胞)无明显影响;高、中剂量组对胃癌细胞系(BGC-823)、食管癌细胞系(ECA-109)有明显影响;中剂量对肝癌细胞系(BEL7402)有一定影响,但作用较弱;表明本发明药物组合物对消化道肿瘤细胞具有特异性抑制效应,并与剂量呈正相关性。
表2肿瘤细胞生长抑制率比较(%,n=3)
分组 |
人正常肝细胞系 |
人肝癌细胞系 |
人胃癌细胞系 |
人食管癌细胞系 |
人乳腺癌细胞系 |
环磷酰胺组待试药品高剂量待试药品中剂量待试药品低剂量 |
29.61±12.485.75±8.92-13.91±12.52-16.09±27.54 |
27.94±4.3920.61±8.3121.44±14.92-4.86±11.18* |
44.63±30.0340.35±6.4530.29±4.8917.29±14.42* |
51.21±4.9647.69±14.7226.31±14.96*0.09±7.65** |
36.81±15.7123.54±11.1517.47±11.900.08±26.14 |
实验各剂量组与CTX组比较,*P<0.05;**P<0.01
表2是通过测定A值计算的肿瘤细胞抑制率,可以看出本发明药物组合物各剂量组对正常肝脏细胞无明显影响,对各种类型的肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用,其中,对胃癌细胞、食管癌细胞抑制效果明显,与CTX比较,无统计学意义(P>0.05),并显示呈剂量依赖型关系。
实验例2本发明药物组合物诱导人胃癌细胞凋亡实验
1.实验材料
1.1细胞系与动物
人胃腺癌细胞(BGC-823);Waster大鼠,雄性,180-200g购自军事医学科学院实验动物中心(合格证号SCXK-(军)2002-001),实验前于国家药物安全评价中心GPS实验室适应一周,饲养条件为:22±3℃,光暗周期12h/12h,自由摄食、饮水。
1.2药物与试剂
待试药品本发明药物组合物(褐色粉末浸膏)是根据实施例1所述的制备方法制备而成,由北京博诺瑞特科技发展有限公司与西安星华药物研究所制备并提供;环磷酰胺(CTX)由江苏恒瑞医药股份有限公司生产(批号06052021);MTT、RPMI1640培养基系Sigma公司产品,购自北京欣经科生物技术有限公司;Annexing-V-FITC凋亡检测试剂盒系宝赛生物技术公司产品;小牛血清为天津百叶生物制品公司产品。
1.3常用仪器
倒置显微镜(OLYMPUS IX70);全自动酶标仪(Bio-Rad 450);CO2培养箱(Heraeus BB5060);流式细胞仪(BD Facscalibur);透射电镜(PhilipsEM400T)。
2.实验方法
2.1制备复方血清
取Wister雄性大鼠25只,按体重随机分为5组,每组5只,制备药物血清前禁食12小时;依据实验设计制备空白对照、CTX、本发明药物组合物高、中、低剂量组血清,按照本发明药物组合物临床用量,其高、中、低剂量分别用为10g.d-1.kg-1、5g.d-1.kg-1、2.5g.d-1.kg-1(中剂量=临床用量×动物等效面积×培养基内血清稀释度,以此基准,高剂量乘以2,低剂量除以2);CTX组按100mg.d-1.kg-1剂量灌胃(临床用量×动物等效面积×培养基内血清稀释度);对照组给予相同体积的生理盐水,每日灌胃1次,连灌1周。于末次灌胃后1小时内,在无菌条件下自腹主动脉采血,4℃下静置过夜,以3500r/min离心30min,分离血清,0.22μm微孔滤膜无菌过滤,置-20℃冰箱保存备用,临用前56℃灭活30分钟。
2.2细胞传代与MTT实验
BGC-823细胞放入含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下传代培养;取对数生长期以上的贴壁肿瘤细胞用0.25%的胰蛋白酶消化,以1×104/ml接种于96孔板,100μl/孔;细胞于5%CO2,37℃,CO2培养箱培养24h后,换成无血清培养基,并在每个培养孔中加入10μl药物血清,对照组加不含药血清,每个剂量设3个平行孔,调零孔为100μl培养液,继续培养72h,吸弃培养基,每孔中加入含MTT 0.5mg/ml的PBS(PH=6.8)100μl,培养4h后,快速翻板法去除培养基,每孔加入二甲基亚砜100μl,微量振荡仪振荡5min;于次日用全自动酶标仪测570nm处OD值即A值,依据结果计算细胞生长抑制率。
2.3电镜观察细胞形态
将人胃癌细胞(BGC-823细胞)以1×106接种于75cm2150ml培养瓶中,培养24h后,更换含不同浓度本发明药物组合物的同一培养基,继续培养48h;用PBS洗2次细胞,刮取法收集细胞,PBS洗2次后离心成细胞丸,立即于含2.5%戊二醛的0.1M二甲基砷酸钠中固定1h;用0.1MPBS(pH=7.2)洗3次,再于含0.1%四氧锇酸的PBS(pH=7.2)中固定1h;系列梯度乙醇脱水后,用812环氧树脂∶乙醇=1∶1渗透1h,于纯环氧树脂中渗透过夜;将细胞用新鲜环氧树脂包进模孔,60℃成熟48h,用LKB超薄切片机切成70nm超薄切片;切片放入丙酮清洗后200目铜网,用铀酸乙脂和枸橼酸铅染色后透射电镜观察。
2.4流式细胞检测细胞凋亡
将取对数期细胞以1×106接种于25cm250ml培养瓶中,在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养24h;更换含10%不同浓度含药血清(2.5g/kg,5g/kg,10g/kg)及不含药血清培养基继续培养48h;消化收集细胞于离心管中,PBS洗2次后离心成丸,将细胞丸于200μL结合缓冲液(10mMHEPES/NaOH,pH7.4,140mM NaCl,5mM CaCl2)中均匀悬浮,接着加10μlPI和10μl Annexin V-FITC,室温避光孵育30min,再加300μL结合缓冲液,立即用流式细胞仪检测;每样至少检测20000细胞,CELLQuestk软件分析结果。
2.5计算与统计
细胞生长抑制率计算公式:生长抑制率=(对照组A值-用药组a值)/对照组a值)×100%。统计学处理使用SPSS10.0统计软件;统计数据以
表示,并经t检验,当P<0.05时被认为有统计意义。
3.实验结果
3.1细胞生长状态与形态学观察
在倒置显微镜下,对照组细胞呈上皮型贴壁生长,细胞呈延展、扁平,细胞间结构紧密,细胞生长旺盛;实验组细胞轮廓增强、反差增大,有部分变圆浮起,细胞间接触变松,增殖减慢,且与药物剂量相关;倒置显微镜下观察的人胃癌细胞(BGC-823细胞)见附图1-4;在透射电镜下,对照组大多数细胞细胞核清晰完整,有丰富正常的线粒体及内质网;实验各组均出现较多的凋亡细胞,具有不同时期细胞凋亡特征,主要表现为凋亡细胞体积变小,核内出现许多空泡结构,细胞质浓缩,聚集,附着在核膜上,见附图5-10。
3.2细胞生长抑制率与调亡率统计
经含本发明药物组合物药物血清干预后的人胃癌细胞(BGC-823细胞)均有不同程度的抑制效应,流式细胞仪检测发现也有不同程度的细胞凋亡现象;细胞生长抑制率与凋亡率见表3与附图11-14;对A值影响:与对照组(A值0.75±0.13)相比,本发明药物组合物对人胃癌细胞(BGC-823细胞)作用明显与剂量相关(高剂量组A值0.44±0.06、中剂量组A值0.52±0.08、低剂量组A值0.61±0.10(P<0.05,P<0.001));与阳性药CTX组抑制率(44.63±30.03)相比,高、中剂量组(高剂量组40.35±6.45、中剂量组30.29±4.89(P>0.05)无明显差别;对细胞系的生长抑制率的影响:高、中剂量组生长抑制率(40.35±6.45和30.29±4.89)与CTX组(44.63±30.03)无明显差别(P>0.05);流式细胞检测结果表明本发明药物组合物有诱导人胃癌细胞(BGC-823细胞)凋亡作用,随剂量的增加,细胞凋亡增加,与对照组相比差异显著(对照组)凋亡率14.45±3.33、高剂量组凋亡率35.92±0.87、中剂量组凋亡率29.51±1.02,(P<0.05))。
表3细胞生长抑制率与凋亡率检测结果
实验各组与对照组比较,*P<0.05,**P<0.001;△与环磷酰胺组比较,P<0.05
实验例3 本发明药物组合物抗移植性人胰腺癌效应研究
1 材料
1.1动物与细胞系
BALB/c nu/nu裸小鼠20只,4~6周龄,体重18±2克,雌雄兼有,由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供,生产许可证号为SCXK(京)2005-0004,并在国家药品安全评价中心统一饲养;人胰腺癌细胞株(FWK-1)由中国医学科学院肿瘤医院提供。
1.2药物
待试药品本发明药物组合物颗粒剂浸膏是根据实施例1所述的制备方法制备而成,由西安新华药物研究所与北京博诺瑞特科技发展有限公司制备并提供,干燥保存,使用时以双蒸水稀释至实验所需浓度。
2方法
2.1细胞复苏
液氮罐中取出含FWK-1细胞的冻存管,放入37℃水浴内,使其溶化,吸收细胞悬液,加入离心管并滴加培养液至10ml,离心1000r/min,5min,去上清液,加入PBS液后细胞计数,调整细胞悬液浓度至107个细胞/mL,每只裸鼠以0.2mL接种右腋窝皮下,15~20天肿瘤生长至1g以上后移植。
2.2造模及给药
断颈处死传代荷瘤小鼠,立即置于75%乙醇中浸泡3分钟后再取出,大头针固定四肢,碘酒消毒整个胸腹和瘤块皮肤,酒精脱碘,剪开皮肤,暴露瘤块,用眼科剪剪开瘤块,清除外周血块及结缔组织,75%酒精中浸泡,切成1mm左右小块,采用插块法种植于小鼠右侧腋窝皮下。整个过程均需无菌操作,从处死小鼠至接种完毕在45分钟内完成。接种后第二天按体重随机分为对照组与治疗组,每组10只。对照组给予0.2ml/d生理盐水灌胃;治疗组给予本发明药物组合物颗粒0.1ml/10g(相当于成人剂量的20倍)灌胃,连用21天。
2.3观测指标
在实验过程中观察小鼠一般情况,每周用精密卡尺测量肿瘤最大长径和短径,求出肿瘤体积(V)。肿瘤体积计算公式为:V=1/2(长径×短径2)。停药3天后脱颈处死小鼠,取瘤称重,并计算肿瘤抑制率(IR)。肿瘤抑制率计算公式为:IR=[1-(治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。
2.4统计学处理
应用SAS8.2统计软件处理,所有数据均以表示,组间比较采用t检验,当P<0.05时表示有统计学意义。
3 结果
3.1一般情况观察
两组小鼠成瘤率100%,实验第三周对照组与治疗组各死一只,尸体解剖未见异常。动态观察两组模型小鼠体重较造模前均有所增加,觅食、活动均无异常。
3.2肿瘤体积
两组移植性肿瘤体积见表4:
分组 |
第一周(n=10) |
第二周(n=10) |
第三周(n=9) |
治疗组对照组 |
56.37±21.7662.87±29.82 |
193.61±48.43*217.904±55.46 |
213.17±76.53△297.66±93.67 |
与对照组比较,*P<0.05,△P<0.01
从表4可以看出,与对照组比较,本发明药物组合物颗粒干预治疗第二周、第三周可见肿瘤体积缩小,具有统计学意义(P<0.05,0.01),说明本发明药物组合物颗粒对人胰腺癌具有明显的生长抑制效应。
3.3瘤重与抑瘤率
治疗结束,瘤重与抑瘤率见表5:
表5两组瘤重与抑瘤率比较
分组 |
n |
平均瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
治疗组对照组 |
99 |
0.79±0.40*1.34±0.58 |
41.04- |
与对照组比较,*P<0.01
从表5可以看出,治疗组平均瘤重明显降低,与对照组比较,有统计学意义(P<0.01),其结果与测得的肿瘤体积一致。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。