CN102258733A

CN102258733A - 一种从高良姜提取的抗癌挥发油的制备方法及应用

Info

Publication number: CN102258733A
Application number: CN2011101888755A
Authority: CN
Inventors: 罗辉; 张海涛; 李宁
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2011-07-04
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2011-11-30

Abstract

一种从高良姜提取抗癌挥发油的制备方法及应用，取高良姜根洗净后，于切片机中切片，取高良姜切片置于烧瓶中，加蒸馏水和沸石，混匀，浸泡后加热至沸腾，保持微沸停止加热，静置，读取挥发油体积后收集，提取，用适量无水硫酸钠干燥后，呈淡黄色透明的油状液体，置于棕色瓶中保存。本发明高良姜挥发油显著抑制肿瘤细胞的生长；拓展高良姜的适用范围，增加高良姜附加值；制备工艺简单，成本低，简单易行，实用性强。从天然活性物质中寻找新的抗肿瘤药物是筛选新型抗肿瘤药物或药物前体的有效途径，有广阔的市场。

Description

一种从高良姜提取的抗癌挥发油的制备方法及应用

技术领域

本发明属于一种从高良姜提取抗癌挥发油的制备方法及应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，抗肿瘤药物的研究与开发在当今的医学领域中具有重大意义。其中肺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈上升趋势。在我国数个大中城市中，肺癌的发病率、死亡率均已占男性恶性肿瘤的首位，女性恶性肿瘤的第二位。尽管手术、联合化疗及放疗在肺癌的治疗中起到了积极的作用，但因缺乏有效的早期诊断方法，70-80％的患者在确诊时已失去早期根治性切除的时机。手术及放化疗复发率高、易出现耐药，故患者的5年生存率长期停留在20-30％左右。然而中国传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论。中医药治疗肺癌的有关资料表明：中医药不仅可以延长肺癌患者的生存期，而且能提高他们的生存质量。中药配合放疗、化疗比单纯使用放疗、化疗的疗效更好。中药既可增加化疗药及放射线的敏感性、又有放射防护作用，可减轻化疗放疗的副作用，起到抑瘤增效作用或放射增敏作用。天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低，受到国内外广泛的关注。因而从天然植物中提取抗肿瘤药物既是当前国内中医药现代化的重要组成部分，也是国外基础临床医学研究的一个热点。纵观自然界中植物种类多种多样，可用于肿瘤治疗的植物药也是数量繁多，如果能将其中起主要作用的有效成分分离出来，研究其理化性质及作用机理，对于抗肿瘤新药的研制开发将具有非常重要的意义。为此我们因地取材，目标转向湛江特产药材——南药高良姜。

高良姜，别名小良姜，又名徐闻良姜，药学名Alpinia officinarum Hance，为姜科植物，是一种热带多年生长的山姜属食药兼用的植物资源。高良姜在我国古代的诸多药典如《本草纲目》及《中国药典》均有记载。其根茎含多种二苯基庚烷类化合物和黄酮类化合物如高良姜素、槲皮素等。并含有0.5％～1.5％挥发油，具有抗菌、杀虫、疏风解热、祛湿解毒作用，同时对多种药物具有良好的透皮渗透作用。本发明以培养细胞和裸鼠体内移植瘤为实验模型，MTT试验、体内药效评价等方法，在细胞水平和动物水平检测了高良姜挥发油体外体内抗肺癌作用，结果表明其能够显著抑制肺癌细胞生长或增殖，体内抑瘤率达到30％-50％的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种从高良姜提取抗癌挥发油及其制备方法，解决肿瘤发病率日益增加，从天然活性物质中寻找新的抗肿瘤药物是筛选新型抗肿瘤药物或药物前体的有效途径。

本发明的技术解决方案如下：

(一)高良姜挥发油提取工艺步骤如下：

(1)样品自采于湛江徐闻高良姜栽培基地，取其根洗净切块后，于切片机中切片，切片厚度约为1-2毫米。

(2)称取高良姜切片100-200克，置于1000-2000毫升圆底烧瓶中，加6-7倍蒸馏水和沸石一到两粒，混匀，浸泡1-2小时后加热至沸腾，保持微沸5-6小时停止加热，静置1-2小时，读取挥发油体积后收集，用适量无水硫酸钠干燥后，呈淡黄色透明的油状液体，置于棕色瓶中-20°保存，提取率约0.8％-1.2％。

(二)高良姜挥发油成分检测与鉴定

用气质-质谱联用仪对高良姜挥发油进行测定，经计算机谱库检索及核对质谱标准谱图，分别鉴定出其主要成分为1，8-桉叶素、β-蒎烯、α-松油醇、莰烯、桂皮酸甲酯、樟脑、石竹烯、异丁酸异丁酯，松油烯、4-异丙基-1-甲基-1，4-环己二烯、2-甲基丁酸-2-二甲基丙酯、丁香油酚等。

本发明可以用于涉及利用该成分制备抗癌药物或药物组分。

本发明高良姜挥发油显著抑制肿瘤细胞的生长；拓展高良姜的适用范围，增加高良姜附加值；制备工艺简单，成本低，简单易行，实用性强。从天然活性物质中寻找新的抗肿瘤药物是筛选新型抗肿瘤药物或药物前体的有效途径，有广阔的市场。

附图说明

图1是本发明不同浓度高良姜挥发油对肺癌细胞增殖能力影响图。

具体实施方式

(一)高良姜挥发油提取工艺步骤如下：

(1)样品自采于湛江徐闻高良姜栽培基地，取其根洗净切块后，于切片机中切片，切片厚度约为1毫米。

(2)称取高良姜切片100克，置于1000毫升圆底烧瓶中，加600毫升蒸馏水和沸石两粒，混匀，浸泡1小时后加热至沸腾，保持微沸5小时停止加热，静置1小时，读取挥发油体积后收集，用适量无水硫酸钠干燥后，呈淡黄色透明的油状液体，置于棕色瓶中-20°保存，提取率约1.2％。

(二)高良姜挥发油成分检测与鉴定

用气质-质谱联用仪对高良姜根挥发油进行测定，经计算机谱库检索及核对质谱标准谱图，分别鉴定出其主要成分为1，8-桉叶素、β-蒎烯、α-松油醇、莰烯、桂皮酸甲酯、樟脑、石竹烯、异丁酸异丁酯，松油烯、4-异丙基-1-甲基-1，4-环己二烯、2-甲基丁酸-2-二甲基丙酯、丁香油酚等。

本发明可以用于涉及利用该成分制备抗癌药物或药物组分。

仪器及实验条件：

(1)仪器：岛津Q P-5000型气-质联用仪，色谱系统GC-17A，N IST谱库(美)。

(2)色谱条件：色谱柱为J&W公司DB-1交联石英毛细管柱

(30m×0.25mm)，程序升温：80℃(5min)-10℃/min-→250℃(10min)，进样器温度250℃，载气He，柱前压92kPa，总流量64.20ml/min，分流比40∶1。

(3)质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围30～600amu。

抗肿瘤实验和实验结果简介

1.MTT法检测体外高良姜挥发油对肿瘤细胞的增殖抑制作用

人肺癌细胞株A549细胞、NCI-H23细胞、NCI-H1975细胞用完全RPMI1640培养基培养(含10％胎牛血清、100u/ml青霉素及100mg/ml链霉素)，于37℃、5％CO₂培养箱中传代培养。分别取对数生长期的三种人肺癌细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，RPMI 1640完全培养液稀释为4.0×10⁴/ml细胞悬液，接种4.0×10³于96孔板中37℃、5％CO₂培养24h后，更换新鲜培养液及加入不同终浓度的高良姜挥发油乳剂(100、200、300、400、500、600、700μg/ml)处理，同时设空白对照组和溶媒Tween-20对照组，每组设5个平行孔。继续培养24h后，加入5％MTT溶液(5mg·ml^-1)20μl，继续孵育4h，然后加入DMSO 150μl/孔，避光振荡15min，用酶标仪570nm处测各孔的OD值。实验重复三次。根据公式计算细胞增殖率，采用SPSS15.0软件统计分析实验数据，结果见图1。从图1中看出随着高良姜挥发油浓度的增高，三种人肺癌细胞增殖能力明显下降，其中A549细胞株对药物敏感性最为明显。结果表明高良姜挥发油均能不同程度地抑制A549、NCI-H23、NCI-H1975三种人肺癌细胞增殖，且呈剂量效应关系，其半数抑制浓度IC50分别为230、430、450μg/ml。

2.高良姜挥发油对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用

BALB/C/nu品系裸鼠，雌雄各半，4～6周龄，在SPF级屏障系统中饲养并进行实验。采用培养细胞异体移植法建立动物肿瘤模型，本发明采用A549细胞来建立动物肿瘤模型，进行体内药效观察。大量培养传代人肺癌A549细胞并收集细胞后，稀释细胞悬液为1×10⁷/ml，接种0.2ml于裸小鼠右腋皮下。接种后第二天高良姜挥发油乳剂预防组开始给药，给药剂量为200mg/kg。接种后第8天，裸鼠接种部位有明显的瘤组织块，视为建模成功，其成瘤率基本达到100％。待肿瘤生长到约100mm³时，随机分为五组，生理盐水对照组、溶媒Tween-20对照组、高良姜挥发油乳剂处理组(中剂量组、高剂量组)、顺铂治疗组，每组5只，各组均腹腔注射用药观察5周，除了顺铂治疗组隔日给药，其它组均每天给药。给药期间所有裸鼠正常饮食、饮水，观察其生活质量及测量记录体重和肿瘤生长体积变化情况。末次给药24h后以颈椎脱臼法处死动物结束实验，分别称裸鼠体重、瘤重，测量瘤体大小，并计算其抑瘤率。采用SPSS15.0软件统计分析实验数据进行疗效评价，结果见表1。实验结果表明高良姜挥发油乳剂能明显抑制肿瘤的生长，缩小动物瘤块，明显提高抑瘤率。高剂量组400mg/kg，折算生药剂量约为34g/kg，就能达到52.8％抑制率。在中剂量200mg/kg时，预防组抑瘤率为46.1％，说明在肿瘤还没形成时，有一定的预防作用。而生理盐水组与溶媒对照组比较，没有统计学意义，说明溶媒Tween-20对肿瘤生长没有明显影响。阳性对照组顺铂在剂量2mg/kg时，抑瘤率为55.8％，与高良姜挥发油乳剂预防组和高剂量组比较，均无显著差异(P＜0.05)。观察用药后体重变化情况，顺铂用药组裸鼠均瘦小，体重明显下降，说明有一定的毒副作用，而高良姜用药组与对照组相比，没有明显的差别，可见其毒副作用较低。总的来说，高良姜挥发油在200mg/kg、400mg/kg剂量时，对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤均有一定的抑制作用，且呈剂量效应关系。

表1.高良姜挥发油对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用(n＝5)

与生理盐水对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001.与溶媒对照组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001。

Claims

1.一种从高良姜提取抗癌挥发油的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)取高良姜根洗净后，于切片机中切片，切片厚度约为1毫米；

2.根据权利要求1所述的一种从高良姜提取抗癌挥发油的制备方法，其特征是用气质-质谱联用仪对高良姜挥发油进行测定，经计算机谱库检索及核对质谱标准谱图，分别鉴定出其主要成分为1，8-桉叶素、β-蒎烯、α-松油醇、莰烯、桂皮酸甲酯、樟脑、石竹烯、异丁酸异丁酯，松油烯、4-异丙基-1-甲基-1，4-环己二烯、2-甲基丁酸-2-二甲基丙酯、丁香油酚。

3.一种从高良姜提取抗癌挥发油的应用，其特征是用于涉及利用该成分制备抗癌药物或药物组分。