CN101007050A

CN101007050A - 含异补骨脂素的中药提取物及制备方法和用途

Info

Publication number: CN101007050A
Application number: CN 200710066685
Authority: CN
Inventors: 程翼宇; 周晨光; 许冬梅; 黄欣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2027-01-11
Also published as: CN101007050B

Abstract

本发明提供含异补骨脂素的中药提取物，含有10％～24％异补骨脂素、8％～19％补骨脂素、4％～12％新补骨脂异黄酮和2％～9％补骨脂宁。通过将补骨脂药材浸于纯水中，加热回流，除去挥发油成分，药渣继续加入乙醇，加热提取，将提取液浓缩成浸膏，用ODS－C18柱进行分离，用梯度甲醇作为流动相，由低到高依次洗脱，将洗脱液浓缩干燥后得到本发明的提取物。本发明所含化合物结构明确，且含量高。药理实验表明，在体外具有显著抑制敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞作用，具有明显的抗肿瘤。本发明设计合理，制备简便，可在制备具有抑制敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞作用的药物中的应用。

Description

含异补骨脂素的中药提取物及制备方法和用途

技术领域

本发明属中药提取物，涉及从补骨脂药材中提取的含有异补骨脂素、补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂宁等化合物的有效中药提取物，以及该提取物在制备具有抑制敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞作用的药物中的应用。

背景技术

癌症严重地威胁着人们的健康，其中肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病是几种发病率较高的癌症。肺癌已成为我国第一大癌症，且发病率及死亡率增长最为迅速。肝癌发病率则仅次于肺癌，某些地区肝癌发病率呈逐年增高的趋势，全世界每年死于肝癌的患者约26万人，我国近10万人。统计资料显示，几乎所有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1％，估计全球每年发病患者超过100万人。尽管对乳腺癌的治疗已经取得了很大的进步，但仍然有25％的患者死于该病。而白血病则是20岁以下青年死亡的主要病因之一。白血病的化学治疗一直是医学和药学研究的重点领域，早期开发的白血病化疗药物特异性不强，既能有效的杀灭肿瘤细胞，又对正常人体细胞有杀伤作用，毒副反应较大，病人很难坚持长期用药。

从植物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。中药通过多途径、多靶点、整合调节机制发挥药效作用，具有系统性的特点。但是，传统中药化学成分复杂，药效物质基础不明确，难于质量控制。治疗肿瘤的各种中药有效部位的功效各有不同和侧重，用有效部位的配伍代替全方，既具备中药整体作用的特点，同时降低了其复杂性，便于药物的质量控制。因此，提供更加方便有效的化合物及含有这些化合物的中药有效部位的复方制剂具有重要的临床意义。

据文献报道补骨脂素原用于治疗白癜风、银屑病等皮肤病，且以往研究表明其对小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤、肝癌等有生长抑制作用和体外细胞毒作用。已有多种抗肿瘤的中药发明中以补骨脂药材作为主药。补骨脂素在一定的剂量浓度下，在体内和体外均显示对乳腺癌EMT₆有显著的生长抑制作用，通过超微结构的观察发现补骨脂素的作用机理可能是在破坏线粒体的同时，减少了细胞的能量供应，抑制了核酸及蛋白质的合成，降低相关酶的活性。

但是从目前对于补骨脂素的研究来看，单用补骨脂素时需要在较高浓度才能体现出抗肿瘤效果。因此，研究补骨脂素、异补骨脂素和其药物配伍对于各种肿瘤细胞生长的抑制作用，进而开发高效低毒的抗肿瘤药物具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种含有异补骨脂素的中药提取物，该提取物为补骨脂提取物，其特征是主要含有以下化合物：补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁，其中按重量百分比计算：异补骨脂素10％～24％，补骨脂素8％～19％，新补骨脂异黄酮4％～12％，补骨脂宁2％～9％。

本发明的第二个目的是提供含有异补骨脂素的中药提取物的制备方法，是由补骨脂药材提取分离得到，通过以下步骤实现：

将补骨脂药材浸于纯水中，加热回流，除去挥发油成分，药渣继续加入乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，然后依次改换更高浓度甲醇作为流动相，得到68％-72％甲醇作为流动相的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得到本发明的提取物。

具体通过以下步骤实现：

取补骨脂药材，浸于纯水中加热4-6小时，回流，除去挥发油成分；将得到的药渣加入乙醇(90％-98％)，加热回流1-3小时，提取1-2次，得到提取液I；将提取液I浓缩成浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用3％-8％甲醇作为流动相；改换12％-18％甲醇作为流动相，再改换28％-32％甲醇作为流动相；再改换48％-52％甲醇作为流动相；最后改换68％-72％甲醇作为流动相，得洗脱液I；将洗脱液I浓缩干燥后得到本发明的提取物。

本发明的第三个目的是提供该含有异补骨脂素的中药提取物在制备抑制敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞药物中的应用。

本发明中的中药提取物还可以和其他具有相同疗效的药物成分配伍，按照常规方法制成药剂学上允许的制剂形式。

所述的制剂包括注射剂和口服制剂。其中注射剂包括注射液、滴注液、粉针剂；口服制剂包括颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。

本发明的有益之处是：本发明提供的含有异补骨脂素的中药提取物是从补骨脂药材中提取出的有效成分的提取物。异补骨脂素单独作用可以抑制多种敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞的增殖。与提取物中的单一有效成分(补骨脂素和异补骨脂素)相比较，本发明中的提取物对于多种敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞具有更明显的抑制作用，且该提取物的化学成分简单明确，在药理研究上易于阐明其作用机制。本发明设计合理，制备简便，可满足生产中药物的质量控制。

附图说明

图1本发明中补骨脂提取物的HPLC-DAD分析图。

图2本发明中补骨脂提取物的主要化合物结构图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1 本发明补骨脂提取物的制备

称取补骨脂药材500g，溶于2L纯水中，加热回流5小时，使用索式提取装置收集挥发油成分，得到挥发油提取液。将得到的药渣加入2L工业酒精(95％乙醇)，99℃水浴回流提取2小时，得到提取液1，浓缩提取液1，得到浸膏约100g。采用ODS-C18柱对其进行分离，上样浸膏约50g，流速10ml/min；首先用5％甲醇作为流动相，然后改换15％甲醇作为流动相，再改换30％甲醇作为流动相，再改换50％甲醇作为流动相，再改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液1。将洗脱液1浓缩干燥后，得到提取物(补骨脂提取物)1.55g。

实施例2 本发明中的补骨脂提取物成分分析

1.补骨脂提取物中成分分析(高效液相色谱法)

色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：(A)水，(B)乙腈，采用线性梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速：0.8mL·min^-1；检测波长190～400nm；分析时间60min；进样量：10μL。

表1 线性梯度洗脱流动相配比变化

时间(min)	0	25	50	60
时间(min)	0	25	50	60	水％乙腈％	7525	6535	5050	3070

供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.上述补骨脂提取物的HPLC-DAD-MS/MS定性分析

测定方法：上述1.补骨脂提取物中成分分析(高效液相色谱法)，

质谱条件电喷雾电离源(API.ES)，正离子模式；鞘气：氮气(30psi)，辅助气：氮气(10psi)；温度：350℃；毛细管电压：19V；记录质量范围m/z150～1000；选择丰度最高的离子进行MS²分析。

分析结果：参见图1，根据DAD、MS和MS/MS数据与文献数据比对以及标准品保留时间比对，可推断图1中的1～4号峰对应的化合物分别为补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂宁(见图2)。

实施例3 本发明中的补骨脂提取物中有效成分的含量测定

1.补骨脂提取物中的补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂宁的含量测定(高效液相色谱法)

色谱条件参见实施例2的第1步，1.补骨脂提取物中成分分析(高效液相色谱法)。记录色谱时间为55分钟。

供试品溶液的制备称取补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂宁标准品和补骨脂提取物样品，用甲醇溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

2.测定方法精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定300nm处吸收的峰面积，以外标法计算样品含量。

分析结果补骨脂提取物中按重量百分比计算，异补骨脂素的含量为10％～24％，补骨脂素含量8％～19％，新补骨脂异黄酮含量4％～12％，补骨脂宁含量2％～9％。

实施例 4药理实验

1.细胞培养

白血病细胞K562/S为敏感株，K562/ADM为白血病细胞阿霉素耐药株。K562/ADM是由K562/S敏感细胞接触递增浓度的阿霉素诱导而成，具有典型多药耐药性。两细胞株均由浙江大学药学院杨波教授提供，培养于RPMI-1640培养基中，其中含10％超级新生牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素(100kU·L^-1)和链霉素(100kU·L^-1)，置于37℃、100％湿度、含5％CO₂和95％空气培养箱内培养。

人乳腺癌细胞MCF-7为敏感株，MCF-7/ADR为人乳腺癌细胞阿霉素耐药株。两细胞株均由浙江大学药学院杨波教授提供，培养于DMEM培养基中，其中含10％超级新生牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素(100kU·L^-1)和链霉素(100kU·L^-1)，置于37℃、100％湿度、含5％CO₂和95％空气培养箱内培养。

人口腔鳞状上皮细胞癌细胞KB为敏感株，KBv200为人口腔鳞状上皮细胞癌细胞长春新碱(VCR)耐药株。两细胞株均由浙江大学药学院杨波教授提供，培养于DMEM培养基中，其中含10％超级新生牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素(100kU·L^-1)和链霉素(100kU·L^-1)，置于37℃、100％湿度、含5％CO₂和95％空气培养箱内培养。

人肺腺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC-3和人肝癌细胞SMMC-7721由浙江大学药学院杨波老师提供，培养于RPMI-1640培养基中，其中含10％超级新生牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素(100kU·L^-1)和链霉素(100kU·L^-1)，置于37℃、100％湿度、含5％CO₂和95％空气培养箱内培养。

2.MTT法测定异补骨脂素和补骨脂提取物IV对肿瘤细胞的生长抑制作用

分别取对数生长期的K562/S、K562/ADM、MCF-7、MCF-7/ADR、KB和KBv200、A549、PC-3和SMMC-7721细胞(MCF-7、MCF-7/ADR、KB、KBv200A549、PC-3和SMMC-7721用EDTA-胰酶混合溶液消化后)以100μl(2×10⁴/ml)剂量浓度接种于96孔培养板上，在37℃，5％CO₂条件下培养24h后，弃去培养液。K562/S、K562/ADM、MCF-7、MCF-7/ADR、A549、PC-3和SMMC-7721分别将不同浓度的补骨脂提取物(80、40、20、10、5μg/ml)，异补骨脂素(100、50、25、12.5、6.25μg/ml)和阿霉素(23.05、4.61、0.92、0.18、0.04μg/ml)；KB和KBv200分别将不同浓度的补骨脂提取物(80、40、20、10、5μg/ml)，异补骨脂素(100、50、25、12.5、6.25μg/ml)和长春新碱(2×10^-4、2×10^-5、2×10^-6、2×10^-7、2×10^-8M)加入孔内。每一药物浓度设6个平行孔，每孔加入200μl培养液。空白组和阴性对照组加相同体积的培养液。孵育48h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)，再培养4h，弃去培养液，每孔加DMSO 150μl，室温振荡l0min，待完全溶解后，用酶标仪在波长550nm处读取吸光度(A)值。取6孔A值的均数按公式计算细胞抑制率(IR)：

计算IR并求出半数抑制浓度(IC₅₀)，以上实验重复3次。

3.结果

异补骨脂素和补骨脂提取物的5个浓度对白血病细胞K562/S、耐药株K562/ADM、人乳腺癌细胞MCF-7、耐药株MCF-7/ADR、人口腔鳞状上皮细胞癌细胞敏感株KB、耐药株KBv200、人肺腺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC-3和人肝癌细胞SMMC-7721作用48h后，对肿瘤细胞的杀伤作用明显(表2)，作用随药物浓度的递增而加大。而且本发明的补骨脂提取物的IC₅₀明显小于异补骨脂素、补骨脂素单用的IC₅₀。具体的说，本发明的补骨脂提取物的IC₅₀约为异补骨脂素、补骨脂素单用IC₅₀的1/5～1/2。说明本发明的补骨脂提取物中的补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂宁等有效成分在抑制肿瘤细胞增殖作用上可以产生明显的协同效应。

表2 本发明的补骨脂提取物对于不同肿瘤细胞株的IC₅₀

细胞株	补骨脂提取物IC₅₀(μg/ml)	异补骨脂素IC₅₀(μg/ml)
细胞株	补骨脂提取物IC₅₀(μg/ml)	异补骨脂素IC₅₀(μg/ml)	K562/SK562/ADMMCF-7MCF-7/ADRKBKBv200A549PC-3SMMC-7721	10.026.937.532.421.624.425.632.935.8	61.949.454.756.85.572.056.371.579.6

实施例5 滴丸的制备

取0的补骨脂提取物0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸600粒。

实施例6 冻干粉针剂的制备

取0的补骨脂提取物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述提取物混合均匀后，冷冻干燥，分装800支，即得。

实施例7 冻干粉针剂的制备

取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取0的补骨脂提取物2g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述提取物混匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。

Claims

1.一种含异补骨脂素的中药提取物，其特征是含有以下化合物：重量百分比为10％～24％的异补骨脂素、8％～19％的补骨脂素、4％～12％的新补骨脂异黄酮、2％～9％的补骨脂宁。

2.根据权利要求1所述的含异补骨脂素的中药提取物的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：

(1)将补骨脂药材浸于纯水中，加热回流4-6小时，除去挥发油成分；

(2)药渣继续加入90％-98％乙醇，加热回流1-3小时，提取1-2次得提取液I，将提取液I浓缩成浸膏；

(3)采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，然后依次改换更高浓度甲醇作为流动相，得到68％-72％甲醇作为流动相的洗脱液I；

(4)将洗脱液I浓缩干燥后得到本发明的提取物。

3.根据权利要求2所述的含异补骨脂素的中药提取物的制备方法，其特征是：步骤(3)中低浓度的甲醇为3％-8％甲醇，依次改换更高浓度甲醇，是改换12％-18％甲醇，然后改换28％-32％甲醇作为流动相，再改换48％-52％甲醇作为流动相，再改换68％-72％甲醇作为流动相，得洗脱液I。

4.根据权利要求1所述的含异补骨脂素的中药提取物在制备抑制敏感肿瘤细胞药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的含异补骨脂素的中药提取物在制备抑制多药耐药肿瘤细胞药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的含异补骨脂素的中药提取物，其特征是：所述的组合物与其他具有相同疗效的药物配伍，按照常规方法制成药剂学上允许的制剂。

7.根据权利要求6所述的含异补骨脂素的中药提取物，其特征是：制备的制剂形式为注射剂和口服制剂。