CN111588746A

CN111588746A - 一种补骨脂药材的炮制方法、补骨脂提取物及其用途

Info

Publication number: CN111588746A
Application number: CN202010270116.2A
Authority: CN
Inventors: 高秀梅; 周昆; 王跃飞; 刘二伟; 樊官伟; 张伯礼
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2020-08-28
Also published as: CN105232621A

Abstract

本发明属于中药制剂领域，涉及一种补骨脂药材的炮制方法，具体为补骨脂药材加水提取，弃去水提液后收集药渣，即得可入药的补骨脂提取物。此外，还涉及上述炮制方法制得的补骨脂提取物和该提取物的医药用途。本发明的炮制方法去除了补骨脂中的大部分补骨脂苷和异补骨脂苷等水溶性成分，有效降低了补骨脂提取物的肝毒性损伤。

Description

一种补骨脂药材的炮制方法、补骨脂提取物及其用途

本发明是申请号为201510767141.0、优先权日为2014年11月11日、申请日为2015年11月11日、发明名称为“一种补骨脂药材的炮制方法、补骨脂提取物及药物组合物”申请的分案申请。

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种补骨脂药材的炮制方法，以降低药材的肝毒性损伤，还涉及制得的补骨脂提取物及其医药用途。

背景技术

补骨脂(Psoralea corylifolia L.)，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实，又名破故纸、婆固脂、胡韭子，属蔷薇目，豆科一年生直立草本。补骨脂高60～150cm，叶为单叶，长7～8mm；叶柄长2～4.5cm，叶宽卵形，花序腋生，有花10～30朵，花冠黄色或蓝色，花瓣明显具瓣柄，旗瓣倒卵形，荚果卵形，花、果期7～10月。

补骨脂具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效，主要用于治疗腰膝冷痛、滑精、遗尿、尿频、五更泄泻、虚寒咳嗽；外用治白癜风。补骨脂中主要含有香豆素、黄酮、单萜酚等成分。现代药理研究表明，补骨脂具有扩张血管、增加心肌收缩力、抗菌、抗肿瘤、增强免疫、雌激素样作用。

补骨脂为传统中药，内服多以炮制品入药。中华人民共和国药典和地方性的炮制规范均为“盐炙法”，经调查，除个别地方使用“盐蒸法”外，其他遵古炮制方法大半已失传。目前普遍采用的盐炙法是否为炮制最佳工艺，尚未见报道。

杨滨等在《补骨脂古今主要炮制方法比较》中公开了几种已知的补骨脂炮制方法，包括：

雷公法，以黄酒浸泡补骨脂过夜，滤除酒后加水浸泡3日，滤去水后蒸即可；

酒浸炒，以黄酒浸泡补骨脂过夜，滤除酒后置电炒锅内炒至有噼啪声响，微鼓起；

清炒法，取补骨脂置于电炒锅内炒至噼啪有声，微鼓起；

盐炙法，取补骨脂以盐水拌匀，闷润后，置于电炒锅内炒至噼啪有声，微鼓起；

蒸法，取补骨脂加盐水闷润过夜，蒸即可。

文献报道：从补骨脂中分离鉴定了30余种化学成分，主要包括香豆素、黄酮、单萜酚等成分。其中，补骨脂素和异补骨脂素(呋喃香豆素)的研究较为透彻，具有抗肿瘤、止血、光敏作用，是治疗白癜风的主要成分；中华人民共和国药典以补骨脂素和异补骨脂素作为补骨脂的含量测定和薄层鉴别指标。补骨脂酚在补骨脂中有较高的含量，具有抗诱变、抗细胞毒、抗菌等作用。

随着补骨脂的临床应用范围不断扩大，补骨脂的肝脏毒性也逐渐引起科研工作者的重视。已有临床案例显示，补骨脂存在一定的肝脏毒性损伤。Soon Woo Nam等于2005年在Clinical toxicology发表了《补骨脂导致急性黄疸型肝炎一例》，报道了一例绝经后妇女在服用10倍正常剂量的补骨脂后引起急性胆汁郁积型肝炎，肝组织检查发现肝脏中三个区域出现坏死、细胞变异、胆汁郁积及炎症细胞浸润。2009年Wing I Cheung等在Clinicaltoxicology又发表了《应用补骨脂及其中成药导致肝损伤》，文中报道了在服用补骨脂和含有补骨脂的中成药后出现了三例急性肝炎病例，补骨脂素和异补骨脂素或相关成分可能是引起肝脏毒性的化学成分。

目前，已知方法炮制出的补骨脂存有较大的肝毒性损伤危害，诸多含有补骨脂的中成药均出现了一定的副作用。

发明内容

现有技术已知的补骨脂药材炮制方法炮制出的补骨脂具有肝毒性损伤，本发明的目的在于提供一种可有效降低肝毒性损伤的补骨脂药材的炮制方法。

本发明第一方面提供了一种补骨脂药材的炮制方法，包括以下步骤：补骨脂药材加水提取，弃掉水提液收集药渣，即为补骨脂提取物。

本发明第一方面的一个实施方式中，加水量为补骨脂药材重量的至少2倍量；具体为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25倍量或者上述任意两数值之间的倍量，更具体为2-4倍量、3-5倍量、4-6倍量、5-8倍量、6-8倍量、6-10倍量，优选地，加水量为补骨脂药材重量的6-8倍量，更优选为6、7或8倍量。

本发明第一方面的一个实施方式中，加水提取至少1次；具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次；更具体为1-8次、1-5次、1-6次、1-3次；优选地，加水提取2-3次，优选为2次。

本发明第一方面的一个实施方式中，每次提取至少10分钟；具体为10分钟、15分钟、20分钟、24分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时或者上述任意两数值之间的时间；更具体为10分钟-0.5小时、0.5-1小时、1-2小时、0.5-2小时、1-1.5小时；优选地，每次提取1-2小时；更优选地，每次提取0.5、1、1.5或2小时。

本发明第一方面的一个实施方式中，包括如下(1)至(3)中的任意一项或者多项：

(1)所述提取为热回流提取；

(2)提取温度至少为70℃，具体为70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、140℃或者上述任意两数值之间的温度；优选为70-80℃、75-90℃、85-90℃、90-100℃或80-120℃，更优选为100℃；

(3)提取时对补骨脂药材进行包煎；具体地，所述包煎为将补骨脂药材用纱布包装后加水提取。

本发明第一方面的一个实施方式中，还包括干燥所述药渣的步骤；具体地，采用烘箱干燥所述药渣。

本发明第一方面的一个实施方式中，干燥温度至少为70℃，干燥时间至少为5小时；具体地，干燥温度为70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃或者上述任意两数值之间的温度；具体地，干燥时间为5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、18小时、20小时或者上述任意两数值之间的时间；优选地，干燥温度为70-90℃、80-100℃、80-120℃、90-110℃、100-130℃，干燥时间为5-7小时、5-8小时、6-7小时、6-9小时、7-10小时、7-9小时、8-11小时、8-13小时、9-12小时、9-13小时；更优选地，干燥温度为80、100或120℃，干燥时间为6、7、8、9或10小时。

本发明第二方面提供了一种补骨脂提取物，包括如下1)-10)中的任意一项或者多项，其中化合物的脱除率、保留率参照实验例4.2.6测定：

1)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂苷的脱除率≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥69％、≥73％、≥75％、≥80％、≥85％、≥88、≥90％、≥92％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％；

2)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中异补骨脂苷的脱除率≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥68％、≥70％、≥73％、≥75％、≥79％、≥80％、≥82％、≥85％、≥88％、≥90％、≥91％或≥95％；

3)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂酚的保留率≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥84％、≥87％、≥89％、≥91％、≥92％或≥95％；

4)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂素的保留率≥49％、≥50％、≥55％、≥57％、≥60％、≥65％、≥68％、≥70％、≥75％、≥77％、≥80％、≥84％、≥87％、≥90％、≥94％、≥96％或≥99％；

5)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中异补骨脂素的保留率≥50％、≥55％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥84％、≥90％、≥95％或≥98％；

6)所述补骨脂提取物还含有补骨脂黄酮类成分；具体地，所述补骨脂黄酮类成分为甲素和/或补骨脂乙素，例如补骨脂乙素；更具体地，相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂乙素的保留率≥60％、≥64％、≥66％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥88％、≥90％、≥92％、≥95％、≥97％或≥99％；

7)由权利要求1至7任一项所述的方法制得；

8)补骨脂提取物中补骨脂苷和异补骨脂苷的含量之和小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.15％、小于0.1％、小于0.05％或为零；优选小于0.2％；

9)补骨脂提取物中补骨脂素和异补骨脂素的含量≥0.5％、≥0.7％、≥1％或≥1.2％；优选为≥0.7％；

10)补骨脂提取物中补骨脂酚含量≥1％、≥2％、≥3％、≥4％、≥5％、≥6％或者≥7％；更具体地，所述补骨脂提取物还含有补骨脂黄酮类成分。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，其含第二方面的补骨脂提取物，以及任选地药学上可接受的载体或辅料。

本发明第四方面提供了第二方面所述的补骨脂提取物在制备治疗腰膝冷痛、滑精、遗尿、尿频、五更泄泻、虚寒咳嗽、白癜风、骨质疏松、白细胞减少的药物中的用途或者在制备具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻、扩张血管、增加心肌收缩力、抗菌、抗肿瘤、抗细胞毒、增强免疫、抗诱变、止血、光敏、雌激素样作用的药物中的用途。

术语“ERα”指雌激素受体α。

术语“ERβ”指雌激素受体β。

本发明取得的有益效果：

本发明的炮制方法，对补骨脂药材加水进行炮制，并弃去水提液以药渣入药。实验证明，本发明所述炮制方法得到的药渣中补骨脂苷和异补骨脂苷水溶性成分的含量很低，有效降低了补骨脂药材的肝毒性损伤。经过对炮制工艺进行研究，加入相当于补骨脂药材重量8倍量的水，提取2次，每次1小时，能更大限度地去除药渣中补骨脂苷和异补骨脂苷水溶性成分，同时更大限度地保留补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素以及补骨脂酚等有效成分。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为C57小鼠正常肝组织对照组形态(HE染色，400倍)。

图2A为C57小鼠腹腔注射补骨脂素4周后肝组织病理组织学检测形态(HE染色，400倍)。

图2B为C57小鼠腹腔注射异补骨脂素9天后肝组织病理组织学检测形态—1(HE染色，400倍)。

图2C为C57小鼠腹腔注射异补骨脂素9天后肝组织病理组织学检测形态—2(HE染色，400倍)。

图3A为补骨脂原药粉的超高效液相色谱图。

图3B为补骨脂水提物的超高效液相色谱图。

图3C为水提后的补骨脂药渣的超高效液相色谱图。

其中，1-补骨脂苷，2-异补骨脂苷，3-补骨脂素，4-异补骨脂素，5-补骨脂乙素，6-补骨脂酚。

具体实施方式

本发明提供了具体实施方案以及它们之间所有可能的组合。出于简洁的目的，本申请没有逐一记载实施方案的各种具体组合方式，但应当认为本申请具体记载并公开了所述具体实施方案的所有可能的组合方式。

实验例1导致肝毒性损伤的补骨脂成分的研究

前期研究从补骨脂中分离得到香豆素苷(补骨脂苷、异补骨脂苷)、香豆素(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定)、黄酮(补骨脂异黄酮、异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮、corylifol A、新补骨脂异黄酮)、单萜酚(补骨脂酚)等化合物。

对上述相关化合物进行雌激素样活性研究^[1]，结果表明：补骨脂素和异补骨脂素通过激活ERα发挥雌激素样作用；异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮、corylifol A、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚等化合物通过激活ERα和ERβ发挥雌激素样作用。补骨脂素、异补骨脂素与ERα的结合率远高于ERβ，补骨脂酚则主要作用于ERβ。

研究表明^[2]-[3]，雌激素长期大量使用可造成动物肝脏损害，出现肝脏肿大、肝细胞坏死、ALP(血清碱性磷酸酶)和BA(胆汁酸)升高等问题。并且，雌激素导致的肝毒性与ER(雌激素受体)的激活有明确的相关性，例如，17β-雌二醇在ERα的介导下可以抑制BSEP等胆汁酸转运体的mRNA表达，干扰胆汁酸合成转运进而导致肝脏损害，敲除ERα后雌激素的肝脏损害作用不再发生。因此，补骨脂素、异补骨脂素对ERα的高亲和性可能导致肝损伤。

申请人研究测定了大鼠灌胃补骨脂原药后肝脏中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚的含量，并进行了三者对HepG2细胞的体外毒性试验。结果表明，补骨脂原药3g/kg连续给大鼠灌胃12周，在末次药后检测大鼠肝脏中的补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚的含量分别为469、1418、97ng/g。补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚对HepG2细胞的体外毒性研究表明：药物作用于HepG2细胞24h，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚IC₅分别为1.26、21.46、8.36μmol/L。采用IC₅近似表达药物的最小毒性剂量，则1/IC₅可表示各成分的相对毒性强度。补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚对肝毒性的贡献采用肝脏中的药物浓度(C)和1/IC₅的乘积描述。补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚的肝脏毒性比约为32.2:5.7:1，提示补骨脂素、异补骨脂素的肝毒性影响远大于补骨脂酚。

申请人初步研究证明：补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚80mg/kg皮下注射给药1周，补骨脂素、异补骨脂素组小鼠体重降低，异补骨脂素组小鼠血清TBA显著高于对照组。

申请人以C57小鼠腹腔注射给予补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚80mg/kg，补骨脂素给药4周、异补骨脂素给药9天进行研究。结果显示：补骨脂素、异补骨脂素组血清AST、ALT升高，补骨脂酚组血清AST、ALT无显著变化。异补骨脂素组小鼠肝脏可见肝细胞变性坏死，给药前正常肝组织对照组形态如图1所示，而给药后病理组织学检测如图2A-2C显示，图2A为补骨脂素引起肝细胞变性，图2B-2C为异补骨脂素引起的肝细胞坏死和肝细胞脂肪变性。

申请人采用通过大鼠体外模拟代谢研究，在大鼠肠道菌群培养液中厌氧孵育4小时后补骨脂苷和异补骨脂苷完全转化为补骨脂素和异补骨脂素，转化率分别为92.14％和97.92％。补骨脂苷、异补骨脂苷在体内肠道菌群作用下转化为补骨脂素、异补骨脂素。补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素含量约为0.7％，但是补骨脂苷和异补骨脂苷含量之和达2％以上。由于补骨脂苷、异补骨脂苷体内代谢转化为补骨脂素、异补骨脂素，使服用补骨脂后补骨脂素和异补骨脂素的体内暴露量明显升高，最终过量的补骨脂素和异补骨脂素导致肝损害的发生。而且，由于补骨脂苷和异补骨脂苷含量的不确定性也使得补骨脂素和异补骨脂素含量的控制变得毫无意义。

可见，补骨脂中的补骨脂苷、异补骨脂苷在体内转化为补骨脂素和异补骨脂素是造成补骨脂肝损伤毒性的重要因素，也是改进补骨脂炮制工艺的研究方向。

实验例2补骨脂药材水提后不同药用部位肝脏毒性的研究

为了明确补骨脂药材水提后引起肝脏毒性的药用部位，进一步开展了补骨脂原药组(补骨脂药材)、补骨脂水提物组、水提后补骨脂药渣组的肝毒性研究。

补骨脂水提物及补骨脂药渣的制备：加入补骨脂药材8倍量的水100℃进行热回流提取，提取2次，每次1.5小时，过滤得到水提液，减压浓缩成稠膏，即为水提物；过滤后得到的药渣烘干即为水提后补骨脂药渣。

采用UPLC-UV法测定补骨脂原药、补骨脂水提物、水提后补骨脂药渣中补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素、补骨脂酚的含量(测定方法见实验例4)，测定结果见表1。

表1各实验组化学成分含量(mg/100g原药，n＝3)

类别	成分	原药粉	水提物	水提药渣
					糖苷	补骨脂苷	1422.54	1292.56	75.30
	异补骨脂苷	1010.99	891.04	39.91
					香豆素	补骨脂素	500.74	70.60	415.63
	异补骨脂素	414.09	47.44	355.27
					黄酮	补骨脂乙素	436.97	0.00	369.64
单萜酚	补骨脂酚	6251.57	56.20	6795.45

注：1g水提物相当于4.78g原药；1g水提药渣相当于1.33g原药

原药粉、补骨脂水提物、水提后的补骨脂药渣的超高效液相色谱图见图3A-3C，其中，1代表补骨脂苷，2代表异补骨脂苷，3代表补骨脂素，4代表异补骨脂素，5代表补骨脂乙素，6代表补骨脂酚。

由检测结果可知：补骨脂水提物与补骨脂原药均含较多的致肝脏损伤的补骨脂苷和异补骨脂苷等水溶性成分。

毒理研究结果表明：灌服补骨脂水提物的大鼠肝重、肝脏系数显著高于空白对照组，血清中AST，ALT，ALP值有明显升高趋势。因此，为保证补骨脂长期用药的安全性，补骨脂提取工艺中应除去以补骨脂苷和异补骨脂苷为代表的水溶性成分。由此，本发明确定了补骨脂药材水提去除补骨脂苷、异补骨脂苷等水溶性成分，以药渣入药的提取工艺，有效降低了补骨脂的肝毒性损伤。

实验例3本发明炮制方法得到的炮制品的肝毒性和药效研究

3.1.肝毒性研究：

以补骨脂原药和本发明炮制方法得到的炮制品进行大鼠肝毒性研究，其中本发明的炮制方法参见实验例2中补骨脂药渣的制备，结果见表2-4。

表2连续灌胃1个月对大鼠肝重和肝系数的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05,²⁾P<0.01,³⁾P<0.001；

与等剂量生药组比较，^a)P<0.05，^b)P<0.01，^c)P<0.001。

表3连续灌胃1个月对大鼠肝脏MDA的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05,²⁾P<0.01,³⁾P<0.001；

与等剂量生药组比较，^a)P<0.05，^b)P<0.01，^c)P<0.001。

表4连续灌胃3个月对大鼠肝重和系数的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05,²⁾P<0.01,³⁾P<0.001；

与等剂量生药组比较，^a)P<0.05，^b)P<0.01，^c)P<0.001。

与对照组相比，连续灌胃1个月，原药组大鼠肝脏肿大明显、肝系数显著升高，而炮制品组大鼠肝系数有所改善(表2)；原药组大鼠肝脏中MDA含量显著升高，炮制品组MDA水平与对照组无差异(表3)；对血液生化、血液学指标无显著影响。连续灌胃3个月，与原药组相比，炮制品组的肝系数明显降低(表4)。

3.2.药效研究：

对补骨脂原药和本发明炮制方法得到炮制品的药效作用进行了考察。用环磷酰胺导致的大鼠白细胞降低模型和维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型分别考察原药、炮制品在抗白细胞减少和治疗骨质疏松方面的药效，实验结果见表5-6。

表5给药15天对血液指标的影响

注：与对照组比较，^▲▲▲P<0.001；

与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表6给药8周对大鼠胫骨骨密度的影响

注：与对照组比较，^▲▲P<0.01；

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

结果表明，给药15天，补骨脂原药组和炮制品组大鼠白细胞和红细胞数量均显著高于模型组(见表5)；给药8周后，用VivaCT 40骨密度仪对大鼠胫骨进行骨CT扫描，发现显示补骨脂原药组和炮制品组大鼠胫骨骨密度显著高于模型组(见表6)。

实验例4本发明炮制方法工艺的研究

4.1.正交试验设计：

取补骨脂药材200g加水，在100℃进行热回流提取，以溶剂用量、提取时间、提取次数为因素，按L₉(3³)正交表安排实验，见表7-8。

表7因素水平表

表8炮制方法工艺研究正交表

4.2.样品测定：

将1-9号正交试验获得的水提液和药渣分别制备成供试品，对供试品进行液相色谱检测，以分析、计算出水提液和药渣中各成分含量。

4.2.1制备水提液和药渣的供试品：

水提液供试品制备方法：1、6、8号试验水提液各取1mL置25mL容量瓶，50％甲醇定容至刻度，涡旋混匀，取1mL，置5mL容量瓶，50％甲醇定容至刻度，涡旋混匀；2、4、9号试验水提液各取2mL，同法处理；3、5、7号试验水提液各取4mL，同法处理。

药渣供试品制备方法：将1-9号试验的药渣干燥，每一试验的药渣平行称重两份，每份0.2g，精密称定，置锥形瓶中，加入25mL甲醇，100℃热回流提取0.5小时，吸取上清液1mL，置10mL容量瓶中，50％甲醇定容至刻度，涡旋混匀，14000rpm离心10min，取上清液。

4.2.2液相色谱分析条件：

仪器：Waters ACQUITY UPLC^TM system超高效液相色谱仪；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；

流动相：0.1％甲酸水-乙腈梯度洗脱，洗脱程序见表9；

柱温：60℃；

流速：0.5mL/min；

检测波长：246nm；

进样量：2μL。

表9梯度洗脱程序

时间(min)	A(0.1％甲酸)	B(乙腈)
			0	92	8
3	85	15
			4	70	30
6	68	32
			7	48	52
10	15	85

4.2.3配制水提液和药渣中各成分的标准曲线：

由于水提液中两苷含量较高，其它成分含量较低；而药渣中补骨脂酚等成分含量较高，两苷含量较低。因此配制了两组标准曲线，一组用于测定水提液中各成分含量，另一组用于测定提取后药渣中各成分的含量，见表10和11。

表10用于水提液中成分分析的标准曲线

表11用于药渣中成分分析的标准曲线

4.2.4水提液和药渣中各成分含量的测定：

将1-9号试验得到的水提液供试品和药渣供试品，按照4.2.2的色谱条件分析，并根据4.2.3的标准曲线计算出水提液和药渣中各成分的含量，结果见表12-13。

表12水提液中各成分的含量(折合成每克补骨脂原药中的含量)

表13药渣中各成分的含量(折合成每克补骨脂药渣中的含量)

4.2.5药渣的水分测定

按药典水分测定法中的烘干法操作，取1-9号正交试验获得的药渣各2g，分别平铺于扁形称量瓶中，精密称定。打开瓶盖在100℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30min后精密称定，再在上述温度下干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg时记录重量，计算出1-9号正交试验药渣各自的水分含量，结果见表14。

表14正交试验药渣的水分含量测定结果

结果表明，1-9号正交试验的药渣水分含量均符合中国药典规定的补骨脂水分要求，均低于9％。

4.2.6炮制工艺的综合评定：

称取补骨脂原药粉末0.2g，处理方法同4.2.1项下药渣的处理，得到原药材中补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素及补骨脂酚的含量分别为18.63、14.97、3.81、3.61、4.92、66.98mg/g。

为了考察补骨脂苷和异补骨脂苷的去除情况，定义补骨脂苷和异补骨脂苷的提取率的权重系数各0.5；为了考察补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素以及补骨脂酚的保留情况，定义补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素以及补骨脂酚的权重系数各0.25。为了最大限度地除去两苷，同时保留补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素以及补骨脂酚，综合补骨脂苷/异补骨脂苷提取率和其它成分的保留率计算加权得分，结果见表15。

补骨脂苷(异补骨脂苷)成分的提取率＝100％×水提液中补骨脂苷(异补骨脂苷)的量/200g原药中的补骨脂苷(异补骨脂苷)的量

补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素或补骨脂酚成分的保留率＝100％×药渣中该成分的量/200g原药中该成分的量

综合得分＝(0.5×补骨脂苷提取率+0.5×异补骨脂苷提取率)+(0.25×补骨脂素保留率+0.25×异补骨脂素保留率+0.25×补骨脂乙素保留率+0.25×补骨脂酚保留率)

表15综合得分结果

根据上表可知，本发明试验2、4、7的炮制工艺能够更大限度地去除两苷，同时更大限度地保留补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素以及补骨脂酚等有效成分；其中，尤以试验2炮制工艺的效果最好。

4.3.正交试验结果与方差分析

正交试验1-9的结果与方差分析见表16-17。

表16正交试验1-9极差分析结果

表17 SPSS软件方差分析结果

^a.R方＝.461(调整R方＝-1.155)

从表16正交试验1-9极差分析结果可以看出这三个因素对补骨脂提取作用的大小依次为：C>A>B(提取次数＞溶剂用量＞提取时间)，选择最佳条件为A2B1C2，即8倍水体积提取2次，每次1小时。从表17方差分析可以看出，提取次数、提取时间及溶剂用量三个因素对补骨脂提取影响都不显著。

4.4.炮制方法的工艺验证—1

为了考察最佳炮制工艺的重复性，进行了补骨脂药材提取放大试验。同时，为了减少药渣损失、方便回收药渣，考虑将药材进行包煎。据此，进一步考察了包煎和不包煎两种放大试验对结果的影响，并且平行测定两次。

不包煎：称取1kg补骨脂原药，加入8倍水提取两次，每次1小时。

包煎：将1kg补骨脂原药用纱布进行包装，卷成条状，放入10L圆底烧瓶中，同样加入8倍水提取两次，每次1小时。

4.4.1水提液中各成分含量测定

参照4.2方法对水提液中各成分含量进行测定，结果见表18。

表18放大试验水提液中各成分的含量(折合成每克补骨脂原药中的含量)

结果表明，两次放大试验的测定结果相差不大，表明炮制工艺重复性好，而且，包煎对补骨脂药材减毒工艺研究影响不大，可在实际生产中运用包煎方法。

4.4.2药渣烘干方式的考察

将放大试验的不包煎药渣和包煎药渣分别分作两份，进行60℃减压干燥和100℃烘箱干燥，观察干燥情况，结果如表19。

表19药渣烘干方式结果

结果表明，减压干燥效果不明显，9h后药渣仍然非常湿，含大量水分，减压干燥不适合放大试验的药渣干燥，但可能适合干燥少量药渣。药渣经100℃烘箱5h干燥后开始变干，但仍感觉含少量水分，所以将6h后各时间点的药渣粉碎，过3号筛，按照药典法进行水分含量测定，结果见表20。

表20药渣水分含量测定

结果表明，水分含量均符合药典规定，考虑到生产的方便性，选择烘箱100℃烘干6小时为最优的干燥方式。

4.4.3药渣中各成分含量测定

参照4.2方法对100℃干燥6小时的药渣进行各成分的含量测定，结果见表21。

表21放大实验药渣中各成分的含量(折合成每克补骨脂药渣中的含量)

结果表明，两次放大试验的测定结果相差不大，表明炮制工艺重复性好，而且，包煎对补骨脂药材减毒工艺研究影响不大，也可提高药渣中有效成分的保留，因此可在实际生产中运用包煎方法。

4.4.4放大试验的综合评定(参照4.2.6进行)：

表22放大试验综合得分结果

结果显示，补骨脂苷、异补骨脂苷的提取率，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素及补骨脂酚的保留率，综合得分与确定的最优工艺结果基本一致，说明此工艺方法重现性较好。

4.5炮制方法的工艺验证—2

为了进一步验证工艺的可重复性和工艺操作的可行性，按照4.4炮制方法开展了3批生产线的放大试验，得到3批次药渣。

表23三批次药渣中各成分的含量

可见，本发明补骨脂药材的炮制方法同样适用于生产线放大试验。

实施例1

取补骨脂药材200g，加水1200g，热回流提取1次，提取3小时，弃去水提液后收集药渣，将所述药渣干燥即得可入药的补骨脂药渣。

实施例2

取补骨脂药材200g，加水1600g，热回流提取2次，每次提取1小时，弃去水提液后收集药渣，将所述药渣干燥即得可入药的补骨脂药渣。

实施例3

取补骨脂药材200g，加水2000g，热回流提取3次，提取0.5小时，弃去水提液后收集药渣，将所述药渣干燥即得可入药的补骨脂药渣。

实施例4

取补骨脂药材200g，加水1400g，热回流提取2次，提取2小时，弃去水提液后收集药渣，将所述药渣干燥即得可入药的补骨脂药渣。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

参考文献：

[1]Xin Dan,Wang Hong,Yang Jing,Su Yanfang,Fan Guanwei,Wang Yuefei,Zhuyan,Gao xiumei.Phytoestrogens from Psoralea corylifolia reveal estrogenreceptor-subtype selectivity.Phytomedicine,2010,17:126-131.

[2]Helen H.Wang,Nezam H.Afdhal,David Q.–H.Wang.Estrogen receptorα,butnotβ,plays a major role in 17-estradiol–induced murine cholesterolgallstones.Gastroentrology,2004,127:239–249.

[3]Yukio Yamamoto,Rick Moore,Holly A.Hess,Grace L.Guo,FrankJ.Gonzalez,Kenneth S.Korach,Robert R.Maronpot,Masahiko Negishi.Estrogenreceptor alpha mediates 17alpha-ethynylestradiol causing hepatotoxicity.TheJournal of Biological Chemistry,2006,281:16625–16631.

Claims

1.一种补骨脂药材的炮制方法，包括以下步骤：

补骨脂药材加水提取，弃掉水提液收集药渣，即为补骨脂提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，加水量为补骨脂药材重量的至少2倍量；优选地，加水量为补骨脂药材重量的6-10倍量，更优选为6、7或8倍量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，加水提取至少1次，优选为1-3次，更优选为2次。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，每次提取至少10分钟，优选为每次提取1-2小时，更优选为每次提取1、1.5或2小时。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于如下(1)至(3)中的任意一项或者多项：

(1)所述提取为热回流提取；

(2)提取温度至少为70℃，优选为80-120℃，更优选为100℃；

(3)提取时对补骨脂药材进行包煎；优选地，所述包煎为将补骨脂药材用纱布包装后加水提取。

6.根据权利要求1或2所述的方法，还包括干燥所述药渣的步骤；优选地，采用烘箱干燥所述药渣。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，干燥温度至少为70℃，干燥时间至少为5小时；优选地，干燥温度为80-120℃，干燥时间至少为6小时；更优选地，干燥温度为80、100或120℃，干燥时间为6、7、8、9或10小时。

8.一种补骨脂提取物，其特征在于如下1)-7)中的任意一项或者多项：

1)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂苷的脱除率≥45％、≥75％、≥90％、≥95％或≥98％；

2)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中异补骨脂苷的脱除率≥40％、≥70％、≥85％或≥90％；

3)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂酚的保留率≥45％、≥75％、≥87％、≥91％或≥92％；

4)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂素的保留率≥49％、≥50％、≥65％、≥80％或≥90％；

5)相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中异补骨脂素的保留率≥50％、≥75％、≥84％或≥98％；

6)所述补骨脂提取物还含有补骨脂黄酮类成分；优选地，所述补骨脂黄酮类成分为甲素和/或补骨脂乙素，例如补骨脂乙素；更优选地，相比于补骨脂药材，补骨脂提取物中补骨脂乙素的保留率≥60％、≥64％、≥66％、≥70％、≥75％、≥80％或≥85％；

7)由权利要求1至7任一项所述的方法制得。

9.权利要求8所述补骨脂提取物在制备治疗腰膝冷痛、滑精、遗尿、尿频、五更泄泻、虚寒咳嗽、白癜风、骨质疏松、白细胞减少的药物中的用途或者在制备具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻、扩张血管、增加心肌收缩力、抗菌、抗肿瘤、抗细胞毒、增强免疫、抗诱变、止血、光敏、雌激素样作用的药物中的用途。