CN107854522B - 一种组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组合物，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比(1～2)：(1～2)：(1～2)；或包含黄芪‑葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪‑葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为(0.5～5):1，所述黄芪‑葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1。同时，本发明公开了所述组合物的制备方法和用途。本发明组合物，其制备工艺科学先进，质量可控，具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸的作用，能够有效用于肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症和高同型半胱氨酸血症的治疗，产生显著的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物及其制备方法和用途，尤其是一种具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸作用的组合物的制备方法和用途。
背景技术
黄芪，又名绵芪，其主要活性成分是黄芪甲苷，具有抑制代谢综合征、延缓心肌缺血中心肌病变和改善心功能等作用，现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。能消除实验性肾炎蛋白尿，增强心肌收缩力，调节血糖含量。黄芪不仅能扩张冠状动脉，改善心肌供血，提高免疫功能，而且能够延缓细胞衰老的进程。
葛根，为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛。葛根中主要活性部位为总黄酮，其中葛根素是其主要活性成分之一。葛根素具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗作用，以及降压、扩张冠状动脉、改善心肌缺血、抗缺氧再灌注损伤、保护内皮功能以改善血液动力学、抑制血小板聚集等多种心血管保护作用，因此葛根素被广泛的应用于临床治疗糖尿病型冠心病和多种心血管疾病。
桑白皮为桑科植物桑的干燥根皮。其含黄酮类成分:桑素、桑皮色烯素、环桑素等。桑白皮中分离并证实了降血糖成分脱二氧亚胺基葡萄醇和MoranA降糖物质，经过试验，已经证实MoranA对四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠有剂量依赖的降糖效果。
我们前期的研究结果证实黄芪、葛根和桑白皮组合物的共提物具有降血脂、保肝和治疗肥胖的作用，但组合物的共提物存在有效成分不明确、生物利用度低、疗效不稳定、质量难以控制等缺陷。因此，以黄芪、葛根和桑白皮各药材有效部位作为研究对象，采用现代制药技术将其开发成成熟的中药制剂，控制提取物的质量，建立提取物的质量标准，是非常必要的。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸作用的组合物，其可有效用于肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症和高同型半胱氨酸血症的治疗，产生显著的效果。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种组合物，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为(1～2)：(1～2)：(1～2)；
或包含黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为(0.5～5):1，所述黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1；
所述黄芪提取物的制备方法包括以下步骤：A、将黄芪药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为60～100℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.075～0.3g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以10～20BV的水，8～12BV体积分数为0.05～0.5％的NaOH溶液和8～12BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min，最后以10～20BV体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物；
所述葛根提取物的制备方法包括以下步骤：A、将葛根药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.05～0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10～20BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min；再以10～20BV的体积分数为30～50％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物；
所述黄芪-葛根提取物的制备方法包括以下步骤：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2～0.4g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以4～10BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3BV/h；再以4～12BV的体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物；
所述桑白皮提取物的制备方法包括以下步骤：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用6～8BV体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物。
优选地，所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为1:2:1。
优选地，所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为1:2。
优选地，所述黄芪提取物的制备步骤A中，以8BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.075g/mL；
步骤C中用AB-8型大孔树脂对粗提液进行吸附，然后依次以10BV的水，10BV体积分数为0.5％的NaOH溶液和10BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，最后以10BV体积分数为70％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱。
优选地，所述葛根提取物的制备步骤A中，以10BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.1g/mL；
步骤C中用AB-8型大孔树脂对粗提液进行吸附，然后以10BV的水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min；再以10BV的体积分数为50％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱。
优选地，所述黄芪-葛根提取物的制备步骤A中，以10BV体积分数为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.2g/mL；
步骤C中用LX-18型大孔树脂对粗提液进行吸附后，以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为2BV/h；再以10BV的体积分数为70％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱。
优选地，所述桑白皮提取物的制备步骤A中，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；
步骤B中生药浓度为0.120g/mL；
步骤C中用LSA-10型大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
优选地，所述黄芪提取物包含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄黄花素和黄芪甲苷；所述葛根提取物包含3’-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、染料木苷和芒柄花苷；所述黄芪-葛根提取物包含3’-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、毛蕊异黄酮苷、染料木苷、芒柄花苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、染料木素和芒柄花素；所述桑白皮提取物包含桑根酮C、桑根酮D和桑辛素。
优选地，所述黄芪提取物中含总皂苷质量百分含量以黄芪甲苷计大于50％，黄芪甲苷质量百分含量大于2.8％；所述葛根提取物中含总黄酮质量百分含量以葛根素计大于50％，葛根素质量百分含量大于15％；所述桑白皮提取物中异戊烯基类黄酮的质量百分含量大于50％，桑根酮C的质量百分含量大于6.4％，桑根酮D的质量百分含量大于3.4％。
本发明的另一目的，在于提供一种具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸作用的组合物的制备方法，该方法科学先进，质量可控。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1a)黄芪提取物制备：A、将黄芪药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为60～100℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.075～0.3g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以10～20BV的水，8～12BV体积分数为0.05～0.5％的NaOH溶液和8～12BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min，最后以10～20BV体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物，备用；
(2a)葛根提取物制备：A、将葛根药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.05～0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10～20BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min；再以10～20BV的体积分数为30～50％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物，备用；
(3a)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用6～8BV体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(4a)按比例称取步骤(1a)获得的黄芪提取物、步骤(2a)获得的葛根提取物和步骤(3a)中获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
优选地，所述步骤(1a)的步骤A中，将黄芪药材粉碎，以8BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.075g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，依次以10BV的水，10BV体积分数为0.5％的NaOH溶液和10BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，最后以10BV体积分数为70％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱。
优选地，所述步骤(1a)的步骤C中大孔树脂类型选自D101、LX-18、LSA-7、LSA-40、AB-8、XDA-5、XDA-1和HP-20中的一种；更优选地，所述步骤(1a)的步骤C中大孔树脂类型选自AB-8型。
优选地，所述步骤(2a)的步骤A中，将葛根药材粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.1g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，以10V的水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min；再以10BV的体积分数为50％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱。
优选地，所述步骤(2a)的步骤C中大孔树脂类型选自D101、LX-18、LSA-7、LSA-40、AB-8、XDA-1和HP-20中的一种；更优选地，所述步骤(1a)的步骤C中大孔树脂类型选自AB-8型。
优选地，所述步骤(3a)的步骤A中，将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；步骤B中生药浓度为0.120g/mL；步骤C中用大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
优选地，所述步骤(3a)的步骤C中大孔树脂类型选自LSA-10型。
或本发明所述的组合物制备方法，包括如下步骤：
(1b)黄芪-葛根提取物制备：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2～0.4g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以4～10BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3BV/h；再以4～12BV的体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物，备用；
(2b)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以6～8BV的体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(3b)按比例称取步骤(1b)获得的黄芪-葛根提取物和步骤(2b)获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
优选地，所述步骤(1b)的步骤A中，按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.2g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为2BV/h；再以10BV的体积分数为70％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱；
优选地，所述步骤(1b)的步骤C中大孔树脂类型选自D101、AB-8、XAD-7HP、HP-20、SP825、LSA-40、LX-18、XDA-5和ADS-7中的一种；更优选地，所述步骤(1b)的步骤C中大孔树脂类型选自LX-18型。
优选地，所述步骤(2b)的步骤A中，将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；步骤B中生药浓度为0.120g/mL；步骤C中用大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
优选地，所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物和黄芪-葛根提取物提取过程中，利用大孔树脂进行纯化前可先对其进行预处理，方法如下：装柱前清洗设备及管道，以防有害物对树脂的污染，并排净设备的水；先在树脂内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍的乙醇，然后将树脂投入柱中，使其液面高于树脂层0.3m，浸泡24h；用2BV乙醇，以2BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4～5h；用乙醇，以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止，并以水按同样的流速洗净乙醇；树脂连续运行中不必再进行预处理，停止运行过长时间时应考虑重新预处理；停止前要充分解吸、洗静，并以大于10％的NaCl的溶液浸泡，以免细菌污染树脂。
大孔树脂的再生方法：(1)用水除去机械杂质，至水清澈为止；(2)用2BV的5％HCl溶液以4～6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2～4h，然后用水以同样的流速洗至流出液pH值呈中性；(3)用2BV的2％NaOH溶液以4～6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2～4h，然后用水以同样的流速洗至流出液pH值呈中性。
大孔树脂再生的合格指标与判断方法：树脂再生后的颜色应与使用前接近，但略有加深；粒度均匀，无可见机械杂质；用水冲淋，洗出液清澈透明，pH值呈中性。
本发明的又一目的，在于提供一种具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸作用的组合物的质量控制标准。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种组合物的质量控制标准，包括如下步骤：
1、黄芪提取物
【制法】取黄芪干燥饮片，用70％乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浸膏用适量水稀释，上已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，依次用水、0.5％NaOH、10％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％相应的乙醇洗脱液，回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得。
【含量测定】
(1)总皂苷 照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录V A)测定。
对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约100mg，精密称定，加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次(4×40ml)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并定容至10ml量瓶中。精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2，0.25，0.3，0.35，0.4ml，分别于置具塞磨口试管中，水浴加热挥去溶剂，在每支试管中分别加入0.2ml 5％香草醛冰醋酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，摇匀，密塞，于70℃水浴恒温加热15min，取出后立即用冰浴5min，加冰醋酸5.0ml，摇匀。于波长535nm处分别测定吸光度。以吸光度为纵座标，黄芪甲苷重量为横座标，绘制标准曲线。
测定法 精密吸取供试品溶液0.3ml，照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含黄芪甲苷的重量(mg)，计算，即得。
本品按干燥品计算，含总皂苷以黄芪甲苷(C41H68O14)计，大于50％。
(2)黄芪甲苷 照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录VI D)进行含量测定。
色谱条件及系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35:65)为流动相；蒸发光散射检测器。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不得低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约100mg，精密称定，加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次(4×40ml)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含黄芪甲苷(C41H68O14)大于2.8％。
(3)其他黄酮类成分 照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录VI D)进行含量测定。
色谱条件与系统适用性条件 色谱柱为Kromasil 100-5C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈(A)和0.2％甲酸(B)，梯度洗脱，0～20min，20％～40％A，20～40min，40～40％A。流速为1.0mL·min-1，进样量10μL，检测波长为260nm，柱温40℃。
对照品溶液的制备 分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷6.32mg、毛蕊异黄酮2.36mg、芒柄花素2.46mg、芒柄花苷4.62mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，再分别精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.0632mg·L-1、0.0236mg·L-1、0.0246mg·L-1、0.0462mg·L-1的混标溶液。
供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约lg，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加人甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2、葛根提取物
【制法】取葛根干燥饮片，用70％乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浸膏用适量水稀释，上已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，依次用水、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得。
【含量测定】
(1)总黄酮 照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录V A)测定
对照品溶液的制备 精密称取60℃减压干燥至恒重的葛根素对照品5mg，加30％乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取本品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加30％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取供试品溶液0.5ml，置10ml量瓶中，加30％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于10ml量瓶中，分别加30％乙醇至刻度，摇匀。以30％乙醇溶液为空白，在250nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法供试品溶液照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葛根素的重量(mg)，计算，即得。
本品按干燥品计算，含总黄酮以葛根素(C21H20O9)计，大于50％。
(2)葛根素 照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录ⅥD)测定。
色谱条件及系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(28:72)为流动相；检测波长为250nm，理论塔板数按葛根素峰计算不得低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品5mg，置25mL容量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得0.2mg/mL对照品储备液。
供试品溶液的制备 取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加30％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含葛根素(C21H20O9)大于15％。
3、桑白皮提取物
【制法】取干燥桑白皮药材，用乙醇溶液浸泡3.5h，以体积分数为80％的乙醇回流提取，合并提取液；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于乙醇溶液中浸泡12h，然后用体积分数为80％乙醇溶液在进行渗漉，得到提取液；上已处理好的LSA-10大孔吸附树脂柱，依次以水、体积分数为80％的乙醇溶液进行洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得。
【含量测定】
照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录ⅥD)测定。
色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Dikma Techonlogies(迪马Diamonsil C185μm，200×4.6mm)；流动相：乙腈—0.1％乙酸水，洗脱程序见表1；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min
表1流动相洗脱程序
对照品溶液的制备 取桑根酮C、D和桑辛素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，并分别稀释成每1mL溶液含0.037mg桑根酮C、每1mL溶液含0.0216mg桑根酮D的对照品溶液和每1mL溶液含0.0466mg的桑辛素对照品溶液。
供试品溶液的制备 取本品约15.2mg，加10mL的甲醇进行定溶，摇匀，称定重量，超声40min，放冷后用甲醇补足失去的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含异戊烯基类黄酮的质量百分含量大于50％，桑根酮C的质量百分含量大于6.4％，桑根酮D的质量百分含量大于3.4％。
4、黄芪-葛根提取物
【制法】按比例称取黄芪、葛根干燥饮片共100g，加70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无液滴出现，上已处理好的LX-18大孔吸附树脂柱，依次以水、体积分数为30％、50％、70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱，减压回收洗脱液，干燥，即得。
【含量测定】
照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录ⅥD)测定。
色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇—0.1％枸橼酸溶液，洗脱程序见表2；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；供试品溶液色谱中与各对照品对应的吸收峰的理论塔板数均不低于3000。
表2流动相梯度洗脱程序
对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，用甲醇制成对照品储备液。临用时稀释成每1mL中含3'-羟基葛根素0.02032mg、葛根素0.1676mg、大豆苷0.03424mg、毛蕊异黄酮苷0.008344mg、染料木苷0.005712mg、芒柄花苷0.006544mg、大豆苷元0.00776mg、毛蕊异黄酮0.011136mg、芒柄花素0.00664mg、染料木素0.00664mg的混合对照品溶液。
供试品溶液制备 取本品约100mg，精密称定，加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次(4×40ml)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述的组合物具有降血脂、保肝、减肥和降低同型半光氨酸的作用，能够有效用于肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症和高同型半胱氨酸血症的治疗，产生显著的效果。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明组合物制备工艺科学先进、有效成分明确、疗效稳定、质量可控，能够有效用于肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症和高同型半胱氨酸血症的治疗。
附图说明
图1为黄芪甲苷对照品高效液相色谱检测图谱。
图2为黄芪提取物高效液相色谱检测图谱。
图3为其他黄酮类成分对照品高效液相色谱检测图谱，其中，1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊异黄酮；4.芒柄花素。
图4为黄芪提取物高效液相色谱检测图谱。
图5为葛根素对照品高效液相色谱检测图谱。
图6为葛根提取物高效液相色谱检测图谱。
图7为桑根酮C对照品高效液相色谱检测图谱。
图8为桑根酮D对照品高效液相色谱检测图谱。
图9为桑辛素对照品高效液相色谱检测图谱。
图10为桑白皮提取物高效液相色谱检测图谱。
图11为黄芪-葛根提取物对照品高效液相色谱检测图谱，其中，1.3'-羟基葛根素；2.葛根素；3.大豆苷；4.毛蕊异黄酮苷；5.染料木苷；6.芒柄花苷；7.大豆苷元；8.毛蕊异黄酮；9.染料木素；10.芒柄花素。
图12为黄芪-葛根提取物高效液相色谱检测图谱。
图13为AB-8大孔树脂吸附黄芪总皂苷梯度洗脱曲线，其中1～6号水洗脱液；7～10号10％乙醇洗脱液；11～14号30％乙醇洗脱液；15～18号50％乙醇洗脱液；19～22号70％乙醇洗脱液；23～26号95％乙醇洗脱液。
图14为AB-8大孔树脂吸附总黄酮梯度洗脱曲线，其中，1～6号水洗脱液；7～10号10％乙醇洗脱液；11～14号30％乙醇洗脱液；15～18号50％乙醇洗脱液；19～22号70％乙醇洗脱液；23～26号95％乙醇洗脱液。
图15为XDA-5、D101、AB-8和LX-18四种树脂对黄芪-葛根提取液有效部位吸附动力学曲线。
图16为不同浓度乙醇洗脱黄芪-葛根提取液有效部位试验结果。
图17为造模期正常组与模型组大鼠体重和糖脂变化对比图，其中，与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
图18为黄芪散分别提取合并物与共提物治疗给药14周糖脂水平变化对比图，其中，与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图19为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠FINS水平的影响对比图，其中，与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。
图20为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠肝脏TC、TG的影响对比图，其中，与正常组相比，###P<0.001；与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001。
图21为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠肝组织Hcy、GGT1的影响对比图，其中，与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图22为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠肝脏指数的影响对比图，其中，与正常组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.01。
图23为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠脂体比(附睾脂肪肾周脂肪系数)的影响对比图，其中，与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图24为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对肥胖大鼠白色脂肪棕色化相关基因PRDM16和CIDEA表达的影响对比图，其中，与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。
图25为黄芪散分别提取合并物与共提物给药对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响对比图。
图26为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对棕色脂肪标志基因UCP1表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图27为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对棕色脂肪产热相关基因PGC1α和PGC1β表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图28为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对脂肪酸氧化相关基因CPT1a和PPARα表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图29为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对米色脂肪标志基因CD137表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图30为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对线粒体合成关键酶基因NRF1和NRF2表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图31为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后黄芪散分别提取合并物与共提物给药对线粒体合成关键酶基因Tfam表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，**P<0.01。
图32为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞过程中黄芪散分别提取合并物与共提物给药对棕色脂肪标志基因UCP1以及棕色脂肪产热相关基因PGC1α和PGC1β表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图33为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞过程中黄芪散分别提取合并物与共提物给药对脂肪酸氧化相关基因CPT1a和PPARα表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图34为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞过程中黄芪散分别提取合并物与共提物给药对米色脂肪标志基因CD137表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
图35为3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞过程中黄芪散分别提取合并物与共提物给药对线粒体合成关键酶基因NRF1、NRF2和Tfam表达的影响对比图，其中，与成熟脂肪细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为1:1:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1a)黄芪提取物制备：A、将黄芪药材粉碎，以6BV体积分数为60％的乙醇回流提取1次，每次0.5h，提取温度为60℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.150g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以15BV的水，8BV体积分数为0.05％的NaOH溶液和8BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，最后以15BV体积分数为30％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物，备用；
(2a)葛根提取物制备：A、将葛根药材粉碎，以6BV体积分数为60％的乙醇回流提取1次，每次0.5h，提取温度为70℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.05g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以15BV的水进行洗脱，洗脱流速为1mL/min；再以15BV的体积分数为30％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物，备用；
(3a)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.8h，然后以6BV体积分数为60％的乙醇回流提取1次，每次1.8h，提取温度为60℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45℃下，于4BV体积分数为60％乙醇溶液中浸泡12h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用6BV体积分数为70％的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(4a)按比例称取步骤(1a)获得的黄芪提取物、步骤(2a)获得的葛根提取物和步骤(3a)中获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例2
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为2:2:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1a)黄芪提取物制备：A、将黄芪药材粉碎，以14BV体积分数为65％的乙醇回流提取3次，每次2.5h，提取温度为100℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.300/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以20BV的水，12BV体积分数为0.3％的NaOH溶液和12BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为3mL/min，最后以20BV体积分数为50％的乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物，备用；
(2a)葛根提取物制备：A、将葛根药材粉碎，以14BV体积分数为80％的乙醇回流提取3次，每次2.5h，提取温度为90℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以20BV的水进行洗脱，洗脱流速为3mL/min；再以20BV的体积分数为45％的乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物，备用；
(3a)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡4h，然后以10BV体积分数为80％的乙醇回流提取3次，每次2h，提取温度为90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在48℃下，于8BV体积分数为80％乙醇溶液中浸泡24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用8BV体积分数为90％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(4a)按比例称取步骤(1a)获得的黄芪提取物、步骤(2a)获得的葛根提取物和步骤(3a)中获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例3
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为1:2:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1a)黄芪提取物制备：A、将黄芪药材粉碎，以8BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.075g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以10BV的水，10BV体积分数为0.5％的NaOH溶液和10BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，最后以10BV体积分数为70％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物，备用；
(2a)葛根提取物制备：A、将葛根药材粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.1g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10BV的水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min；再以10BV的体积分数为50％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物，备用；
(3a)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃，合并提取液；或将桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.120g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用7BV体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(4a)按比例称取步骤(1a)获得的黄芪提取物、步骤(2a)获得的葛根提取物和步骤(3a)中获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例4
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为2:1，所述黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1b)黄芪-葛根提取物制备：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以6BV体积分数为60％的乙醇溶液回流提取1次，每次0.5h，提取温度为70℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.3g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1BV/h；再以4BV的体积分数为30％的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物，备用；
(2b)桑白皮提取物制备：同实施例1中桑白皮提取物的制备方法；
(3b)按比例称取步骤(1b)获得的黄芪-葛根提取物和步骤(2b)获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例5
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为5:1，所述黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1b)黄芪-葛根提取物制备：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以14BV体积分数为65％的乙醇溶液回流提取2次，每次2.5h，提取温度为90℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.4g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10BV的水进行洗脱，洗脱流速为3BV/h；再以12BV的体积分数为50％的乙醇溶液以3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物，备用；
(2b)桑白皮提取物制备：同实施例2中桑白皮提取物的制备方法；
(3b)按比例称取步骤(1b)获得的黄芪-葛根提取物和步骤(2b)获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例6
本发明组合物的一种实施例，包含黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为1:2，所述黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1。
组合物的制备方法包括如下步骤：
(1b)黄芪-葛根提取物制备：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，提取温度为80℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为2BV/h；再以10BV的体积分数为70％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物，备用；
(2b)桑白皮提取物制备：同实施例3中桑白皮提取物的制备方法；
(3b)按比例称取步骤(1b)获得的黄芪-葛根提取物和步骤(2b)获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
实施例7
本实施例对实施例1～6所制备得到的黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物以及黄芪-葛根提取物中有效成分含量利用高效液相色谱法进行测定。
一、黄芪提取物有效成分含量检测(以实施例3中黄芪提取物为例)
(1)黄芪甲苷照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录VI D)进行含量测定
色谱条件及系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35:65)为流动相；蒸发光散射检测器；理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不得低于4000；对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取本品约100mg，精密称定，加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次(4×40ml)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
黄芪甲苷对照品检测图谱如图1所示，黄芪提取物中黄芪甲苷检测图谱如图2所示。
(2)其他黄酮类成分照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录VI D)进行含量测定。
色谱条件与系统适用性条件：色谱柱为Kromasil 100-5C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈(A)和0.2％甲酸(B)，梯度洗脱，0～20min,20％～40％A，20～40min，40～40％A。流速为1.0mL·min-1，进样量10μL，检测波长为260nm，柱温40℃；对照品溶液的制备：分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷6.32mg、毛蕊异黄酮2.36mg、芒柄花素2.46mg、芒柄花苷4.62mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，再分别精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.0632mg·L-1、0.0236mg·L-1、0.0246mg·L-1、0.0462mg·L-1的混标溶液；供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约lg，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
其他黄酮类成分对照品检测图谱如图3所示，黄芪提取物中其他黄酮类成分检测图谱如图4所示。
黄芪提取物中各有效成分测定的分析结果如表3所示：
表3实施例3中黄芪提取物高效液相色谱检测结果分析
由表3可知，本发明制备方法得到的黄芪提取物中黄芪甲苷含量为19.5％，大于2.8％；5种有效成分的总含量占提取物的50.44％。采用相同的检测方法对实施例1～2所制备得到的黄芪提取物进行有效成分含量进行检测，结果与实施例3相似，相关的实验数据省略。
二、葛根提取物有效成分含量检测(以实施例3中葛根提取物为例)
照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录Ⅵ D)测定
色谱条件及系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(28:72)为流动相；检测波长为250nm，理论塔板数按葛根素峰计算不得低于4000；对照品溶液的制备：精密称取葛根素对照品5mg，置25mL容量瓶中，加30％乙醇至刻度，摇匀，即得0.2mg/mL对照品储备液；供试品溶液的制备：取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加30％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
葛根素对照品检测图谱如图5所示，葛根提取物中有效成分检测图谱如图6所示。
葛根提取物中各有效成分测定的分析结果如表4所示：
表4实施例3中黄芪提取物高效液相色谱检测结果分析
由表4可知，本发明制备方法得到的葛根提取物中，葛根素的含量为28.2％，大于15％；本发明有效成分以葛根素计为51.02％，大于50％。采用相同的检测方法对实施例1～2所制备得到的葛根提取物进行有效成分含量进行检测，结果与实施例3相似，相关的实验数据省略。
三、桑白皮提取物有效成分含量检测(以实施例3中桑白皮提取物为例)
照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录ⅥD)测定
色谱条件及系统适应性试验：色谱柱：Dikma Techonlogies(迪马Diamonsil C185μm，200×4.6mm)；流动相：乙腈—0.1％乙酸水，流动相洗脱程序见表1；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；对照品溶液的制备：取桑根酮C、D和桑辛素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，并分别稀释成每1mL溶液含0.037mg桑根酮C、每1mL溶液含0.0216mg桑根酮D的对照品溶液和每1mL溶液含0.0466mg的桑辛素对照品溶液；供试品溶液的制备：取本品约15.2mg，加10mL的甲醇进行定溶，摇匀，称定重量，超声40min，放冷后用甲醇补足失去的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
桑根酮C、D和桑辛素对照品检测图谱分别如图7、图8和图9所示，桑白皮提取物中有效成分检测图谱如图10所示。
桑白皮提取物中各有效成分测定的分析结果如表5所示：
表5实施例3中桑白皮提取物高效液相色谱检测结果分析
| 有效成分 | 桑根酮C | 桑根酮D | 桑辛素 |
| 含量(％) | 9.26 | 11.8 | 30.4 |
由表5可知，本发明制备方法得到的桑白皮提取物中，桑根酮C的含量为9.26％、大于6.4％；桑根酮D的含量为11.8％，大于3.4％；桑白皮提取物中异戊烯基类黄酮总含量为51.46％，大于50％。采用相同的检测方法对实施例1～2所制备得到的桑白皮提取物进行有效成分含量进行检测，结果与实施例3相似，相关的实验数据省略。
四、黄芪-葛根提取物有效成分含量检测(以实施例6中黄芪-葛根提取物为例)
照高效液相色谱法(中国药典2005年版Ⅰ部，附录ⅥD)测定。
色谱条件及系统适应性试验：色谱柱：Kromasil 100-5 C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇—0.1％枸橼酸溶液(流动相梯度洗脱程序见表2)；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；供试品溶液色谱中与各对照品对应的吸收峰的理论塔板数均不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，用甲醇制成对照品储备液。临用时稀释成每1mL中含3'-羟基葛根素0.02032mg、葛根素0.1676mg、大豆苷0.03424mg、毛蕊异黄酮苷0.008344mg、染料木苷0.005712mg、芒柄花苷0.006544mg、大豆苷元0.00776mg、毛蕊异黄酮0.011136mg、芒柄花素0.00664mg、染料木素0.00664mg的混合对照品溶液；供试品溶液制备：取本品约100mg，精密称定，加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次(4×40ml)，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml量瓶中，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
混合对照品检测图谱分别如图11所示，黄芪-葛根提取物中有效成分检测图谱如图12所示。
黄芪-葛根提取物中各有效成分测定的分析结果如表6所示：
表6实施例6中黄芪-葛根提取物高效液相色谱检测结果分析
| 有效成分 | 含量(％) |
| 3'-羟基葛根素 | 4.087 |
| 葛根素 | 28.92 |
| 大豆苷 | 3.49 |
| 毛蕊异黄酮苷 | 0.984 |
| 染料木苷 | 4.71 |
| 芒柄花苷 | 12.4 |
| 大豆苷元 | 5.91 |
| 毛蕊异黄酮 | 0.688 |
| 染料木素 | 0.603 |
| 芒柄花素 | 2.51 |
由表6可知，本发明制备方法得到的黄芪-葛根提取物中，葛根素的含量为28.92％，大于15％；采用相同的检测方法对实施例4～5所制备得到的黄芪-葛根提取物进行有效成分含量进行检测，结果与实施例6相似，相关的实验数据省略。
实施例8
本实施例对黄芪药材和葛根药材的提取工艺进行考察，分析相关提取条件对提取效果的影响，提取效果主要采用以下参数进行评价：
(1)黄芪提取效果评价参数：
(1)总皂苷转移率
(2)总皂苷纯度
精密称取黄芪饮片颗粒2.5g，按相关条件提取后，提取液用相应提取溶剂定容至100ml，精密移取10ml，回收至干。加水10ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液回收至干，用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.3ml溶液于具塞磨口试管中，水浴加热挥去溶剂，加入0.2ml 5％香草醛冰醋酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，摇匀，密塞，于70℃水浴恒温加热15min，取出后立即冰浴5min，加冰醋酸5.0ml，摇匀，即得。以随行试剂为空白，于535nm波长下测定紫外吸光度值。另精密吸取50ml置干燥至恒重的蒸发皿中，按(中国药典2005年版Ⅰ部，附录X A)转移物的干燥方法操作，计算总皂苷转移率及总皂苷纯度。
(2)葛根提取效果评价参数：
(1)总黄酮转移率
(2)总黄酮纯度
精密称取葛根饮片颗粒2.5g，按相关条件提取后，提取液用相应溶剂定容至100ml，精密吸取0.2ml至10ml量瓶中，定容，摇匀，于250nm波长处测定吸光度。另精密吸取50ml置干燥至恒重的蒸发皿中，按(中国药典2005年版Ⅰ部，附录X A)浸出物的干燥方法操作，计算总黄酮浸出率及总黄酮纯度。
一、乙醇体积分数对提取效果的影响
(1)乙醇体积分数(以下简称浓度)设置
为研究乙醇浓度对提取效果的影响，在乙醇回流提取中分别使用浓度为30％、60％、70％、80％和95％的乙醇，其他提取实验步骤与实施例3中黄芪提取物和葛根提取物制备方法相同。
(2)提取结果
①黄芪提取结果如表7所示：
表7乙醇浓度对黄芪提取效果的影响
由表7可知，在30～60％的浓度范围内总皂苷转移率与乙醇浓度成正比，乙醇浓度为70％时总皂苷转移率增至最大，其后则下降。由于高浓度的乙醇溶液对脂类物质有一定的溶解性质，不同溶质的增加，降低了乙醇对皂苷类物质的溶解度。此外，又因操作上60％以下的乙醇提取存在过滤困难，纯度低的问题，综合考虑，选用60％-70％乙醇为提取溶剂，其中以浓度为70％的乙醇提取效果最优。
②葛根提取结果如表8所示：
表8乙醇浓度对葛根提取效果的影响
由表8可知，在30～60％的浓度范围内总黄酮转移率与乙醇浓度成正比，乙醇浓度为60％时总黄酮转移率增至最大，其后则下降。由于高浓度的乙醇溶液对脂类物质有一定的溶解性质，不同溶质的增加，降低了乙醇对黄酮类物质的溶解度。此外，又因操作上浓度为60％以下的乙醇提取存在过滤困难，得率低的问题，综合考虑，选用浓度为60％-80％乙醇为提取溶剂，其中以浓度为70％的乙醇提取效果最优。
二、溶媒倍量对提取效果的影响
(1)溶媒倍量的设置
为研究溶媒倍量对提取效果的影响，在乙醇回流提取中分别使用6BV、8BV、10BV、12BV和14BV的乙醇，其他提取实验步骤与实施例3中黄芪提取物和葛根提取物制备方法相同。
(2)提取结果
①黄芪提取结果如表9所示：
表9溶媒倍量对黄芪提取效果的影响
由表9可知，溶剂用量越大转移率越高，当溶媒倍量大于等于8BV时，总皂苷转移率增至最大，基本趋于稳定，有效成分基本溶出，但纯度下降，因此，选择8BV为最优提取溶媒倍量。
②葛根提取结果如表10所示：
表10溶媒倍量对葛根提取效果的影响
由表10可知，溶剂用量越大浸出率越高，当溶媒倍量大于等于10BV时，总黄酮浸出率增至最大，基本趋于稳定，有效成分基本溶出，但纯度下降，因此，选择10BV为最优提取溶媒倍量。
三、提取时间对提取效果的影响
(1)提取时间的设置
为研究提取时间对提取效果的影响，乙醇回流提取的时间设置为0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h，其他提取实验步骤与实施例3中黄芪提取物和葛根提取物制备方法相同。
(2)提取结果
①黄芪提取结果如表11所示：
表11提取时间对黄芪提取效果的影响
由表11可知，时间过短不利于皂苷的溶出。当提取时间大于等于2h时，曲线基本趋于稳定，以后随时间延长，总皂苷转移率变化不大。因此，选择2h为最佳提取时间。
②葛根提取结果如表12所示：
表12提取时间对葛根提取效果的影响
由表12可知，时间过短不利于黄酮的溶出。当提取时间大于等于2h时，曲线基本趋于稳定，以后随时间延长，黄酮类化合物转移率变化不大。因此，选择2h为最佳提取时间。
四、提取次数对提取效果的影响
(1)提取次数的设置
为研究提取次数对提取效果的影响，乙醇回流提取的次数设置为1次、2次和3次，其他提取实验步骤与实施例3中黄芪提取物和葛根提取物制备方法相同。
(2)提取结果
①黄芪提取结果如表13所示：
表13提取次数对黄芪提取效果的影响
由表13可知，当提取2次后，总皂苷转移率已接近最大值，再增加提取次数，总皂苷转移率没有增加，因此，选择最优提取次数为2次。
②葛根提取结果如表14所示：
表14提取次数对葛根提取效果的影响
由表14可知，当提取2次后，总黄酮转移率已接近最大值，再增加提取次数，总黄酮转移率没有增加，因此，选择最优提取次数为2次。
五、提取温度对提取效果的影响
(1)提取温度的设置
为研究提取温度对提取效果的影响，乙醇回流提取的温度设置为60℃、70℃、80℃、90℃和100℃，其他提取实验步骤与实施例3中黄芪提取物和葛根提取物制备方法相同。
(2)提取结果
①黄芪提取结果如表15所示：
表15提取温度对黄芪提取效果的影响
由表15可知，温度越高，总皂苷转移率增加越多，但纯度下降，考虑到总皂苷的提取率的完全，选择80℃作为最优提取温度。
②葛根提取结果如表16所示：
表16提取温度对葛根提取效果的影响
由表16可知，温度越高，总黄酮浸出率增加越多，但纯度下降，考虑到总黄酮的提取率的完全，选择70℃～90℃作为提取温度，其中以80℃最为最优提取温度。
实施例9
本实施例对黄芪药材和葛根药材的大孔树脂纯化工艺进行考察，分析相关纯化条件对纯化效果的影响。
待纯化的黄芪提取液的制备方法为：精密称取黄芪饮片颗粒200g，按实施例3的提取工艺进行提取，滤过，合并提取液，回收乙醇至无醇味。加1倍量水混悬，滤液另保存，备用。提取液中黄芪总皂苷含量和纯度的测定方法同实施例8。
待纯化的葛根提取液的制备方法为：精密称取葛根饮片颗粒200g，按实施例3的提取工艺进行提取，滤过，合并提取液，回收乙醇至无醇味。加1倍量水混悬，滤液另保存，备用。提取液中葛根总黄酮含量和纯度的测定方法同实施例8。
一、不同树脂类型的静态吸附量-洗脱性能实验
(1)树脂类型的设置
①黄芪提取液静态吸附量-洗脱性能实验：为研究不同树脂类型对黄芪提取液纯化效果的影响，纯化的大孔树脂类型设置为D101、LX-18、LSA-7、LSA-40、AB-8、XDA-5、XDA-1和HP-20。
②葛根提取液静态吸附量-洗脱性能实验：为研究不同树脂类型对葛根提取液纯化效果的影响，纯化的大孔树脂类型设置为D101、LX-18、LSA-7、LSA-40、AB-8、XDA-1和HP-20。
精密称取已处理好的各种型号树脂适量(约相当于干树脂2.0g)，置100ml锥形瓶中，精密加入黄芪样品液20ml(含总皂苷69.06mg)或葛根样品液20ml(含总黄酮120.6mg)，每隔10min振摇20s，持续2h，然后静置24h，使其达到饱和吸附，滤过，滤液精密定容至适当体积，测定总皂苷或总黄酮含量。将过滤后的树脂另置100ml锥形瓶中，精密加入70％乙醇40ml，每隔10min振摇20s，持续2h，然后静置24h，滤过，滤液定容，稀释后测定总皂苷或总黄酮的含量。
(2)实验结果
①黄芪提取液静态吸附量-洗脱性能实验结果如表17所示：
表17 8种大孔树脂的静态饱和吸附率和洗脱率结果
表中，吸附容量＝(样品液总皂苷量-未吸附量)/干树脂重(mg/g干树脂)；饱和吸附率(％)＝(样品液总皂苷量-未吸附量)/样品液总皂苷量×100％；洗脱率(％)＝解吸附量/(样品液总皂苷量-未吸附量)×100％。
由表17可知，上述8种类型的大孔树脂均对黄芪总皂苷均具有一定的吸附-洗脱能力，其中AB-8树脂对黄芪总皂苷的吸附率和洗脱率均明显优于其他树脂。
②葛根提取液静态吸附量-洗脱性能实验结果如表18所示：
表18 7种大孔树脂的静态饱和吸附率和洗脱率结果
表中，吸附容量＝(样品液总黄酮量-未吸附量)/干树脂重(mg/g干树脂)；饱和吸附率(％)＝(样品液总黄酮量-未吸附量)/样品液总黄酮量×100％；洗脱率(％)＝解吸附量/(样品液总黄酮量-未吸附量)×100％
由表18可知，上述7种类型的大孔树脂均对葛根总黄酮均具有一定的吸附-洗脱能力，其中AB-8树脂对葛根总黄酮的吸附率和洗脱率均明显优于其他树脂。
二、洗脱剂浓度对纯化效果的影响
(1)洗脱剂浓度的设置
精密称取处理好的AB-8型树脂(相当于干树脂约5.0g)，精密吸取黄芪样品液或葛根样品液60ml上柱，流速控制在1ml/min，吸附完全后，依次用蒸馏水200ml、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇各100ml梯度洗脱。蒸馏水洗脱液先收集50ml 2份，25ml 4份，10％乙醇，30％乙醇，50％乙醇，70％，95％乙醇分别收集25ml 4份。
(2)纯化结果
①黄芪纯化结果如图13所示，由图13可知，黄芪总皂苷主要集中在30％、50％和70％乙醇洗脱液中，约占全部醇洗脱液中总皂苷含量的90.0％。在实验过程中发现洗脱剂乙醇浓度越高，洗脱液中醇溶性杂质就越多，皂苷粗品中黄芪总皂苷的纯度就偏低，所以确定最优洗脱条件为先用蒸馏水洗去水溶性杂质(糖，蛋白质等)，洗至还原糖反应呈阴性，再用70％乙醇洗脱总皂苷，收集70％乙醇洗脱部分。
②葛根纯化结果如图14所示，由图14可知，葛根总黄酮主要集中在30％、50％乙醇洗脱液中，约占全部醇洗脱液中总黄酮含量的75.0％。在实验过程中发现洗脱剂乙醇浓度越高，洗脱液中醇溶性杂质就越多，黄酮粗品中葛根总黄酮的纯度就偏低，所以确定最优洗脱条件为先用蒸馏水洗去水溶性杂质(糖，蛋白质等)，洗至还原糖反应呈阴性，再用50％乙醇洗脱总黄酮，收集50％乙醇洗脱部分。
三、洗脱溶媒及洗脱用水体积对纯化效果的影响
(1)洗脱溶媒及洗脱用水体积的设置
称取处理好的AB-8型树脂(相当于干树脂5.0g)，湿法装柱，精密吸取黄芪样品液或葛根样品液60ml，以1ml/min流速上柱。吸附完全后，收集过柱液，分别以100ml、150ml、200ml蒸馏水洗脱，然后黄芪样品液分别用70％乙醇200ml(100ml、50ml、50ml)依次洗脱，流速控制在2ml/min，按100ml、50ml、50ml分3份收集；葛根样品液分别用50％乙醇200ml(100ml、50ml、50ml)依次洗脱。流速控制在2ml/min，按100ml、50ml、50ml分3份收集。
(2)纯化结果
①黄芪提取液纯化结果如表19所示：
表19洗脱溶媒及洗脱用水体积的纯化结果
由表19可知，洗脱用水量对总皂苷纯度无明显影响，考虑经济原因，用水量最优可选择100ml。醇洗脱部分中总皂苷主要集中在前100ml，占总醇洗脱部分的93％以上，因此确定最优洗脱用醇量为100ml(相当于树脂体积10BV)，已能将总皂苷基本洗脱完全。
②葛根提取液纯化结果如表20所示：
表20洗脱溶媒及洗脱用水体积的纯化结果
由表20可知，洗脱用水量对总黄酮纯度无明显影响，考虑经济原因，用水量最优可选择100ml。醇洗脱部分中总黄酮主要集中在前100ml，占总醇洗脱部分的93％以上，因此确定最优洗脱用醇量为100ml(相当于树脂体积10BV)，已能将总黄酮基本洗脱完全。。
四、样品液浓度及洗脱流速对纯化效果的影响
(1)样品液浓度及洗脱流速的设置
称取处理好的型大孔树脂(相当于干树脂5.0g)，湿法装柱，黄芪提取液准备0.075g/ml，0.150g/ml，0.300g/ml 3种浓度的样品液，各2份(相当于生药3.0g，均含总皂苷52.07mg)上柱；葛根提取液准备0.05g/ml，0.10g/ml，0.20g/ml 3种浓度的样品液，各2份(相当于生药2.0g，均含总黄酮120.6mg)上柱。待完全吸附后，样品液浓度相同的树脂柱按2种流速(1ml/min、3ml/min)进行洗脱，用100mL蒸馏水洗脱后，用100mL 50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部分。
(2)纯化结果
①黄芪提取液纯化结果如表21所示：
表21样品液浓度及洗脱流速的纯化结果
由表21可知，在样品液中总皂苷含量固定的情况下，改变样品液浓度，对总皂苷转移率和纯度有一定的影响，样品液浓度在0.075～0.300g/ml之间可实现纯化，最优样品液浓度为0.075g/ml；改变洗脱速度，对总皂苷的转移率和纯度无明显影响，流速为1～3ml/min均可。
②葛根提取液纯化结果如表22所示：
表22样品液浓度及洗脱流速的纯化结果
由表22可知，在样品液中总黄酮含量固定的情况下，改变样品液浓度，对总黄酮转移率和纯度有一定的影响，样品液浓度在0.05～0.20g/ml之间可实现纯化，最优样品液浓度为0.10g/ml；改变洗脱速度，对总黄酮的转移率和纯度无明显影响，流速为1～3ml/min即可。
实施例10
本实施例对黄芪-葛根提取液的大孔树脂纯化工艺进行考察，分析相关纯化条件对纯化效果的影响。
待纯化的黄芪-葛根提取液的制备方法为：按比例称取黄芪、葛根饮片颗粒共100g，按实施例6的提取工艺进行提取，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无液滴出现，用水转移并定容于1000mL量瓶中，摇匀，滤过，备用。提取液中总皂苷和总黄酮含量和纯度的测定方法同实施例8。
一、不同树脂类型的吸附及解析性能实验
(1)树脂类型的设置
为研究不同树脂类型对黄芪-葛根提取液纯化效果的影响，纯化的大孔树脂类型设置为D101、AB-8、XAD-7HP、HP-20、SP825、LSA-40、LX-18、XDA-5和ADS-7。
精密称取已预处理并抽滤的大孔吸附树脂各10g，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL供试品溶液，振荡(温度：37℃，频率：80次/min)24小时，分别上柱(1.0×20cm)洗脱，先以100mL纯水洗脱，弃去水洗脱液，再以70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液100mL。
(2)实验结果
黄芪-葛根提取液总黄酮和总皂苷吸附及解析性能实验结果如表23所示：
表23 9种树脂的吸附及解析性能实验结果
由表23可知，XDA-5、D101、AB-8和LX-18四种型号大孔吸附树脂对黄芪-葛根提取液总黄酮和总皂苷的吸附率和解析率均较高。
二、吸附动力学曲线绘制
为进一步考察XDA-5、D101、AB-8和LX-18四种型号大孔吸附树脂的效果，进行了吸附动力学曲线的绘制。
(1)实验方法
精密称取预处理并抽滤至干的上述大孔吸附树脂各10g，置具塞锥形瓶中，精密加入黄芪-葛根提取液50mL，振荡(温度：37℃，频率：80r/min)吸附，于0.25、0.5、1.5、4.5及20h取样，分别测定吸附液中总黄酮和总皂苷的含量，计算比吸附量。以比吸附量为纵坐标，吸附时间为横坐标，绘制吸附动力学曲线。
(2)实验结果
XDA-5、D101、AB-8和LX-18四种型号大孔吸附树脂的吸附动力学曲线如图15所示，由图可知，从树脂对有效部位的吸附量和吸附速率以及达到吸附平衡所需时间综合分析，较优的树脂为LX-18型。
三、吸附速度对吸附效率的影响
(1)吸附速率设置
为考察上样吸附速度对树脂吸附效率的影响，设置了3种吸附速率：1BV/h、2BV/h和3BV/h。分别取黄芪-葛根提取液100mL，3份，以不同速度通过25mL大孔吸附树脂柱，先以4BV的水洗脱，继以4BV的70％乙醇解析，收集乙醇解析液，分别测定解吸液中总黄酮和总皂苷的含量，计算解析率。
(2)实验结果
不同上样吸附速度对吸附速率的影响结果如表24所示：
表24 3种上样吸附速度对有效部位解析率的测定结果
由表24可知，吸附速度过快时，吸附效率低，损失较大。从生产实际出发，选择上样吸附速度1～2BV/h。
四、水洗脱用量对纯化效果的影响
大孔吸附树脂柱吸附完成后，用水以2BV/h的速度洗脱，每1BV收集1份洗脱液，以molisch反应检测水洗脱液的糖类化合物。结果显示(结果省略)，水洗脱用量为4BV即可。
五、洗脱剂乙醇浓度及用量对纯化效果的影响
(1)实验方法
大孔吸附树脂柱吸附完成后，先用4BV的水以2BV/h的速度洗脱，然后分别以4BV30％、50％及70％乙醇解析，分别测定解吸液中总黄酮和总皂苷的含量，计算解吸率。
(2)实验结果
结果如图16所示，三种浓度梯度乙醇洗脱时总黄酮解析率近90％，总皂苷解析率近70％。因此，确认乙醇洗脱浓度为30～70％，考虑生产实际情况，吸附平衡水洗脱后直接以70％乙醇洗脱。
实施例11
本实施例以实施例3和实施例6组合物为例，研究分析本发明组合物在治疗肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症或高同型半胱氨酸血症中的应用效果。
一、动物分组、造模及给药
本实验包括黄芪散(HQS)预防给药和治疗给药两部分。健康雄性SD大鼠适应性饲养一周后，随机分为正常组和造模组，正常组采用基础饲料喂养，造模组采用高脂饲料喂养，自由饮水和进食，同时选取12只造模组大鼠为模型组(HFD)。其中，黄芪散共提物的给药剂量为1.2g/kg、2.4g/kg，分别作为低、高剂量组。黄芪散共提物的制备方法：按1:2:1的比例称取黄芪、葛根和桑白皮药材，粉碎后以60％乙醇加热回流提取2次，每次1.5h。合并提取液浓缩，通过PIPO-OO树脂、HPD-500树脂大孔树脂及732离子交换树脂的三节高压串联树脂。先用水洗脱三节串联树脂，再分别用40％、70％的乙醇洗脱两节串联的大孔树脂，氨水洗脱732树脂，收集洗脱液，浓缩，干燥得黄芪散提取物浸膏。黄芪散治疗给药：将造模组大鼠连续高脂喂养7周后诱导肥胖大鼠模型，筛选40只随机分为HQS-L低剂量组(1.2g/kg.d)、HQS-H高剂量组(2.4g/kg.d)、立普妥阳性药组(Lipitor，2mg/kg)，黄芪散1+2+1组合物(实施例3)(2.4g/kg.d)、黄芪散1:2+1组合物(实施例6)(2.4g/kg.d)，每组8只，高脂喂养7周后再开始给药，连续给药15周。正常组和模型组大鼠分别给予等量的生理盐水，各给药组给予相应受试药物，每日一次。
二、检测指标和方法
(1)体重和饮食量
实验过程中每天观察各组大鼠体重变化、进食、皮毛、活动、有无死亡等情况，并每周记录两次体重和摄食量。
(2)糖脂生化指标
预防给药：于给药7周末及给药12周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底静脉丛取血，肝素抗凝，4℃离心(3000r/min，15min)分取血浆，测定空腹血糖(FPG)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)；
治疗给药：于给药9周末及给药14周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底静脉丛取血，肝素抗凝，4℃离心(3000r/min，15min)分取血浆，测定FPG、TC、TG、LDL-C。
(3)胰岛素(FINS)水平的测定
预防给药：于给药12周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底静脉丛取血，肝素抗凝，4℃离心(3000r/min，15min)分取血浆，测定FINS水平；
治疗给药：于给药14周末，大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉，眼底静脉丛取血，肝素抗凝，4℃离心(3000r/min，15min)分取血浆，测定FINS水平。
(4)葡萄糖耐量试验(OGTT)
预防给药：在给药10周末，各组大鼠禁食不禁水12h后，给予大鼠灌胃50％葡萄糖溶液(1.5g/kg)后0min、20min、60min、90min、120min，尾静脉取血，用罗氏血糖仪配合血糖试纸快速检测各时间点的血糖值，并计算血糖曲线下面积(AUC)，计算方法：AUC＝[1/4×0min(mmol/L)+1/2×20min(mmol/L)+3/4×60min(mmol/L)+120min(mmol/L)]。
(5)样本取材及脂体比的测定
实验结束时，各组大鼠称重，并用10％水合氯醛腹腔注射(0.35ml/100g体重)，将大鼠麻醉，大鼠麻醉后仰卧固定于解剖板上，进行腹主动脉取血处死，所获血标本一部分静置2h后3000r/min离心30min得血清，一部分为全血，并分装置于-80℃冰箱备用。迅速取出心、肝、脾、肺、肾、附睾脂肪组织、肾周脂肪组织、棕色脂肪组织等脏器组织，称重，分装，一部分放置冻存管-80℃冷冻保存；一部分放置预先装有RNA保存液的冻存管中，先于4℃冷藏一夜后再转入-80℃冰箱中保存；同时计算各脂体比，脂体比＝附睾脂肪(肾周脂肪)量/体重×100％。
(6)肝脏脂质(TC、TG)水平的测定
从-80℃冷藏冰箱里取一管肝脏组织。检测时取组织约100mg，加入异丙醇，体积1ml/100mg。匀浆后放置过夜。第二天离心后取上清，测定其中TC和TG含量，测得的结果换算为每千克脏器中含有的脂质含量以g计，结果换算成g/kg。分子量：甘油三酯639g/mol，总胆固醇386.65g/mol。
(7)肝脏同型半胱氨酸(Hcy)、γ-谷氨酰转肽酶1(GGT1)水平的测定
从-80℃冷藏冰箱里取一管肝脏组织。检测时取组织约100mg，用PBS洗去血污。剪成小块放入组织研磨器中，加入1ml PBS，制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于4℃5000g离心5min取上清，取适量上清液立即实验。Hcy、GGT1的测定采用ELISA法。
(8)PRDM16和CIDEA基因表达水平的测定
利用TRIzol提取组织中总RNA，制备cDNA进行RT-PCR。检测白色脂肪中PRDM16P和CIDEA基因的mRNA表达情况。
(9)统计方法
采用StatView软件进行统计学处理，数据用mean±SD表示，组间比较用方差分析(one-way ANOVA)中的Fisher's LSD，以P<0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism6.0软件制作统计图。
三、实验结果
(1)肥胖大鼠模型的建立
通过给连续7周的高脂饲料喂养，模型组大鼠体重明显高于正常组，如表25所示，此时模型组大鼠体重是正常组大鼠体重的20％。如图17所示，与正常组相比，模型组大鼠FPG、TC、TG、LDL-C水平也明显升高，提示此时肥胖模型成功。
表25造模期正常组与模型组大鼠体重变化(mean±SD)
注：与正常组相比，###P<0.001；增长体重＝(7周末模型组体重-7周末正常组体重)/7周末正常组体重×100％。
(2)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠体重的影响
模型组及各给药组大鼠初始体重明显高于正常组。由表26可知，与模型组相比，黄芪散治疗高低剂量组大鼠体重均显著性降低，且具有一定的剂量依赖性。立普妥组大鼠体重较模型组降低，但差异无统计学意义，表明立普妥对肥胖大鼠体重的控制不明显。上述结果说明黄芪散均可以较好地控制大鼠体重的增长，且明显优于立普妥。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠体重均显著性降低(P<0.001)，且优于黄芪散共提高低剂量组，说明本发明组合物降低小鼠体重的效果比黄芪散共提物更好。
表26黄芪散分别提取合并物与共提物对肥胖大鼠体重的影响(mean±SD)
注：与正常组相比，###P<0.001；与模型组相比，***P<0.001.
(3)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠糖脂生化指标的影响
如图18所示，与正常组相比，模型组大鼠的FPG、TC、TG、LDL-C水平均显著升高与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠的FPG、TC、TG、LDL-C水平均显著性降低，且优于黄芪散共提高低剂量组，说明本发明组合物降低糖脂的效果比黄芪散共提物更好。
(4)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠胰岛素FINS的影响
如图19所示，与正常组相比，模型组大鼠血浆中FINS水平显著升高，且具有统计学差异。与模型组相比，立普妥组和治疗组FINS水平均显著降低。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠的FINS水平均显著性降低，且优于黄芪散共提高低剂量组。提示黄芪散及立普妥均能降低胰岛素含量，可能具有改善胰岛素抵抗的作用，且本发明组合物改善胰岛素抵抗的效果比黄芪散共提物更好。
(5)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠肝脏脂质(TC、TG)的影响
如图20所示，与正常组相比，模型组大鼠肝组织中TC、TG水平明显升高。与模型组相比，黄芪散治疗给药组大鼠肝组织中TC、TG水平明显降低，且黄芪散降低幅度优于立普妥。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠肝组织中TC、TG水平均显著性降低，且优于黄芪散共提高低剂量组。以上结果提示黄芪散可显著控制肝脏脂质沉积，对非酒精性脂肪肝具有改善作用，且本发明组合物的改善效果比黄芪散共提物更好。
(6)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠肝组织Hcy、GGT1的影响
同型半胱氨酸(Hcy)、谷氨酰转肽酶(GGT1)已经是肝功能检查项目之一。如图21所示，与正常组相比，模型组大鼠肝组织中Hcy、GGT1水平显著升高。与模型组相比，黄芪散治疗给药组Hcy、GGT1水平显著降低。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠肝组织中Hcy、GGT1水平均显著性降低(P<0.001)，且优于黄芪散共提高低剂量组，说明本发明组合物降低肝组织中Hcy、GGT1水平的效果比黄芪散共提物更好。
(7)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠肝脏指数、脂体比的影响
正常组大鼠肝脏形态正常，色泽鲜红，重量和体积适中，质地柔软，表面光滑无颗粒。模型组大鼠的肝脏肿大，粉性，且颜色呈黄色，质地较脆，表面可见黄色脂肪颗粒，提示脂肪肝。而黄芪散给药组大鼠肝脏颜色鲜红，表面光滑，质地柔软，一定程度上可改善脂肪肝。通过计算肝脏指数发现，模型组肝脏指数显著升高，而黄芪散治疗组肝脏指数均显著降低。提示黄芪散具有改善脂肪肝的作用。且与模型组相比，黄芪散1+2+1组和黄芪散1:2+1组大鼠肝脏指数均显著性降低，且优于黄芪散共提高低剂量组(图22)，说明本发明组合物降低肝脏指数的效果比黄芪散共提物更好。
(8)黄芪散治疗性干预对肥胖大鼠脂体比的影响
人体内存在两种功能性差异的脂肪组织类型：白色脂肪组织和棕色脂肪组织，二者共同维持机体能量代谢的平衡。寒冷刺激、机体运动以及β3肾上腺素能受体(β3-AR)激动剂可将储存能量、导致肥胖的白色脂肪组织转变为消耗能量、减轻体重的棕色脂肪组织，即白色脂肪“棕色化”。因此，白色脂肪棕色化的提出为减肥和机制研究提供了新的视角。附睾脂肪和肾周脂肪是白色脂肪，是肥胖的重要体现。
通过计算脂体比发现，模型组附睾脂肪、肾周脂肪系数明显升高。与模型组相比，黄芪散治疗给药可显著降低肥胖大鼠附睾脂肪、肾周脂肪系数，提示黄芪散具有改善肥胖的作用。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠附睾脂肪、肾周脂肪系数均显著性降低，且优于黄芪散共提高低剂量组(图23)，说明本发明组合物降低脂体比的效果比黄芪散共提物更好。此外,与模型组相比，黄芪散治疗给药可显著提高肥胖大鼠棕色脂肪/附睾脂肪和棕色脂肪/肾周脂肪系数，说明黄芪散治疗给药可将肥胖大鼠体内的白色脂肪转化为棕色脂肪，从而降低大鼠体重。其中，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)将白色脂肪转化为棕色脂肪的效果明显优于黄芪散共提高低剂量组(表27)。
表27黄芪散对模型大鼠棕色脂肪含量的影响
计算公式：脏器体比＝[脏器重量(g)/体重(g)]*100，即每100g体重相当的脏器重量。
(9)黄芪散治疗性干预对白色脂肪棕色化相关基因表达的影响
大量研究已证明与白色脂肪细胞棕色化有关的作用靶点有PRDM16和CIDEA等，作为棕色脂肪的标志基因，在白色脂肪中高表达可激活棕色脂肪组织产热，诱导白色脂肪棕色化的发生。与模型组相比，黄芪散治疗给药可显著增加模型大鼠白色脂肪中PRDM16、CIDEA的表达水平，提示黄芪散具有诱导白色脂肪棕色化的作用。与模型组相比，黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)大鼠白色脂肪中PRDM16、CIDEA的表达水平均显著增高，且优于黄芪散共提高低剂量组(图24)，说明本发明组合物诱导白色脂肪棕色化的效果比黄芪散共提物更好。
实施例12
本实施例以实施例3和实施例6组合物为例，研究分析本发明组合物对3T3-L1前脂肪细胞增殖、棕色脂肪相关基因、米色脂肪标志基因和线粒体合成关键酶基因表达的影响。需要说明的是，本实施例附图中，黄芪散代表黄芪散共提组。
一、实验方法
1、细胞培养
将冻存的3T3-L1细胞从液氮罐或-80℃冰箱中取出，放入37℃水浴迅速溶解(1min内)，将细胞转至含10％NBCS的DMEM高糖培养基的离心管中，吹打后1000rpm 10min离心，弃去培养基，加入适量10％NBCS的DMEM高糖培养基吹打均匀，转至25cm2培养瓶。在37℃，5％CO2浓度的培养箱中培养，每隔2天换液，长到80％传代。
2、细胞增殖活性试验
选取处于指数生长期的3T3-L1细胞，用PBS缓冲液清洗1次，胰酶消化1min,用含10％NBCS的DMEM高糖培养基完全培养液终止消化，1000rpm 10min离心，弃去培养基，完全培养基吹打种96孔板，每孔5000个细胞，24h贴壁后，不同浓度的黄芪散给药24h、48h、72h，之后每孔加入10μl的CCK-8试剂，37℃避光孵育2-4小时，使用酶标仪在450nm测量吸光值。每组重复6个复孔，平行实验大于3次，测定黄芪散作用细胞24h、48h、72h对细胞的毒性。
黄芪散各母液的配置，精密称取6.4mg黄芪散提取物，取10μlDMSO溶解，再加10ml培养基，母液终浓度为640μg/ml，给药浓度为0、10、20、40、80、160、320、640μg/ml。
3、细胞诱导分化
按17500cells/cm2种板，汇合接触抑制2天后，加诱导剂1(含1μmol/L地塞米松，0.5mmol/L IBMX，10mg/L胰岛素)，48h后换液诱导剂2(含10mg/L胰岛素)，48h后换完全培养基诱导8-12天，诱导为成熟的脂肪细胞。诱导液配制如下：
(1)4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液(IBMX)配制。分子量为222，几乎不溶于水，需要现配现用，0.22μm过滤除菌。100×母液(50mmol/L)：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX母液，浓度即为0.5mmol/L。
(2)胰岛素溶液配制。-20℃可保存1个月，使用PH 2～3的稀盐酸溶液助溶，0.22μm过滤除菌。100×母液(1mg/ml)：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。每毫升培养基加10ul胰岛素母液，浓度即为10mg/L。
(3)地塞米松溶液配制。分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃可保存1个月。使用无水乙醇溶解，1000×母液(1mmol/L)。1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul地塞米松溶液，浓度即为1μmol/L。
4、实时荧光定量聚合酶链反应Q-PCR
(1)3T3-L1细胞诱导为成熟脂肪细胞后给不同浓度(80、160μg/ml)黄芪散作用，48h后提取RNA，转录为cDNA，实时荧光定量聚合酶链反应检测棕色脂肪相关基因：UCP1、PGC1α、PGC1β、CPT1α和PPARα；米色脂肪标志基因：CD137；线粒体合成关键酶基因：Tfam、NRF1和NRF2。
(2)在3T3-L1细胞诱导过程中，边诱导边给不同浓度黄芪散(80、160μg/ml)，10天后收集细胞提取RNA，转录为cDNA，实时荧光定量聚合酶链反应检测棕色脂肪相关基因：UCP1、PGC1α、PGC1β、CPT1α和PPARα；米色脂肪标志基因：CD137；线粒体合成关键酶基因：Tfam、NRF1和NRF2。
二、实验结果
1、3T3-L1细胞增殖活性
如图25所示，不同浓度的黄芪散作用于3T3-L1前脂肪细胞，随着黄芪散浓度的增加，3T3-L1前脂肪细胞增殖活性下降。当黄芪散各处理组浓度在20～160μg/ml时均无细胞毒性，不会影响3T3-L1前脂肪细胞的增殖活性，可进行下一步的试验。。
2、黄芪散处理3T3-L1前脂肪细胞诱导形成的成熟脂肪细胞
3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞后用不同浓度黄芪散进行处理，48h后收集细胞，检测相关基因的表达。其中，Pre表示3T3-L1前脂肪细胞组；MD表示成熟脂肪细胞。
(1)棕色脂肪相关基因的表达
80和160μg/ml黄芪散处理3T3-L1前脂肪细胞诱导形成的成熟脂肪细胞后，棕色脂肪的标志性基因UCP1以剂量依赖性的方式显著增加，且黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上调效果明显优于黄芪散共提组(图26)。此外，160μg/ml的黄芪散可以显著增加棕色脂肪产热相关基因PGC1α和PGC1β的表达，且黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上调效果明显优于黄芪散共提组(图27)。其中，Pre表示3T3-L1前脂肪细胞组；MD表示成熟脂肪细胞。
(2)肪酸氧化相关基因的表达
高耗氧率是棕色脂肪的一大主要特点。如图28所示，黄芪散处理3T3-L1前脂肪细胞诱导形成的成熟脂肪细胞后，脂肪酸氧化相关基因CPT1a和PPARα的表达呈剂量依赖性增加，在浓度为160μg/ml时效果最明显，且黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)对肪酸氧化相关基因表达的上调效果优于黄芪散共提组。
(3)米色脂肪标志基因的表达
米色脂肪细胞被认为是白色脂肪细胞转化为棕色脂肪细胞的中间状态，其特征类似于棕色脂肪细胞。黄芪散处理3T3-L1前脂肪细胞诱导形成的成熟脂肪细胞后，米色脂肪的标志基因CD137表达显著上调，且黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)对米色脂肪标志基因表达的上调效果优于黄芪散共提组(图29)。
(4)线粒体合成关键酶基因的表达
大量的线粒体是棕色脂肪的另一主要特点。黄芪散处理3T3-L1前脂肪细胞诱导形成的成熟脂肪细胞后，线粒体合成关键酶基因NRF1和NRF2的表达显著增加，差异具有统计学意义，同时黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)NRF1和NRF2基因表达的上升幅度明显高于黄芪散共提组(图30)。相比成熟脂肪细胞，Tfam基因的表达也稍有增加，但差异不具统计学意义(图31)。
3、3T3-L1前脂肪细胞边诱导边给药
在3T3-L1前脂肪细胞整个诱导分化过程中，给予不同浓度的黄芪散进行处理，检测相关基因的表达。其中，Pre表示3T3-L1前脂肪细胞组；MD表示成熟脂肪细胞。
(1)棕色脂肪相关基因的表达
如图32所示，与成熟脂肪细胞相比，黄芪散处理可以明显增加棕色脂肪标志基因UCP1的表达，增加的比例比诱导后给药48h高；棕色脂肪产热基因PGC1α和PGC1β的表达也显著增加，且作用均较给药48h强。同时黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上升幅度明显高于黄芪散共提组。
(2)肪酸氧化相关基因的表达
与成熟脂肪细胞相比，黄芪散处理可以明显增加脂肪酸氧化相关基因CPT1a和PPARα的表达。同时黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上升幅度明显高于黄芪散共提组(图33)。
(3)米色脂肪标志基因的表达
与成熟脂肪细胞相比，黄芪散处理可以明显增加米色脂肪标志基因CD137的表达。同时黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上升幅度明显高于黄芪散共提组(图34)。
(4)线粒体合成关键酶基因的表达
黄芪散给药处理后，线粒体生物合成关键酶基因NRF1、NRF2和Tfam的表达显著增加，且黄芪散1+2+1组(实施例3组合物)和黄芪散1:2+1组(实施例6组合物)上升幅度明显高于黄芪散共提组(图35)。与给药48h相比，边诱导边给药处理对棕色脂肪相关基因的表达影响更加明显，提示黄芪散可能在3T3-L1前脂肪细胞的诱导过程中起重要的调节作用，使其向消耗能量的棕色样脂肪细胞分化。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (11)
1.一种组合物，其特征在于，包含黄芪提取物、葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为(1～2)：(1～2)：(1～2)；
或包含黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物，且所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为(0.5～5):1，所述黄芪-葛根提取物和桑白皮提取物的质量比为1:1；
所述黄芪提取物的制备方法包括以下步骤：A、将黄芪药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为60～100℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.075～0.3g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以10～20BV的水，8～12BV体积分数为0.05～0.5％的NaOH溶液和8～12BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min，最后以10～20BV体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得；
所述葛根提取物的制备方法包括以下步骤：A、将葛根药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.05～0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10～20BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min；再以10～20BV的体积分数为30～50％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得；
所述黄芪-葛根提取物的制备方法包括以下步骤：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2～0.4g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以4～10BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3BV/h；再以4～12BV的体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得；
所述桑白皮提取物的制备方法包括以下步骤：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用6～8BV体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黄芪提取物、葛根提取物、桑白皮提取物的质量比为1:2:1；所述黄芪-葛根提取物中黄芪和葛根的质量比为1:2。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黄芪提取物的制备步骤A中，以8BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.075g/mL；
步骤C中用AB-8型大孔树脂对粗提液进行吸附，然后依次以10BV的水，10BV体积分数为0.5％的NaOH溶液和10BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，最后以10BV体积分数为70％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述葛根提取物的制备步骤A中，以10BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.1g/mL；
步骤C中用AB-8型大孔树脂对粗提液进行吸附，然后以10BV的水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min；再以10BV的体积分数为50％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述黄芪-葛根提取物的制备步骤A中，以10BV体积分数为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，提取温度为80℃；
步骤B中生药浓度为0.2g/mL；
步骤C中用LX-18型大孔树脂对粗提液进行吸附后，以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为2BV/h；再以10BV的体积分数为70％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述桑白皮提取物的制备步骤A中，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；
步骤B中生药浓度为0.120g/mL；
步骤C中用LSA-10型大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
7.一种如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1a)黄芪提取物制备：A、将黄芪药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为60～100℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.075～0.3g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后依次以10～20BV的水，8～12BV体积分数为0.05～0.5％的NaOH溶液和8～12BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min，最后以10～20BV体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，喷雾干燥，或回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得黄芪提取物，备用；
(2a)葛根提取物制备：A、将葛根药材粉碎，以6～14BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.05～0.2g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以10～20BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3mL/min；再以10～20BV的体积分数为30～50％的乙醇溶液以1～3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压浓缩成稠膏，冷冻干燥，粉碎，即得葛根提取物，备用；
(3a)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再用6～8BV体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(4a)按比例称取步骤(1a)获得的黄芪提取物、步骤(2a)获得的葛根提取物和步骤(3a)中获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1a)的步骤A中，将黄芪药材粉碎，以8BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.075g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，依次以10BV的水，10BV体积分数为0.5％的NaOH溶液和10BV体积分数为10％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，最后以10BV体积分数为70％的乙醇溶液以1mL/min的流速进行洗脱；
步骤(2a)的步骤A中，将葛根药材粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇回流提取2次，每次2h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.1g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，以10BV的水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min；再以10BV的体积分数为50％的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱；
步骤(3a)的步骤A中，将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；步骤B中生药浓度为0.120g/mL；步骤C中用大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
9.一种如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1b)黄芪-葛根提取物制备：A、按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以6～14BV体积分数为60～70％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取温度为70～90℃；B、合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，用水稀释至生药浓度为0.2～0.4g/mL，得到粗提液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的粗提液进行吸附，然后以4～10BV的水进行洗脱，洗脱流速为1～3BV/h；再以4～12BV的体积分数为30～70％的乙醇溶液以1～3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液回收乙醇，减压干燥，粉碎，即得黄芪-葛根提取物，备用；
(2b)桑白皮提取物制备：A、将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5～4h，然后以6～10BV体积分数为60～80％的乙醇回流提取1～3次，每次1.5～2h，提取温度为60～90℃，合并提取液；或将桑白皮药材在45～50℃下，于4～8BV体积分数为60～80％乙醇溶液中浸泡12～24h，恒温恒速进行渗漉，收集渗漉液，得到提取液；B、将步骤A中获得的提取液过滤，减压浓缩至生药浓度为0.11～0.13g/mL，得到浓缩液；C、使用大孔树脂对步骤B获得的浓缩液进行吸附，然后以4～8BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以6～8BV的体积分数为70～90％的乙醇溶液以1～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；D、将步骤C获得的洗脱液进行减压浓缩、干燥，粉碎，即得桑白皮提取物，备用；
(3b)按比例称取步骤(1b)获得的黄芪-葛根提取物和步骤(2b)获得的桑白皮提取物，混匀，即得组合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1b)的步骤A中，按比例称取黄芪、葛根药材，粉碎，以10BV体积分数为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，提取温度为80℃；步骤B中生药浓度为0.2g/mL；步骤C中用大孔树脂对粗提液进行吸附后，以4BV的水进行洗脱，洗脱流速为2BV/h；再以10BV的体积分数为70％的乙醇溶液以2BV/h的流速进行洗脱；
步骤(2b)的步骤A中，将桑白皮药材粉碎，用乙醇溶液浸泡3.5h，以8BV体积分数为75％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，提取温度为85℃；或将干燥的桑白皮药材在50℃下，于6BV体积分数为75％乙醇溶液中浸泡15h，然后用8BV体积分数为75％乙醇溶液在50℃、流速为0.5BV/h进行渗漉；步骤B中生药浓度为0.120g/mL；步骤C中用大孔树脂对提取液进行吸附后，以7BV的水进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，再以7BV的体积分数为75％的乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱。
11.根据权利要求1～6任一项所述的组合物在用于制备预防或治疗肥胖性高脂血症、脂肪肝、肥胖症和高同型半胱氨酸血症的药物中的用途。
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