CN109207450B

CN109207450B - 一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途

Info

Publication number: CN109207450B
Application number: CN201811119548.2A
Authority: CN
Inventors: 庞永珍; 刘晋跃; 夏亚迎
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109207450A

Abstract

本发明公开的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，该类黄酮异戊烯基转移酶基因即为从豆科植物白羽扇豆中鉴定的LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。并且，本发明公开了该基因的用途，其编码的蛋白可用于产生多种异戊烯基化的类黄酮化合物。本发明的优点在于，本发明从豆科植物白羽扇豆中克隆出类黄酮异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了系统鉴定，发现了该基因可以在体外异源产生多种具有生物活性的异戊烯基化的类黄酮化合物。

Description

一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途。

背景技术

类黄酮是一大类重要的植物次生代谢产物，包括黄酮醇、黄酮、异黄酮等，异戊烯基化是类黄酮的一种主要的修饰方式，异戊烯基化的类黄酮主要存在于豆科植物中，在植物的生长发育中起着重要作用。异戊烯基化的类黄酮具有多种功能，包括抗菌、抗氧化、抗肿瘤，在植物防御中具有明确的抗病菌作用。同时，很多异戊烯基化的类黄酮也是传统中药的重要组成成份，具有促进人体健康的功效。但是，目前植物各种类黄酮异戊烯基化的机制还不完全清楚，鉴于异戊烯基转移酶的多重功能，相对于植物中存在的种类繁多的异戊烯基类黄酮化合物以及其潜在的应用价值，克隆和鉴定具有新功能、底物特异性和生物活性的植物类黄酮异戊烯基转移酶基因具有重要的理论和应用价值。

发明内容

为了解决现有技术中类黄酮异戊烯基转移酶基因功能未知、没有活性的问题，本发明提供了一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途，实现的目的为，本发明从豆科植物白羽扇豆中克隆出对多种类黄酮、特别是其中的黄酮醇具有催化活性的异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了鉴定，产生了具有活性的异戊烯基化类黄酮，也为在其它生物中利用生物技术生产异戊烯基化类黄酮提供了重要的基因资源和技术方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明提供的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，该类黄酮异戊烯基转移酶基因即为LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所发现的LaPT2类黄酮异戊烯基转移酶基因是从白羽扇豆中克隆出来的，是一种全新的类黄酮异戊烯基转移酶基因，丰富了类黄酮异戊烯基转移酶的种类，同时由于异戊烯基化的类黄酮具有增强植物抗病性，进一步帮助实现增强生物，特别是植物本身抗病菌能力在产业上的应用。

进一步的，所述该类黄酮异戊烯基转移酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

进一步的，所述类黄酮异戊烯基转移酶基因的用途在其它生物中异源表达可以催化多种类黄酮进行异戊烯基化反应，产生具有生物活性的异戊烯基化类黄酮化合物。山奈酚、槲皮素和杨梅素是自然界含量最丰富的黄酮醇类的类黄酮，本发明证明重组的LaPT2蛋白对山奈酚和槲皮素具有很高的催化活性，这是植物中发现的第一个以黄酮醇为特异性底物的类黄酮异戊烯基转移酶基因。

本发明采用上述技术方案，具有以下有益效果，本发明从白羽扇豆克隆出类黄酮异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了系统鉴定，发现了该基因可以在酵母中产生具有活性的重组蛋白，催化多种类黄酮化合物的异戊烯基化反应，特别是类黄酮中的黄酮醇。

附图说明

图1为本发明白羽扇豆类黄酮异戊烯基转移酶与其它植物相关异戊烯基转移酶的进化分析图谱。

图2为本发明白羽扇豆异戊烯基转移酶与豆科类黄酮异戊烯基转移酶氨基酸序列的比对分析图谱，图中，类黄酮异戊烯基转移酶两个保守的基序NQxxDxxxD和KD(I/L)xDx(E/D)用黑色线框表示。

图3为本发明白羽扇豆类黄酮异戊烯基转移蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位，图中，A共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-GFP融合蛋白的荧光信号；B共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-TP₈₇-GFP融合蛋白的荧光信号；C共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-△TP₈₇-GFP融合蛋白的荧光信号，标尺＝5μm。

图4为本发明利用HPLC技术鉴定重组蛋白LaPT2的体外酶活产物图谱，图中，A重组蛋白LaPT2酶活反应代表性HPLC色谱图。上一组，底物山奈酚与产物异戊烯基山奈酚色谱图；下一组，底物槲皮素和产物异戊烯基槲皮素色谱图。B重组蛋白LaPT2酶活产物和底物紫外吸收色图谱。上一组，底物山奈酚与产物异戊烯基山奈酚紫外吸收色图谱；下一组，底物槲皮素和产物异戊烯基槲皮素紫外吸收色图谱。

图5为在鉴定LaPT2重组蛋白功能时所用的各种类黄酮化合物的化学结构图。

图6为利用UPLC-MS技术鉴定重组蛋白LaPT2的其它各种体外酶活产物的质谱图。A-E,分别为异戊烯基化的山奈酚、山奈素、槲皮素、桑色素、高良姜素、漆黄素。

图7为本发明使用HPLC和UPLC-MS技术分析白羽扇豆叶和根部类黄酮成份质谱图，图中，A白羽扇豆叶和根部甲醇提取物的HPLC色谱图。实箭头表示检测到的黄酮醇类物质，虚箭头表示异黄酮类物质。B白羽扇豆根部异戊烯基山奈酚和山奈酚的质谱图。

图8采用qRT-PCR技术分析白羽扇豆中LaPT2基因在叶和根部的相对表达量。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做出进一步的说明。

实施例一：本发明发现的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，记为LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示的序列中ATG为起始密码子,TGA为终止密码子，该基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其用途为在其它生物中异源表达可以催化多种类黄酮进行异戊烯基化反应，产生具有生物活性的异戊烯基化类黄酮化合物。

该基因在白羽扇豆中被鉴定和克隆，以下介绍是如何从白羽扇豆中将该基因克隆，并确定其是一种类黄酮异戊烯基转移酶基因、以及确定其用途的方法：

一、材料与方法：

1.1植物材料和生长环境

白羽扇豆种子用20％次氯酸钠溶液消毒10分钟后根据需要播种于蛭石或营养土中，在16小时光照，8小时黑暗，25℃/23℃环境条件下萌发生长。

1.2实验所用载体及菌株

大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，酵母表达载体pDR196GW、亚细胞定位载体pJIT163-hGFP来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验室。

1.3化学标准品及试剂

类黄酮标准品genistein，2'-hydroxygenistein，daidzein，biochanin A，formononetin，apigenin，luteolin，tricetin，kaempferol，kaempferide，quercetin，myricetin，3-hydroxyflavone，naringenin，liquiritigenin和isoliquiritigenin购买自上海同田生物技术股份有限公司；wighteone，fisetin，galangin，morin，astragalin购买自武汉凯米特科技有限公司。DMAPP购买自sigma-aldrich公司。用于配制酵母合成缺陷培养基(Synthetic Drop-out(SD)medium)的各种成份购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4植物总RNA提取及反转录

取白羽扇豆叶片或根材料，用研钵磨碎，然后取适量磨碎样品，用植物RNA提取试剂(Takara，RNAiso Plus(Code No.:9108))进行总RNA的提取。具体操作步骤如下：

1)取磨碎样品100mg，加入1mL RNAiso Plus，混匀；

2)室温静置5分钟，4℃，12000g离心5分钟；

3)上清转入新的1.5mL离心管，加入200μL氯仿，振荡混匀；

4)室温静置5分钟；4℃，12000g离心15分钟；

5)上清液转入新的离心管，加入1倍体积的异丙醇；

6)室温静置10分钟；4℃，12000g离心10分钟；

7)倒掉上清液，加入1mL75％乙醇清洗沉淀；

8)4℃，7500g离心5分钟，弃上清；

9)4℃，7500g离心2分钟，吸尽残余溶液；

10)室温下放置2-3分钟干燥，加入50-80μL DEPC水溶解。

用上述方法提取总RNA后，取1-2μL进行琼脂糖凝胶电泳，检验RNA是否合格。合格的RNA样品用Nanodrop2000测定其浓度。因为提取的RNA中可能会混有少量基因组DNA，而DNA的存在会影响实验结果，所以在进行反转录实验前，先要去除RNA中残留的基因组DNA。

去除RNA中DNA的实验操作体系：

将白羽扇豆总RNA于37℃反应消化30分钟后，加入DEPC水至250μL，然后加入等体积的氯仿进行抽提；4℃，12000g离心10分钟后上清液转移到新的1.5mL离心管，加入1/10体积10mol/L Licl和2.5倍体积乙醇于-20℃沉淀；4℃，12000g离心15分钟后，用75％乙醇漂洗沉淀，再次离心，倒掉上清液，干燥后加入适量DEPC水溶解RNA。

经上述操作去除总RNA中的DNA污染后，使用RNase M-MLV(RNaseH-)(Takara，CodeNo.:2641A)，按照说明书进行反转录实验。反转录得到的cDNA首先进行质量验证，用actin基因引物进行PCR扩增，符合要求的cDNA可用于后续实验。

1.5酵母遗传转化和微粒体提取

设计扩增LaPT2基因的全长引物(正向引物：GGACTAGTATGGGTTTTGTGCTTGC，下划线为起始密码子；反向引物：GTGCTCGAGTCATCTAAATAAAGGTA，下划线为终止密码子)，以cDNA为模板扩增LaPT2基因。利用双酶切方法将LaPT2基因直接连入酵母载体pDR196GW(限制性内切酶位点SpeⅠ和XhoⅠ)。通过测序确定序列正确后，进行酵母遗传转化和蛋白表达提取等后续实验操作。

1.5.1Licl法酵母转化操作步骤

1)取数个YPAD培养基上生长状态良好的酵母菌落于5-10mL YPAD液体培养基中，30℃振荡过夜培养；

2)取5mL酵母菌液加入100mLYPAD培养基中，继续培养直到其OD₆₀₀至0.8-1.0；

4)3000g离心5分钟收集酵母细胞；

5)加入高压灭菌后的蒸馏水20mL清洗，室温3000g再次离心5分钟，弃上清；

6)加入1mL无菌的浓度为0.1mol/L的Licl溶液重悬细胞，转入1.5mL离心管，12000rpm，离心15秒，去上清；

7)用0.5-1mL 0.1mol/L Licl重悬细胞，30℃，200rpm振荡摇菌30分钟；

8)每个转化样品取5μL鲑鱼精DNA(1μg/μL)，94℃热变性5分钟，然后迅速放于冰上冷却2分钟；

9)分装酵母感受态细胞50μL/管，加入5μL(约1μg)质粒和5μL热变性的鲑鱼精子DNA，混匀。然后加入300μL的PEG和Licl混合溶液(终浓度为40％PEG和0.1mol/L的Licl)，涡旋混匀；

10)42℃水浴热激40分钟，每隔5分钟轻弹混匀；

11)12000rpm，离心15秒，吸去上清。加入1mL无菌蒸馏水，涡旋混匀，12000rpm，离心15秒，去上清；

12)加入200-500μL无菌蒸馏水悬浮细胞，均匀涂于酵母营养缺陷(-Ura)平板上；

13)30℃培养2-3天，挑选单克隆进行PCR验证。

酵母营养缺陷型(-Ura)培养基配制：

缺Ura的氨基酸混合粉末 1.92g

无氨基酸酵母氮源 6.7g

琼脂(固体培养基) 20g

蒸馏水定容至950mL

调节培养基pH至5.8-7.0之间，高温高压灭菌后，加入50mL 40％无菌葡糖糖溶液混匀。

酵母营养缺陷型培养基中各种氨基酸及核酸成份和含量见表1。

表1酵母SD培养基各组分用量

酵母YPAD培养基配制：称取酵母提取物和细菌蛋白胨各10g(固体培养基还需要加入20g琼脂)，加入950mL蒸馏水，高温高压灭菌后，再加入50mL40％葡糖糖无菌溶液和200mgAde即可。

1.5.2酵母微粒体的提取

植物类黄酮异戊烯基转移酶是一类膜蛋白，酵母细胞完善的膜系统是植物异戊烯基转移酶成功表达的关键。目前尚无简单便捷的有效手段用于纯化膜蛋白，因此本发明利用酵母膜蛋白粗提物进行酶活实验。含LaPT2的重组蛋白的酵母微粒体制备的操作过程如下：

1)挑取阳性克隆于5-10mL酵母营养缺陷培养基(-Ura)中，30℃振荡过夜培养；

2)将5mL酵母菌液转入40mL培养基中，30℃震荡过夜培养；

3)将40mL酵母菌液转入400mL培养基中，培养12-16小时；

4)用尿糖试纸检测培养基中葡萄糖消耗情况，待葡萄糖耗尽后，4℃，4000g，离心15分钟收集酵母细胞；

5)去上清，加入100mL提取缓冲液，轻柔振动悬浮沉淀，室温下静置10分钟；

6)再次离心，4℃，4000g，15分钟；

7)去上清，离心管倒置于纸上，吸净剩余液体。用液氮预冷的药匙将酵母沉淀分成小块转入盛满液氮的50mL离心管中迅速冷冻；

8)将收集的酵母转入液氮预冷的破碎容器内，放于磨球仪，设定频率为30每秒，时间为3分钟，进行振动破碎。

9)液氮重新预冷，再次破碎，重复3-5次；

10)酵母粉末转入50mL离心管，加入30mL提取缓冲液，涡旋混匀；

11)4℃，10000g，离心10分钟；

12)将上清转入干净的超速离心管(Nalgene 3118-0030)，装满并配平；

13)4℃，100，000g，超速离心90分钟；

14)超速离心后，去上清。将油脂状的微粒体沉淀转入冰水预冷的匀浆器，加入1-1.5mL缓冲液(pH7.5，0.1M Tris-Hcl和20％甘油的混合液)，匀浆；

15)取50uL微粒体蛋白加入到2.5mL考马斯亮蓝溶液中，混匀充分反应，在595nm波长下用Bradford法(Bradford，1976)测定蛋白浓度；

16)将微粒体分装成200-300μL/管，液氮速冻，放于-80℃冰箱保存。

提取缓冲液成份及终浓度：20mM Tris-Hcl，pH7.5；0.6M sorbitol；10mMDithiothreitol(DTT，二硫苏糖醇)；1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，用95％乙醇溶解后，半衰期30分钟，需要现配现用。

1.6体外酶活实验方法

LaPT2酶活反应包括的各组分及终浓度如下：100mM Tris-HCl，1mM DTT，25mMMOPS(3-吗啉丙磺酸，pH 7.0)，10mM Mg²⁺,100μM类黄酮，250μM DMAPP和40μg微粒体蛋白。反应体积为200μL，30℃反应3小时，然后加入等体积甲醇终止反应。终止反应后在18000g转速下离心15分钟，取40μL在HPLC进行(Agilent，1260)检测。

酶动力学检测：底物DMAPP浓度固定，类黄酮浓度在0-1000μM范围内，一般设置5-7个浓度梯度检测。每个反应体积为50μL，加入10-20μg微粒体蛋白，30℃反应30分钟，然后加入等体积甲醇终止反应。设置三个重复。异戊烯基类黄酮产物与类黄酮底物有相似的紫外吸收光谱，所有产物的量均以类黄酮底物为参考进行定量。类黄酮异戊烯基转移酶动力学常数Km值和V_max值由软件Hyper32计算，采用Lineweaver-Burk plots方法。

1.7拟南芥原生质体制备，转化和荧光观察实验

将类黄酮异戊烯基转移酶基因LaPT2全长序列(正向引物：ACGCGTCGAC(ATG)GGTTTTGTGCTTGC，括号部分的为起始密码子；反向引物：CGCGGATCCTCTAAATAAAGGTATGA，不含终止密码子)，编码转运肽序列(正向引物：ACGCGTCGAC(ATG)GGTTTTGTGCTTGC，括号部分为起始密码子；反向引物：CGCGGATCCTTCATTTGATTTTCCAGA))和不含有转运肽(正向引物：ACGCGTCGAC(ATG)TATGAAACCCAAG，括号部分为起始密码子；反向引物：CGCGGATCCTCTAAATAAAGGTATGA，不含终止密码子)的异戊烯基转移酶基因序列分别克隆入植物亚细胞定位载体，构建表达异戊烯基转移酶LaPT2与GFP的融合蛋白的载体。然后通过PEG介导的方法将质粒转入拟南芥原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号，以此确定蛋白定位情况。

拟南芥原生质体制备及转化操作步骤：

1)取生长4周拟南芥莲座叶，切成0.5-1mm细丝，放入酶解液(表2)中25℃裂解3-4小时，200目筛子过滤至50mL离心管中；

表2酶解液-10mL

试剂	体积/重量	母液浓度
			纤维素酶	0.125g
离析酶	0.03g
			Mannitol	4mL	1M
KCl	2mL	0.1M
			MES	2mL	0.1M
H<sub>2</sub>O	1.9ML

上述溶液混匀，55℃加热10分钟，冷却至室温。然后加入BSA固体0.01g和CaCl₂溶液100μL，混匀即可。

2)4℃，100g，缓升缓降离心2分钟；

3)用15mL W5(表3)重悬，4℃，100g，缓升缓降离心2分钟，弃上清；

表3 W5溶液-50mL

母液	体积	母液浓度
			NaCl	7.7mL	1M
CaCl<sub>2</sub>	6.25mL	1M
			KCl	2.5mL	0.1M
MES	1mL	0.1M
			H<sub>2</sub>O	32.55mL

4)重复上一步操作；

5)用5mL W5重悬，冰上放置30分钟；

6)4℃，100g，缓升缓降离心2分钟；

7)弃上清，加入适量(质粒样品数*150μL)MMg(表3)重悬；

8)取12μL质粒(约12μg)加入2mL离心管，然后加入120μL原生质体，轻弹混匀；

9)加入等体积PEG(表4)，轻弹混匀；

10)常温放置5-30分钟，一般15分钟即可；

11)加入2倍体积W5，轻弹混匀；

12)4℃，100g，缓升缓降离心1分钟；

13)弃上清，加入过量W5，25℃过夜培养(≥16小时)，然后进行观察。

表3 MMg溶液-10mL

表4 PEG溶液-10mL

母液	体积	母液浓度
			PEG	4g
H<sub>2</sub>O	3.5mL
			Mannitol	2mL	1M
CaCl<sub>2</sub>	1mL	1M

1.10 qPCR实验及相关数据计算

利用NCBI的Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)程序设计定量引物:正向引物：GCAGCTACTTCTTTTCCCAAAG；反向引物：ATTTCTCTTGTCTCCCCCTTTG。采用UltraSYBR Mixture(北京康为世纪公司)试剂进行荧光定量实验.具体实验步骤依据UltraSYBR Mixture实验手册进行，设置三次重复。本发明采用2^-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，C_T(Cycle threshold)值是PCR扩增时荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

1.11 HPLC和UPLC-MS/MS检测条件

称取20mg左右冷冻干燥的白羽扇豆的叶片和根部样品，加入50倍体积80％甲醇溶解。然后超声处理30分钟，取出放于4℃冰箱过夜，次日再次超声处理30分钟。超声处理后的样品用15000g离心20分钟，上清液经过0.22μm滤膜过滤后，取适量进行HPLC和UPLC-MS检测。

1.11.1 HPLC条件及参数

流动相：A相为0.1％甲酸水溶液；B相为纯乙腈。

洗脱梯度：0-30分钟，B相由5％线性升至70％；30-35分钟，B相由70％线性升至100％；35-38分钟，100％B相。检测波长为254nm和280nm。当每个样品检测完成后，用95％A相和5％B相清洗5分钟。流动相流速为1mL/分钟。

样品检测所用分离柱型号为Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)。

1.11.2 UPLC-MS/MS条件及参数设定

利用液质连用UPLC-MS对化合物进行分离及检测。首先利用UPLC(Waters)对样品化合物进行分离，分离柱型号为ACQUITY UPLC HSS C18 column(1.7μm，100×2.1mm i.d.；Waters)。流动相与HPLC检测时相同，洗脱梯度：0-6分钟，95％A相线性降至55％；6-7分钟，A相降至10％；7-10分钟，95％A相和5％B相平衡。流速为0.5mL/分钟，检测波长为254nm和280nm。

质谱分析条件：在negative-ion(NI)模式下进行全离子扫描(采集质谱范围m/z：100-1000)，根据实验需要调整所要检测的子离子大小，根据需要调控检测时的碰撞能量(在2-30之间)，其余按照仪器默认参数进行。所用仪器为Xevo TQ-MS spectrometer(Waters，Milford，MA，USA)，所得检测数据利用软件MassLynx(version4.1)进行分析。

二、结果

2.1白羽扇豆类黄酮异戊烯基转移酶基因LaPT2的克隆和进化关系分析

本发明在白羽扇豆的转录组数据中筛选到一个候选异戊烯基转移酶基因的EST序列(按一般规则命名，本发明中称为LaPT2)，长度为1460bp，含有一个完整的ORF，预测编码长度为402个氨基酸的多肽。与鉴定功能的植物类黄酮异戊烯基转移酶进行序列比对，发现LaPT2编码的蛋白与类黄酮异戊烯基转移酶相似度较高。本发明构建了植物异戊烯基转移酶的系统进化树(图1)。图1利用Clustal X2进行多序列比对分析，然后在MEGA6.0中利用最大似然法进行进化树构建，bootstrap值为1000。从图1可知，LaPT2与豆科类黄酮异戊烯基转移酶聚为一簇，与桑科两个类黄酮异戊烯基转移酶没有聚在一起。

LaPT2蛋白含有植物类黄酮异戊烯基转移酶保守的基序(motif)NQxxDxxxD和KD(I/L)xDx(E/D)(图2)。TMHMM 2.0程序预测显示该蛋白含有7个α-螺旋(α-helices)的跨膜结构。目前报道的植物类黄酮异戊烯基转移酶一般都具有7-9个跨膜结构，LaPT2蛋白跨膜结构数量在此范围内。以上数据分析预示LaPT2编码一个典型的豆科植物类黄酮异戊烯基转移酶。

2.2白羽扇豆LaPT2的亚细胞定位

LaPT2的理论pI为9.35(http://web.expasy.org/compute_pi/)，典型的质体膜蛋白特征(≥8.8)(Ferro et al,2002)。而Chlorop 1.1预测显示LaPT2 N-端含有转运肽(transit peptide)序列，并且预测LaPT2是位于叶绿体的蛋白。

为了验证上述推测，本发明构建了多个LaPT2与GFP的融合蛋白表达载体。通过浸染转入拟南芥原生质体，在激光共聚焦显微镜下可以看到LaPT2-GFP融合蛋白的绿色荧光与叶绿体自发荧光重叠，表明LaPT2定位于叶绿体上(图3)。但是LaPT2-GFP荧光很微弱，推测全长LaPT2可能影响了GFP的结构，减弱了GFP的荧光信号。为了改善这一情况，将LaPT2编码N-端87个氨基酸的序列与GFP融合(LaPT2-TP₈₇-GFP)后，观察到LaPT2-TP₈₇-GFP具有典型的叶绿体定位模式；而去掉LaPT2 N-端87个氨基酸序列后的融合蛋白LaPT2-△TP₈₇-GFP的荧光信号呈现细胞质分布的模式。这些结果表明LaPT2是一个叶绿体蛋白，其N-端转运肽带有定位信息。

2.3 LaPT2的体外酶学特性

本发明将LaPT2基因克隆到酵母表达载体pDR196GW中。将携带LaPT2基因的质粒(pDR196GW-LaPT2)转入酵母菌株，提取了LaPT2重组蛋白微粒体，进行了体外酶活实验。在酶活反应中以13种常见的具有代表性的类黄酮为底物进行了检测。这些底物包括5种异黄酮(染料木素、2’-羟基染料木素、鹰嘴豆芽素A、大豆黄素和芒柄花黄素)，3种黄烷酮(柚皮素、甘草素和异甘草素)，2种黄酮(芹菜素和木犀草素)，3种黄酮醇(山奈酚、槲皮素和杨梅素)(表5)。结果发现当以山奈酚和槲皮素为底物与重组蛋白LaPT2反应后，检测到了异戊烯基黄酮醇产物(图4)；同时，酶活表明LaPT2对柚皮素也具有微弱的催化功能(表5)。在使用其它底物反应时没有检测到相应的产物，说明LaPT2对其余9种类黄酮没有催化功能，这些底物包括白羽扇豆本身含量丰富的染料木素和2’-羟基染料木素。这一结果说明LaPT2是以黄酮醇为特异底物的类黄酮异戊烯基转移酶。

表5 LaPT2重组蛋白体外酶活实验所用类黄酮底物及反应结果

注：+和－分别表示LaPT2重组蛋白与底物反应有或者没有催化活性，反应以DMAPP作为异戊烯基供体。

除了上述代表性的类黄酮之外，本发明还选取了另外一些代表性的黄酮醇苷元进行酶活检测。其中，3-羟基黄酮(3-hydroxyflavone)(图6)是人工合成的代表最简单黄酮醇结构(无5，7，4’位羟基)的化合物。LaPT2对3-羟基黄酮不具有催化功能，说明5，7，4’位羟基全部缺失影响LaPT2对底物的催化活性。从植物类黄酮合成途径可知，黄酮醇4’位羟基来源于香豆酰CoA(p-coumaroyl CoA)的对位羟基，5和7位羟基来源于malonyl CoA部分。目前研究证明缺失4’位羟基的类黄酮是通过4CL-like酶的直接催化底物反式肉桂酸(trans-cinnamate)而生成的，而缺失5位羟基类黄酮则是由于CHR参与导致的。实验证明单独缺失4’位羟基和5位羟基的黄酮醇类的高良姜素(galangin)和漆黄素(fisetin)均能作为LaPT2的底物(图5和表6)。本发明证明LaPT2对选取的B环具有不同羟基化和甲基化修饰的黄酮醇苷元均具有催化活性(图5和表6)，但是对不同的黄酮醇苷元进行酶动力学分析，发现这些底物的Km和Vmax值各不相同(表6)，说明LaPT2重组蛋白对这些底物的催化效率存在差异。

表6 LaPT2重组蛋白对各种黄酮醇苷元的体外酶动力学参数

Flavonols(黄酮醇类底物)	Km(μM)	Vmax<sup>r</sup>(nmol min<sup>-1</sup>)
			Kaempferol(山奈酚)	247.30±46.76	0.1799±0.0179
Quercetin(槲皮素)	171.00±15.54	0.0606±0.0087
			Morin(桑色素)	19.90±2.51	0.0050±0.0002
Kaempferide(山柰素)	206.73±26.59	0.0175±0.0011
			Fesitin(漆黄素)	28.32±2.78	0.0421±0.0025
Galangin(高良姜素)	42.26±9.15	0.0276±0.0009

2.4白羽扇豆异戊烯基黄酮醇含量检测

为了说明白羽扇豆黄酮醇的种类和含量，本发明选取生长30天的白羽扇豆幼苗根和叶进行检测。本发明在白羽扇豆叶中检测到了黄酮醇类化合物(图7A)，推测主要是糖基化黄酮醇类，但是没有检测到异戊烯基黄酮醇。尽管白羽扇豆叶片中黄酮醇化合物的种类及含量明显多于根中(图7A)，但是在白羽扇豆根中有微量的prenylated kaempferol(图7A)，其保留时间和最大紫外吸收峰与LaPT2酶活产物prenylated kaempferol完全相同。HPLC-MS分析显示在NI模式下其质荷比(m/z)为353.1(图7B)，与异戊烯基化的山奈酚理论核质比完全相同。因此可以肯定白羽扇豆根中存在异戊烯基化的山奈酚。

2.5白羽扇豆LaPT2基因表达模式分析

本发明采用qRT-PCR的方法，分析证明LaPT2主要在根中表达，其相对表达量是叶的100多倍(图8)，此结果与prenylated kaempferol在根部积累现象相对应。

三、最终结论

1.白羽扇豆LaPT2基因编码一个类黄酮异戊烯基转移酶，LaPT2蛋白催化特异的底物黄酮醇，黄酮醇苷元的羟基数量和位置分布会影响LaPT2的催化效率，与已知的其它植物的类黄酮异戊烯基转移酶不同，LaPT2是一个全新的植物类黄酮异戊烯基转移酶。

2.白羽扇豆积累丰富的异戊烯基类黄酮化合物，是研究类黄酮异戊烯基转移酶的理想植物。LaPT2是一个定位于叶绿体的膜蛋白，可以在酵母和植物原生质体中表达，表达的重组蛋白具有活性，鉴于LaPT2对多种黄酮醇苷元具有较高的催化效率，因此可以用于微生物或者植物代谢工程生产具有活性的异戊烯基黄酮醇。

本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 类黄酮异戊烯基转移酶基因全长序列(Lupinus albus)

<400> 1

atgggttttg tgcttgcagc tacttctttt cccaaagctc cttcctttac atctggcaga 60

agttcatgga atagtaaaga gtacaccaag aactattatg caagttctca tgtaacaact 120

ttatggcaca aaactgggat aatccaaaaa gaaccttgtt ttatgatggc ttggccacaa 180

aatttgaagc ttcattgcaa agtcaaaggg ggagacaaga gaaattatgt tatgaatgca 240

gcctctggaa aatcaaatga atatgaaacc caagatcttg atcaaagaaa caattggggc 300

accttgataa atgctttgca tgttttcttc aagtttatca ggccaactgc aacattatct 360

ttattattgg gagcaactct taccactctt attgccgtgg agaaattgtc agatatatct 420

gcagcatatt ttattggctt gttgcaggtt atggtggttt catcctgtat gcaagttttt 480

atggctggct tgaatcaatt atatgacgtt gaaatagaca agataaataa gccatatctt 540

ccattggtat ctggagaatt acccttcaag aatggtgtca ttattgttgc gacaactttt 600

attctgggtc atttgtttcc gttgattatc ggttctggac cattattttg gagctttgtc 660

ttcagctctt cgcttgcaat cgcttattgt gcagatttgc ctttgttgag atggaagaga 720

cactcagctc ttacagcgct gaactatatt attgatctgg gaggagtaaa gccacttgga 780

tatgttcttc acatgcagac atatgtgttc aagaggccac ctaccttttc aagaccattg 840

atcttttgta tggcaatgtc aagtgtattt gctataatta tagcaatatt caaggatata 900

actgacatgg aaggagatga aaaatttggt ataaaatctt tgtcattaca tttgggtaaa 960

aaaccggtat tttggatttg tgtttcactt cttcaaatgg cttatgtagt agccattttg 1020

atgggaacat tatctccttt cctctgggtc aaaattgcca tgggtttggg acatggcatt 1080

cttgcttcac tcgtctcgta ttatgccaat tctgtagatc tgaagagtaa tcctgcaata 1140

caatccttct acatgtttat ctggaagcta ttaactgtag agtacttcct cataccttta 1200

tttagatga 1209

<210> 2

<211> 402

<212> PRT

<213> 类黄酮异戊烯基转移酶基因编码的蛋白质(Lupinus albus)

<400> 2

Met Gly Phe Val Leu Ala Ala Thr Ser Phe Pro Lys Ala Pro Ser Phe

1 5 10 15

Thr Ser Gly Arg Ser Ser Trp Asn Ser Lys Glu Tyr Thr Lys Asn Tyr

20 25 30

Tyr Ala Ser Ser His Val Thr Thr Leu Trp His Lys Thr Gly Ile Ile

35 40 45

Gln Lys Glu Pro Cys Phe Met Met Ala Trp Pro Gln Asn Leu Lys Leu

50 55 60

His Cys Lys Val Lys Gly Gly Asp Lys Arg Asn Tyr Val Met Asn Ala

65 70 75 80

Ala Ser Gly Lys Ser Asn Glu Tyr Glu Thr Gln Asp Leu Asp Gln Arg

85 90 95

Asn Asn Trp Gly Thr Leu Ile Asn Ala Leu His Val Phe Phe Lys Phe

100 105 110

Ile Arg Pro Thr Ala Thr Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr

115 120 125

Thr Leu Ile Ala Val Glu Lys Leu Ser Asp Ile Ser Ala Ala Tyr Phe

130 135 140

Ile Gly Leu Leu Gln Val Met Val Val Ser Ser Cys Met Gln Val Phe

145 150 155 160

Met Ala Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Asp Val Glu Ile Asp Lys Ile Asn

165 170 175

Lys Pro Tyr Leu Pro Leu Val Ser Gly Glu Leu Pro Phe Lys Asn Gly

180 185 190

Val Ile Ile Val Ala Thr Thr Phe Ile Leu Gly His Leu Phe Pro Leu

195 200 205

Ile Ile Gly Ser Gly Pro Leu Phe Trp Ser Phe Val Phe Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Ala Ile Ala Tyr Cys Ala Asp Leu Pro Leu Leu Arg Trp Lys Arg

225 230 235 240

His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Asn Tyr Ile Ile Asp Leu Gly Gly Val

245 250 255

Lys Pro Leu Gly Tyr Val Leu His Met Gln Thr Tyr Val Phe Lys Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Phe Ser Arg Pro Leu Ile Phe Cys Met Ala Met Ser Ser

275 280 285

Val Phe Ala Ile Ile Ile Ala Ile Phe Lys Asp Ile Thr Asp Met Glu

290 295 300

Gly Asp Glu Lys Phe Gly Ile Lys Ser Leu Ser Leu His Leu Gly Lys

305 310 315 320

Lys Pro Val Phe Trp Ile Cys Val Ser Leu Leu Gln Met Ala Tyr Val

325 330 335

Val Ala Ile Leu Met Gly Thr Leu Ser Pro Phe Leu Trp Val Lys Ile

340 345 350

Ala Met Gly Leu Gly His Gly Ile Leu Ala Ser Leu Val Ser Tyr Tyr

355 360 365

Ala Asn Ser Val Asp Leu Lys Ser Asn Pro Ala Ile Gln Ser Phe Tyr

370 375 380

Met Phe Ile Trp Lys Leu Leu Thr Val Glu Tyr Phe Leu Ile Pro Leu

385 390 395 400

Phe Arg

Claims

1.一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，其特征在于，该类黄酮异戊烯基转移酶基因记为LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1的类黄酮异戊烯基转移酶基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种类黄酮异戊烯基转移酶基因的用途，其特征在于，所述类黄酮异戊烯基转移酶基因为权利要求1中所述的LaPT2基因，其用途为催化山奈酚、槲皮素、杨梅素、柚皮素进行异戊烯基化反应，产生具有生物活性的异戊烯基化类黄酮化合物。