CN102292441A - 类黄酮3-o-葡萄糖醛酸基转移酶及编码该酶的多核苷酸 - Google Patents

类黄酮3-o-葡萄糖醛酸基转移酶及编码该酶的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明提供可将葡萄糖醛酸转移到类黄酮，特别是黄酮醇的3位上的酶(F3GAT)、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体及使用该载体所得到的转化体等。本发明所涉及的多核苷酸含有如下多核苷酸，由序列号3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸或编码由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

Description

类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶及编码该酶的多核苷酸
技术领域
本发明涉及类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体及使用该载体而得到的转化体等。
背景技术
以类黄酮、木脂素为代表的多酚植物次生代谢产物多作为健康食品而应用，其在体内通过被称为UGT的糖转移酶(糖苷化酶)进行葡萄糖苷酸结合。通常，因葡萄糖苷酸作为尿液排出，所以，至今为止未将其功能性作为研究对象，但近年来，已开始了解了吗啡葡萄糖苷酸或类黄酮葡萄糖苷酸的生物活性(参照非专利文献1、2)。
作为葡萄酒原料的葡萄科葡萄(Vitis vinifera)是世界性的主要农作物，已知红葡萄酒具有降低心脏病风险、抗肥胖效果等有用的功能性，近年来，由于在红葡萄酒中鉴定出了作为具有抗肥胖效果、延长寿命效果的主要功能性成分的白藜芦醇或二苯乙烯类物质、以及成为法国悖论(French paradox)的主要原因的主要成分的原花青素，因而使红葡萄酒作为功能性食品受到关注(参照非专利文献3～9)。
作为类黄酮的一种即黄酮醇糖苷，已报道了葡萄叶中积累有槲皮素-3-葡萄糖苷及槲皮素-3-葡萄糖醛酸糖苷(参照非专利文献10)。且近年来，还报道了在葡萄果实及葡萄酒中也有各种黄酮醇糖苷的积累(非专利文献11)。特别是槲皮素的3-葡萄糖醛酸糖苷被称为槲皮素-3-葡萄糖苷(miquelianin)，已知作为用作抗抑郁剂的圣约翰草(St.John′s wort，即贯叶连翘提取物)的主要药理成分之一，并表现出通过口服给药从肠道吸收并传递到中枢神经系统，但槲皮素3-鼠李糖苷没有该活性(参照非专利文献12)。进而，还已知槲皮素的3-葡萄糖醛酸糖苷具有抑制LDL分解的效果(参照非专利文献13、14)、减轻H2O2所引起的细胞内氧化应激的效果(参照非专利文献15)、抑制血管紧张素所引起的血管肥厚的效果(预防心脏病)(参照非专利文献16)等。
由以上可知，认为将葡萄糖醛酸转移到类黄酮，特别是黄酮醇的3位上的酶对制造功能性类黄酮有用，但至今为止，作为类黄酮的3位糖苷化酶也仅知将葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖作为糖供体转移，而将葡萄糖醛酸作为糖供体转移的酶及编码该酶的基因还不为人所知(参照非专利文献17～20)。
但近年来，意大利及法国的共同对葡萄(黑皮诺(Pinot Noir)品种)的基因组序列进行了测序，鉴定出了多达240个糖苷化酶(UGT)基因(参照非专利文献21、22)。
但是，即使由基因序列信息推测糖转移酶基因，也不容易基于这些信息通过比对从中鉴定出作为底物的糖的种类和作为受体的物质，且如上所述的候选基因的数量有240个，非常之多，所以，要从这些UGT基因中鉴定出至今为止在其他生物中还未报道过的类黄酮3-O-葡萄糖醛酸转移酶(Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase；F3GAT)是极为困难的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kroemer，H.K.and Klotz，U.Clin.Pharmacokinet.，vol.23，p.292-310，1992
非专利文献2：Zhang，L.et al.，Eur.J.Pharm.Sci.，vol.31，p.221-231，2007
非专利文献3：Renaud，S.and De Lorgeril，M.，Lancet，vol.339，p.1523-1526，1992
非专利文献4：Gehm，B.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.94，p.14138-14143，1997
非专利文献5：Corder，R.et al.，Nature，vol.414，p.863-864，2001
非专利文献6：Lamming，D.W.et al.Mol.Microbiol.，vol.53，p.1003-1009，2004
非专利文献7：Corder，R.et al.，Nature，vol.444，p.566，2006
非专利文献8：Baur，J.A.and Sinclair，D.A.，Nature Rev.Drug Discovery，vol.5，p.493-506，2006
非专利文献9：Baur，J.A.et al.，Nature，vol.444，p.337-342，2006
非专利文献10：Hmamouchi，M.et al.，Am.J.Enol.Vitic.，vol.47，p.186-192，1996
非专利文献11：Castillo-Munoz，N.et al.，J.Agric.Food.Chem.，vol.55，p.992-1002，2007
非专利文献12：Juergenliemk，G.et al.，Plant Med.，vol.69，p.1013-1017，2003
非专利文献13：Terao，J.et al，Free Radical Res.，vol.35，p.925-931，2001
非专利文献14：Shirai，M.et al.，J.Agric.Food Chem.，vol.49，p.5602-5608，2001
非专利文献15：Shirai，M.et al.，Biosci.Biotechnol.Biocham.，vol.66，p.1015-1021，2002
非专利文献16：Yoshimizu，M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commu.，vol.293，p.1458-1465，2002
非专利文献17：Ford，C.M.et al.，J.Biol.Chem.，vol.273，p.9224-9233，1998
非专利文献18：Miller，K.D.et al.，J.Biol.Chem.，vol.274，p.34011-34019，1999
非专利文献19：Yonekura-Sakakibara，K.et al.，J.Biol.Chem.，vol.282，p.14932-14941，2007
非专利文献20：Yonekura-Sakakibara，K.et al.，Plant Cell，vol.20，p.2160-2176，2008
非专利文献21：The French-Italian Public Consortium for GrapevineGenome Characterization，Nature，vol.449，p.463-468，2007
非专利文献22：Velasco，T.et al.，PLoS ONE，vol.12，e1326，p.1-18，2007
发明内容
因此，本发明欲解决的课题在于提供可将葡萄糖醛酸转移到类黄酮，特别是黄酮醇的3位上的酶、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体及使用该载体所得到的转化体等。
本发明人为解决上述课题进行了锐意研究。其结果，本发明人着眼于类黄酮UGT的基因序列和结构与其对受体底物的位点特异性之间的相关性，通过从基因组序列信息中提取出与将糖转移到类黄酮3位上的酶基因具有高度同源性的来自葡萄的UGT基因，从而得到来自葡萄的6个候选UGT基因(葡萄UDP-糖：糖基转移酶；VvGT)。本发明人发现该6种VvGT中的1种(VvGT5)是编码具有以UDP-葡萄糖醛酸依赖性地将葡萄糖醛酸转移到类黄酮3位上的活性的酶、即类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶的基因，从而完成了本发明。
即本发明如下：
(1)一种多核苷酸，其特征在于，为以下(a)～(f)中任一项所述的多核苷酸：
(a)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸由序列号3所示的核苷酸序列组成；
(b)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(d)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(f)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
上述(1)中的多核苷酸，例如可例举以下(g)～(j)中任一项的多核苷酸：
(g)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(h)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有至少90％同源性的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(i)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(j)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
另外，上述(1)的多核苷酸例如可例举所述(c)～(j)中所述的多核苷酸分别为，例如以下(c’)～(j’)中所述的多核苷酸：
(c’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中除了第140位氨基酸以外的1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(d’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列且与该序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸对应的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(e’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸、且是与该序列号3所示的核苷酸序列中第418～420位核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(f’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸、且是与该编码序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列中第418～420位核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(g’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中除了第140位氨基酸以外的10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(h’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列且与该序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸对应的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(i’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸、且是与该序列号3所示的核苷酸序列中第418～420位的核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(j’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸、且是与编码该序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列中第418～420位核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
上述(1)中的多核苷酸包括，例如多核苷酸，其中上述UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性为类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶活性。
上述(1)中的多核苷酸包括，例如如下多核苷酸，其含有由序列号3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸、或编码由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
上述(1)中的多核苷酸是，例如DNA。
(2)一种蛋白质，其由上述(1)中的多核苷酸编码。
(3)一种载体，其含有上述(1)中的多核苷酸。
(4)一种转化体，其导入了上述(1)中的多核苷酸。
(5)一种转化体，其导入了上述(3)中的载体。
(6)一种制造蛋白质的方法，其为上述(2)中的蛋白质的制造方法，其包括使用上述(4)或(5)中的转化体。
(7)一种制造葡萄糖醛酸结合物的方法，其包括以上述(2)中的蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖醛酸和糖基受体底物生成葡萄糖醛酸结合物。
上述(7)中的方法包括，例如其中的糖基受体底物是类黄酮的方法。
本发明的效果
在体内，大多数类黄酮通常在其3位或7位上发生葡萄糖醛酸化，由其结构的不同可预测不同的功能性及有用性。但是，这没有反映出通过从人体或动物体中分离及纯化而得到这些葡萄糖醛酸化代谢物的经济性及时间成本。
根据本发明，通过离体(in vitro)、或在宿主细胞中导入本发明的基因，可将葡萄糖醛酸转移到类黄酮的3位，从而可提供不依赖上述天然资源而可容易地生产包含槲皮素-3-葡萄糖苷在内的有用类黄酮葡萄糖苷酸的糖基转移酶(糖苷化酶)。此外，根据本发明，还可提供编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、及使用该载体所得到的转化体、以及使用该酶的葡萄糖醛酸结合物的制造方法等。
附图说明
图1显示了编码来自葡萄的类黄酮糖苷化酶的同源基因的系统分析的结果，是根据邻接法(Neighbor-Joining(NJ))产生的包括8种葡萄UGT(VvGT)在内的类黄酮UGT基因簇I的分子系统树。外类群(Out group)为美洲葡萄(Vitis labrusca)(Concord种)的白藜芦醇的葡萄糖基转移酶基因(VlRSgt)。
图2显示了来自葡萄的糖苷化酶同源基因的染色体定位的结果。VvGT1同源基因以串联状位于LG11染色体和LG6染色体上。
图3显示了大肠杆菌表达的VvGT5的纯化(SDS-PAGE)结果。见于用500mM咪唑洗脱的组分中的条带(图中的箭头)为带有His标签的融合VvGT5蛋白质。且“M”表示分子大小的标记物，“粗”表示粗酶液，“素”表示流出液(flow-through)，“洗”表示洗涤后的溶液。
图4显示了VvGT5的酶活性测定的结果。具体地说，为360nm处监测的HPLC色谱图。上层的色谱图为槲皮素和VvGT5的反应液的色谱图，中层的色谱图为标准品的槲皮素3-葡萄糖苷酸的色谱图，下层的色谱图为标准品的槲皮素的色谱图。上层的色谱图中所示箭头表示反应产物的峰。
图5显示了VvGT5的最适pH检测中使用的缓冲液体系。
图6显示了VvGT5的反应pH依赖性的结果。纵轴表示将最高活性作为100％时的相对活性(％)。
图7显示了VvGT5的反应温度依赖性的结果。纵轴表示将最高活性作为100％时的相对活性(％)。
图8显示了VvGT5的糖受体选择性的结果。“n.d.”表示数值在检测限度以下。
图9显示了槲皮素3-葡萄糖苷酸的NMR的结果。结构式的中央下部的粗线所示的结合部分为通过多种结合连接度(Hetero-nuclear Multiple-BondConnectivity，HMBC)测定所确认出的结合的部分。
图10显示了通过定量RT-PCR所得到的各器官的VvGT基因表达分析的结果。具体地说，为对黑皮诺(Pinot Noir)品种(左)和赤霞珠(Cabernet Sauvignon)品种(右)中的VvGT进行基因表达分析的结果。在这两品种中，上层的图表均为VvGT1基因的分析结果，中层的图表为VvGT5基因的分析结果，下层的图表为VvGT6的分析结果。所有的图表均表示用内标基因(VvUBQ)标准化后的相对表达量。
图11显示了类黄酮LC分析的结果。“Q3GA”表示槲皮素3-葡萄糖苷酸，“Q3Glc”表示槲皮素3-葡萄糖苷。
图12显示了MS分析的结果。“Q3GA”表示槲皮素3-葡萄糖苷酸，“Q3Glc”表示槲皮素3-葡萄糖苷。
图13显示了氨基酸序列格式化比对(Formatted Alignments)的结果。将VvGT5的第140位的精氨酸残基(R)的位置用粗框线圈住表示。At3GlcT、Ph3GlcT及VvGT1分别按顺序分别表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮牵牛及葡萄的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶。
图14显示了VvGT5突变体(VvGT5 R140W)的糖基供体选择性的结果(酶反应条件(上侧的表))。图表的纵轴为以活性最高的UDP-葡萄糖醛酸及UDP-葡萄糖为100％时，各野生型VvGT5(WT)及其突变体(R140W)的相对活性(Relative activity(％))。
具体实施方式
以下详细说明本发明。本发明的范围不受这些说明的约束，除以下的例示以外，也可在不脱离本发明的意图的范围内进行适当变更来实施。且本说明书包含作为本申请优选权的基础的日本特愿2009-011065号说明书(2009年1月21日申请)的全部内容。另外，本说明书中引用的全部发行物、例如现有技术文献及公开公报、专利公报及其他的专利文献均作为参照编入本说明书中。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供了(a)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸由序列号3所示的核苷酸基序列组成；(具体而言为DNA，以下也将这些简称为“DNA”)；及(b)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质。作为本发明对象的DNA不限于上述编码葡萄糖醛酸基转移酶的DNA，还包含编码与该蛋白质功能相同的蛋白质的其他DNA。
功能相同的蛋白质是，例如(c)由序列号4所示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。此种蛋白质包括，例如由序列号4所示的氨基酸序列中，例如1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基缺失、取代、插入及/或添加的数量通常越小越优选。且在本发明中，与上述(c)的功能相同的蛋白质优选由与序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸残基(精氨酸)对应的氨基酸残基同样为精氨酸的氨基酸序列组成的蛋白质。即上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加优选由序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸以外的氨基酸来进行。此种优选实施方式同样应用于所述(g)的多核苷酸中。
此外，功能相同的蛋白质是，例如(d)具有与序列号4所示的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。此种蛋白质包括，例如具有与序列号4所示的氨基酸序列有约80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同源性的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。上述同源性的数值通常越大越优选。且在本发明中，与上述(d)功能相同的蛋白质优选由与序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸残基(精氨酸)对应的氨基酸残基同样为精氨酸的氨基酸序列组成的蛋白质。此种优选实施方式同样应用于所述(h)的多核苷酸中。
在此，本发明中所述“UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性”是指以UDP-葡萄糖醛酸依赖性地将糖基供体的葡萄糖醛酸转移到充当糖基受体底物的类黄酮的3位羟基上，即具有催化生成葡萄糖醛酸结合物反应的活性的酶，即类黄酮3-O-葡萄糖醛酸转移酶活性。
UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的测定可以通过例如，使UDP-葡萄糖醛酸和作为糖基受体底物的类黄酮(例如黄酮、黄酮醇等)在待评价的酶的存在下进行反应，并通过用HPLC等分析将所得到的反应物而进行(具体细节参照后述实施例中的记载)。
此外，本发明还包含(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。且在本发明中，上述(e)的多核苷酸优选含有如下多核苷酸，其中，与序列号3所示的核苷酸序列中第418～420位核苷酸(AGG)所对应的核苷酸为相同的“AGG”，或即使不是相同核苷酸，也为“CGU”、“CGC”、“CGA”、“CGG”及“AGA”中的任一个。在此，上述第418～420位的核苷酸(AGG)是指编码序列号4所示的氨基酸序列中第140位的氨基酸残基(精氨酸)的核苷酸(密码子)。此种优选实施方式同样应用于所述(i)的多核苷酸中。
而且，本发明还包含(f)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。且在本发明中，上述(f)的多核苷酸优选含有如下多核苷酸，其中，与编码由序列号4所示氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列中第418～420位核苷酸所对应的核苷酸为相同核苷酸，或即使不是相同核苷酸，也为“CGU”、“CGC”、“CGA”、“CGG”、“AGA”及“AGG”中的任一个。在此，上述第418～420位的核苷酸是编码序列号4所示氨基酸序列中第140位氨基酸残基(精氨酸)的核苷酸(密码子)。此种优选实施方式同样应用于所述(j)的多核苷酸中。
本说明书中，“多核苷酸”指DNA或RNA，优选为DNA。
本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指例如以由序列号3的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸、或由编码序列号4所示的氨基酸序列的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等而得到的多核苷酸。作为杂交的方法，例如可使用“Sambrook & Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，Laboratory Press2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997”等中所记载的方法。
本说明书中的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。另外，“中严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。尽管多个因素与杂交严谨性相关，包括温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但认为在上述条件中，温度越高，越能高效地获得具有同源性较高的DNA。本领域技术人员通过适当选择这些因素，可实现同样的严谨性。
杂交中使用市售的试剂盒时，可使用例如Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，将膜与标记探针保温过夜后，在55℃，使用含有0.1％(w/v)SDS的初步洗涤缓冲液洗涤所述膜，之后可检测杂交的DNA。
可通过例如FASTA、BLAST等的同源性搜索软件，使用默认参数计算可杂交的其他多核苷酸，包括与序列号3的核苷酸序列的DNA或编码序列号4所示的氨基酸序列的DNA有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上同源性的DNA。
氨基酸序列或核苷酸序列之间的同源性可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.87，p.2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，p.5873，1993)确定。开发了基于BLAST算法的，被称为BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF，et al.，J.Mol.Biol.，vol.215，p.403，1990)。使用BLASTN分析核苷酸序列时，参数例如为记分(score)＝100、词长(word length)＝12。且使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为记分＝50、词长＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。
上述本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程方法或公知的合成方法获得。
2.本发明的蛋白质
在其他实施方式中，本发明提供了由上述本发明的多核苷酸编码的蛋白质。在一个实施方式中，本发明的蛋白质是由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。在另一个实施方式中，本发明的蛋白质为具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质。
在另一个实施方式中，本发明的蛋白质为由序列号4所示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。此种蛋白质包括，例如具有与序列号4所示的氨基酸序列有如上所述同源性的氨基酸序列、且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质，此种蛋白质可使用“Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，LaboratoryPress 2001”、“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.，vol.10，p.6487，1982”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.79，p.6409，1982”、“Gene，vol.34，p.315，1985”、“Nuc.Acids.Res.，vol.13，p.4431，1985”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.82，p.488，1985”等中所述的定点诱变法获得。在另一个实施方式中，上述蛋白质优选为由与序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸残基(精氨酸)对应的氨基酸残基同样为精氨酸的氨基酸序列所组成的蛋白质。即上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加优选为由序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸以外的氨基酸来进行。
本发明的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个(例如1～15个、优选为10个以下)的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加是指在同一序列中的任意一个或多个位置上缺失、取代、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基。也可同时发生缺失、取代、插入及添加中的2种或多种。
以下给出了可相互取代的氨基酸残基的实例。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸和环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸和2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺和谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸和2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸和4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；G组：苯丙氨酸和酪氨酸。
此外，本发明的蛋白质也可通过，例如Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。此外，还可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。
在此，本发明的蛋白质为类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶。“葡萄糖醛酸基转移酶”催化将葡萄糖醛酸基从糖基供体转移到糖基受体底物以生成葡萄糖醛酸结合物的反应。本发明中，糖基受体底物为类黄酮，糖基供体为UDP-葡萄糖醛酸。在本发明的实施方式中，所述蛋白质催化将葡萄糖醛酸残基从UDP-葡萄糖醛酸转移到作为糖基受体底物的类黄酮(例如黄酮醇、黄酮)的3位羟基以生成葡萄糖醛酸结合物和UDP的反应。
作为糖基受体底物的类黄酮包括，例如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、异黄酮、黄酮C糖苷、橙酮(aurone)、儿茶素等。其中，黄酮的实例包括，例如黄芩黄素、高黄芩素、芹菜素、木犀草素、五羟黄酮(tricetin)、香叶木素(diosmetin)及金圣草黄素(chrysoeriol)等。黄酮醇的实例包括，例如槲皮素、杨梅黄素、甲基杨梅黄酮(larycitrin)、异鼠李素、丁香黄素(syringetin)及山奈黄素等。二氢黄酮的实例包括，例如柑桔素。异黄酮的实例包括，例如染料木素、大豆素及芒柄花素(formonoetin)。黄酮C糖苷的实例包括，例如牡荆葡基黄酮、异牡荆葡基黄酮及荭草素(orientin)。橙酮的实例包括，例如金鱼草素。儿茶素的实例包括，例如儿茶素及表没食子儿茶素没食子酸酯。在本发明中，作为本发明中糖基受体底物的类黄酮，优选黄酮及黄酮醇，进一步优选黄酮醇，且最优选槲皮素、山奈黄素及杨梅黄素。
3.载体及导入该载体的转化体
在另一个实施方式中，本发明提供了含有本发明的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体含有本发明的多核苷酸(例如，所述(a)～(j)中的任一个多核苷酸)。优选本发明的表达载体含有所述(g)～(j)中的任一个多核苷酸。进一步优选本发明的表达载体含有如下多核苷酸，包含由序列号3的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸、或包含编码由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。
本发明的载体通常经构建而包含表达盒，所述表达盒含有作为构成元件的：(i)在宿主细胞内可转录的启动子；(ii)与该启动子结合的本发明的多核苷酸(例如，所述(a)～(j)中的任一个多核苷酸)；及(iii)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化有关的、在宿主细胞内起作用的信号。如此构建的载体被导入宿主细胞。作为表达载体的制备方法，可例举使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但并不限于此。
载体的具体种类无特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即可根据宿主细胞的种类选择适合的启动子序列，以使本发明的多核苷酸得到确切地表达，将该启动子序列与本发明的多核苷酸整合进各种质粒等中后的载体作为表达载体使用。
依赖于待导入的宿主的种类，本发明的表达载体含有表达调控区(例如，启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用常用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)；作为酵母用启动子，可使用例如3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等；作为真菌用启动子，可使用例如淀粉酶、trpC等。此外，作为用于源自动物的宿主细胞的启动子，可使用例如病毒性启动子(例如，SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。
表达载体优选含有至少1个选择标记。作为此种标记，可使用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素、博莱霉素、遗传霉素)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas8m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，vol.64，p.660，1992；Hussain et al.，Gene，vol.101，p.149，1991)等。
本发明还提供导入了本发明的多核苷酸(例如，所述(a)～(j)中的任一个多核苷酸)的转化体。
转化体的制备方法(生产方法)无特别限定，且包括例如，包括将重组载体导入宿主，随后进行转化的方法。在此使用的宿主细胞无特别限定，可优选使用以往公知的各种细胞。具体地说，例如大肠杆菌(Escherichia coli)等的细菌、酵母(芽殖酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞等。用于上述宿主细胞的适合的培养基及条件为本领域所公知。且作为转化对象的生物也无特别限定，可包括在上述宿主细胞中例举的各种微生物、植物和动物。
作为宿主细胞的转化方法，可利用通常使用的公知方法。例如，可使用的方法包括电穿孔法(Mackenxie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403《脂质生产菌的育种方法》(日语原名：脂質生産菌の育種方法)中记载的方法)、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)]、乙酸锂法[J.Bacteriology，153，p163(1983)]、以及Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor LaboratoryCourse Manual中记载的方法等，但不限于此。
在本发明的其他方式中，转化体可为植物转化体。本实施方式中所涉及的植物转化体可通过如下方法获得，即：以使由该多核苷酸编码的多肽可表达的方式将包含本发明多核苷酸的重组载体导入植物中。
使用重组表达载体时，植物体转化所使用的重组表达载体无特别限定，只要是可使本发明的多核苷酸在该植物内表达的重组表达载体。此种载体的实例包括，例如具有能够使所述多核苷酸在所述植物细胞内组成性表达的启动子(例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体、或具有通过外界刺激被诱导活化的启动子的载体。
本发明中成为转化对象的植物可以指植物体全株、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或植物培养细胞，或各种类型的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶片切片、愈伤组织等的任一个。作为用于转化的植物无特别限定，其包括属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物的任一种。
向植物内导入基因，可使用本领域技术人员公知的转化方法(例如，土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等)。例如，土壤杆菌介导的方法和直接导入植物细胞的方法是众所周知的。使用土壤杆菌法时，将构建的用于植物用表达载体导入适合的土壤杆菌[例如，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)]中，根据叶盘法(内宫博文著，植物遺伝子操作マニユアル(1990)27～31頁、講談社サイエンテイフイツク、東京)等使该菌株感染无菌培养叶片，从而可获得转化植物。此外，还可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.，67，325(1990)。该方法包括，首先例如将表达载体导入土壤杆菌，然后按照《植物分子生物学实验指南》(Plant Molecular Biology Manual(S.B.Gelvin等、Academic Press Publishers))中记载的方法，将转化的土壤杆菌用导入植物细胞或植物组织。本文使用的“植物组织”包括通过培养植物细胞而得到的愈伤组织。使用土壤杆菌法进行转化时，可使用双元载体(pBI121或pPZP202等)。
此外，用于将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，已知有电穿孔法、基因枪法。使用基因枪时，可直接使用植物体全株、植物器官或植物组织自身，也可在制备切片后使用，也可制备原生质体后使用。可使用基因导入装置[例如PDS-1000/He(BIO-RAD公司)等]轰击由此制备的样品。轰击条件因植物或样品的不同而不同，通常在约450～2000psi的压力、4～12cm左右的距离进行轰击。
首先使用如潮霉素抗性等的抗药性选择导入了所述基因的细胞或植物组织，其次用常规方法再生植物体。由转化细胞进行植物体的再生可用与植物细胞种类相应的本领域技术人员公知的方法进行。
将植物培养细胞作为宿主使用时，转化是将重组载体用基因枪、电穿孔法等导入培养细胞。由转化所得到的愈伤组织、芽、须根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，还可使用常规的植物组织培养法，通过添加适当浓度的植物激素(例如，生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯等)再生出植物体。
可通过PCR、Southern杂交法、Northern杂交法等确认基因是否被导入。例如，从转化植物中制备DNA，随后设计DNA特异性引物以进行PCR。PCR可在与制备上述质粒所使用的条件同样的条件下进行。之后，扩增产物可进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，用溴化乙锭、SYBR Green液等染色。通过检测表现为单条带扩增产物可确认发生了转化。另外，可使用预先用荧光色素等标记的引物进行PCR，随后检测扩增产物。而且也可采用使扩增产物结合在酶标板等的固相上，通过荧光或酶反应等确认扩增产物的方法。
一旦获得本发明的多核苷酸整合进基因组内的转化体，即可通过该植物体的有性繁殖或无性繁殖得到其后代。还可通过从该植物体或其后代、或其克隆中得到例如种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等，而进行该植物体的大规模生产。因此，本发明中也包括可表达地导入本发明的多核苷酸的植物体，或与该植物体具有相同特性的该植物体的后代或来自它们的组织。
此外，已报道了用于各种植物的转化方法。本发明的转化体植物的实例包括，例如葡萄、芝麻、稻子、烟草、大麦、小麦、油菜、马铃薯、西红柿、白杨、香蕉、桉树、甘薯、黄豆、苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜、玫瑰、菊花、康乃馨、金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗(Prairie gentian)、小苍兰、非洲菊、唐菖蒲、丝石竹(gypsophila)、长寿花、百合、天竺葵属、老鹳草属、矮牵牛、蝴蝶草(torenia)、郁金香、连翘(Forsythia intermedia)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)及百脉根(Lotus japonicus)等，但不限于这些。
在本发明的实施方式中，转化植物体为用于功能性食品材料的植物体。
4.本发明的蛋白质的制造方法
在本发明的另一个实施方式中，本发明提供使用上述转化体制造本发明蛋白质的方法。
具体地说，可通过从上述转化体的培养物中分离并纯化出本发明的蛋白质，从而获得本发明的蛋白质。本文使用的培养物是指培养液、培养菌体或培养细胞、或培养菌体或培养细胞的均浆中的任一种。可使用常规方法分离和纯化本发明的蛋白质。
具体地说，本发明的蛋白质在培养菌体内或培养细胞内积累时，可在培养所述菌体或细胞后，用常规方法(例如，超声波、溶菌酶、冷冻溶解等)破碎菌体或细胞，并通过常规方法(例如，离心分离、过滤等)得到本发明的蛋白质的粗提物。本发明的蛋白质在培养液中积累时，可在培养终止后，通过常规方法(例如，离心分离、过滤等)将菌体或细胞与培养上清分离，从而获得含有本发明的蛋白质的培养上清。
可根据常规的分离和纯化方法，纯化包含在由此得到的提取液或培养上清中的本发明的蛋白质。所述分离和纯化方法包括，例如，可单独或适当组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法、超滤法等。
5.葡萄糖醛酸结合物的制造方法
本发明还提供使用本发明的蛋白质制造葡萄糖醛酸结合物的方法。本发明的蛋白质催化将葡萄糖醛酸从作为糖基供体的UDP-葡萄糖醛酸转移作为糖基受体底物的类黄酮(具体地说为转移到类黄酮的3位羟基)的反应。因此，可通过使用本发明的蛋白质，以糖基受体底物及糖基供体为原料，来制造葡萄糖醛酸结合物。作为糖基受体底物，在类黄酮中优选黄酮及黄酮醇，更优选为黄酮醇，最优选为槲皮素、山奈黄素及杨梅黄素。
例如，可通过配制含有1mM的糖基受体底物、2mM的糖基供体、50mM的磷酸钙缓冲液(pH 7.5)及20μM的本发明的蛋白质的溶液，并在30℃下反应30分钟，来制造葡萄糖醛酸结合物。葡萄糖醛酸结合物可通过公知的方法从该溶液中分离并纯化。具体地说，例如可单独或适当组合使用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相高效液相色谱法、透析法、超滤法等。
如此得到的葡萄糖醛酸结合物可用作功能性食品的材料、用于监测所述体内功能的试剂，或抗氧化剂等(Gao，Z.，Huang，K.，Yang，X.，and Xu，H.，Biochimica et Biophysica Acta，vol.1472，p.643-650，1999)。
实施例
通过参考以下实施例更具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
基因克隆
本实施例中使用的分子生物学的方法，只要无其他详细说明，均可按照Molecular Cloning(Sambrookra，Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001)中记载的方法。
以来自葡萄的类黄酮3-O-葡萄糖转移酶基因的VvGT1(Offen，W.et al.，EMBO J.，vol.25，p.1396-1405，2006)的全长序列为基础，在Istituto AgrarioSan Michele all′Adige(IASMA)提供的葡萄基因组数据库(http://genomics.research.iasma.it/iasma/)中进行Blast同源性搜索。结果发现显示高同源性的7个候选UGT基因(图1)。通过利用MEGA4程序(Tamura，K.etal.，Mol.Biol.Evol.，vol.24，p.1596-1599，2007)的NJ系统树分析确认出这些基因属于类黄酮3-UGT的基因簇，即基因簇I(图1)。而且，通过将候选基因序列与染色体物理图对照，证实了染色体上的同线性(图2)。VvGT3、VvGT5及VvGT6以相同转录方向位于11号染色体上，在它们之间发现了黄酮醇磺基转移酶样基因(Varin，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，p.1286-1290，1992)。VvGT5及VvGT6的同源性特别高，并被认为是通过基因重复而产生的旁系同源基因。另外，还发现了以相同转录方向位于6号染色体上的VvGT2及VvGT4。在其下游发现了转录方向相同的VvGT2及VvGT4的拷贝组，按顺序分别命名为VvGT2-样及VvGT4-样。另一方面，已知的VvGT1位于16号染色体上。
随后，为克隆这些VvGT基因，用下述方法制备来自葡萄叶的cDNA。使用克隆的基因为模板进行PCR扩增。根据制造业者推荐的方法，使用用于RNA纯化的FruitMate及Fast Pure RNA试剂盒(TaKaRa Bio公司)从0.1g葡萄(Vitis vinifera，品种：赤霞珠(Cabernet Sauvignon))叶中提取总RNA，并根据制造业者推荐的方法，使用用于RT-PCR的SuperScript第一链合成系统(Invitrogen公司)从1μg总RNA中合成cDNA。
下文以VvGT5基因为例，给出了cDNA克隆及表达载体构建的程序。以通过反转录得到的cDNA为模板，使用以基因组序列信息(GenBank登录号：CAN74919)为基础设计的下述VvGT5基因特异性引物(序列号1及2)，通过PCR进行VvGT5的分离。
具体地说，PCR反应液(50μl)的组成如下，来自葡萄叶的cDNA 1μl、1×ExTaq缓冲剂(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引物(序列号1及2)各0.4pmol/μl和2.5单位的ExTaq聚合酶。PCR反应在94℃反应3分钟后，以94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟的反应为1个循环，进行共计35个循环的扩增反应。
CACC-NdeI-VvGT5-Fw：
5’-CAC CCATAT GAC TAC CAC CGC CAG CTC CAT-3’(序列号1)
B glII-VvGT5-RV：
5’-AGA TCT CTA CTT ATT GGT GTC CAA AGG TA-3’(序列号2)
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离PCR反应液，得到大小约1.4kb的扩增片段。将该扩增片段亚克隆到pENTR-Directional-TOPO载体(Invitrogen公司)，在DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems公司)上，使用合成寡核苷酸引物，通过引物步移法(primer walking method)测定插入片段的核苷酸序列，确认出插入的cDNA是VvGT5(序列号3及4)。此外，该序列与数据库登录的来自黑皮诺(Pinot Noir)品种的序列(GenBank登录号：CAN74919)在氨基酸序列水平上显示出99％的序列同一性。此差异被认为是由于葡萄品种间的多态性造成的。
VvGT5的cDNA序列：
ATGACTACCACCGCCAGCTCCATGGACAGGCATGTTGCAGTATTAGGGTTCCCCACCCATACAGCTACCCTCTTAAAACTCCTGCGCAGACTAGCATCTGCCGCACCCACCACCATCTTCTCCTTCTTCAACACTCCCAAGGCCAACAGCTCCATCTCCTCTGCTCAAAGTCCCCACGGTATTCACAATCTAAGAGTTTATGATGTAGCAGACGGCGTGCCAGAGGACCTTGTGCTTTCAGCAAACCCCCTGGCACGCATCGAGATGTTCTTGAAGGCGACGCCTGGGAACTTTCGTGATGCTTTGGAAGTGGCTGAGAAGGACATTGGAAGGAAGATAAGTTGCCTGGTGAGTGATGTCTTTTTGTGGTTCACTGCTGATATGGCTGAGGAAATGGGGGTTCCGTGGGTGGCAATTAGGACTGCTGCGCTTTACTCACTCTCCGTCCACATTTATACTGATGCTATCCGGGAAGCAGTGGGAGTTGCGGGGCAGGTGCAAGACCAAACCCTTGATTTCATCCCAGGATTCTCAGCAATAAAGGTTGAAGACCTACCTGAAGGAATGGTTTTCGGGGACACAGAATCTCCCTTCGCATGCATGTTGCATAAAATGGGGCTCATGCTGCCACGAGCAACCATTGTTGCCACAAATTCCTTTGAAGAACTAGAGCCGACCATTGTCACAAATGATCTCAAGTCCAAGCTCCAAAAAGTTCTTACTGTTGGTCCTTTTGACCTATCTTCACCACCACCGCTGATATTGGACGCCAGTGGCTGCCTGCCATGGTTGGACAATAAAAAAGAAGCGTCAGTGGCATATGTTAGTTTTGGAAGCATAGCAACACCACCACCCAACGAGATTGTAGCATTGGCAGAAGCCCTAGAAGCAACTGGGATACCGTTTCTTTGGTCTCTTAGGGAGCATGCAATGAACAATTTACCAAAAGGATTTCTAGAGAGGACGACCGCTCATGGAAAAGTAGTTTCGTGGGCACCCCAGCCTCAGGTCTTAGCACATGCCTCAGTTGCAGTGTTTATTACTCATAGCGGTTGGAACTCGGTGACTGAGAGTATAGTTGGTGGTGTGCCCATGATCTGCAGGCCATTCTTTGGAGATCAACGTCTTAACAGGCGGATGGTACAGGATGTATGGGGGATTGGTATAGGAGTTGAGGGAGGGATCCTCACAAAAAGGGGAGTAATGAGTGCTTTGGGACTAATTTTGTCCCATGAAGGGAAGAAAATGAGAGAGAAAATTGGGGTCCTAAAAGAGCTTGCTAGAAGGGCTGTTGAACCAAACGGGAGCTCAACTCAAAATTTAGGTCATTTGTTGGAGGTAATCACAACATCTAAGTTACCTTTGGACACCAATAAGTAG(序列号3)
VvGT5的氨基酸序列：
MTTTASSMDRHVAVLGFPTHTATLLKLLRRLASAAPTTIFSFFNTPKANSSISSAQSPHGIHNLRVYDVADGVPEDLVLSANPLARIEMFLKATPGNFRDALEVAEKDIGRKISCLVSDVFLWFTADMAEEMGVPWVAIRTAALYSLSVHIYTDAIREAVGVAGQVQDQTLDFIPGFSAIKVEDLPEGMVFGDTESPFACMLHKMGLMLPRATIVATNSFEELEPTIVTNDLKSKLQKVLTVGPFDLSSPPPLILDASGCLPWLDNKKEASVAYVSFGSIATPPPNEIVALAEALEATGIPFLWSLREHAMNNLPKGFLERTTAHGKVVSWAPQPQVLAHASVAVFITHSGWNSVTESIVGGVPMICRPFFGDQRLNRRMVQDVWGIGIGVEGGILTKRGVMSALGLILSHEGKKMREKIGVLKELARRAVEPNGSSTQNLGHLLEVITTSKLPLDTNK(序列号4)
利用引物内的NdeI及BglII的限制性内切酶位点切出约1.4kb的VvGT5片段，连接到作为大肠杆菌表达载体pET15b的NdeI及BamHI位点，得到VvGT5的大肠杆菌表达载体。在大肠杆菌表达载体的构建中，将位于所述载体的NdeI位点上游的His标签与VvGT5的开放阅读框融合，以使由此设计的载体表达与His标签融合的嵌合VvGT5蛋白。
实施例2
酶功能分析
为明确所述酶的生物化学功能，使所述酶在大肠杆菌中表达。
使用如上所述得到的质粒，根据常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)。将所得转化体在补充了50μg/ml的氨苄青霉素的4ml LB培养基(10g/l胰化蛋白胨，5g/l酵母提取物，1g/l NaCl)中37℃下振荡培养过夜。将达到静止期的4ml培养液接种于组成相同的80ml培养基中，随后在37℃下振荡培养。当细胞浊度(OD600)达到约0.5时，添加最终浓度0.5mM的IPTG，18℃下振荡培养20小时。
所有以下操作均在4℃进行。将所培养的转化体用离心(5,000×g，10分)以收集细胞，按1ml/g细胞向细胞中添加Buffer S[20mM HEPES缓冲液(pH7.5)，20mM咪唑，14mM β-巯基乙醇]以将其悬浮。随后进行超声波破碎(15秒×8次)、离心分离(15,000×g，15分钟)。将所得到的上清作为粗酶液回收。为了纯化具有His标签的VvGT5表达蛋白质，将粗酶液注入用Buffer S平衡后的His SpinTrap(GE Healthcare)，进行离心(70×g，30秒)。用Buffer洗涤后，用含有100mM及500mM咪唑的Buffer S各5mL将结合于色谱柱的蛋白质梯度洗脱。使用Microcon YM-30(Amicon)，将各洗脱组分中的缓冲液替换成20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)及14mM β-巯基乙醇(透析率1000倍)。
根据SDS-PAGE分析的结果，在500mM咪唑洗脱组分中，检测出在VvGT5的推测分子量49.68kDa附近的蛋白质，所以，将该组分用于酶分析(图3)。
标准的酶反应条件如下。在50μl配制反应液(1mM糖基供体，200μM糖基受体底物，20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，约2μg的纯化酶)后，通过向其中添加酶溶液开始反应，30℃下反应过夜。通过添加5μl 20％磷酸终止反应，随后通过进行反相HPLC分析。
反相HPLC系统由以下仪器构成。使用MODEL305(Gilson公司)作为Pump A；使用MODEL302(Gilson公司)作为Pump B；使用MODEL231(Gilson公司)作为进样器；使用401(Gilson公司)作为稀释剂；使用811B(Gilson公司)、Pressure Module(RAININ)作为动态混合器；使用DGU-12A(岛津制作所)作为脱气装置；使用SPD-M20A二极管阵列检测器(岛津制作所)作为检测器。
黄酮醇类的HPLC条件如下。在室温下使用J′sphere ODS-M80(4.6×150mm、YMC)作为色谱柱，使用流动相A(0.2％甲酸/10％CH3CN)和流动相B(0.2％甲酸/90％CH3CN)。洗脱条件如下：用B10％平衡3分钟，进行10分钟的线性浓度梯度(B10％→B40％)洗脱，再进行10分钟的线性浓度梯度(B40％→B90％)洗脱后，在B90％保留1分钟。而后，再重新用B10％平衡10分钟。流速为0.7ml/分钟。检测使用SPD-M20A二极管阵列检测器在360nm进行。在所述条件下，标准品的槲皮素、槲皮素3-葡萄糖苷酸、山奈黄素及异鼠李素按顺序分别在保留时间约17.8分钟、11.8分钟、20.1分钟及20.4分钟洗脱。通过下文参考例1中所述的方法从葡萄叶中制备所使用的槲皮素3-葡萄糖苷酸。
根据槲皮素为糖基受体、以UDP-葡萄糖醛酸为糖基供体的酶反应液的HPLC分析的结果，可在与槲皮素3-葡萄糖苷酸保留时间相符的约11.8分钟的保留时间，确认出新的产物(图4)。此结果显示出VvGT5基因编码具有将葡萄糖醛酸转移到类黄酮3位的活性的F3GAT。
其次，测定所述酶的最适pH。如图5所示，配制从pH 3到pH 10.5的各种缓冲液，将作为糖基受体的100μM槲皮素、作为糖基供体的1mM UDP-葡萄糖醛酸、50mM缓冲液、14mM 2-巯基乙醇及50ng上述纯化VvGT5酶在30℃下反应5分钟。通过加入槲皮素开始反应，通过加入等量含有0.1％TFA的40％乙腈溶液而终止反应。反应终止后，将溶液离心(15000rpm，2分钟，4℃)，并将100μl所得上清用于HPLC分析，比较在各缓冲液条件下产生的产物量。由结果发现，从中性到碱性区域表现出强的酶活性，其最适pH为9.1(图6)。
随后，测定所述酶的最适温度。使作为糖基受体的100μM槲皮素、作为糖基供体的1mM UDP-葡萄糖醛酸、50mM甘氨酸-NaOH(pH9.5)缓冲液、14mM 2-巯基乙醇及50ng上述纯化VvGT5酶在10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃及60℃下分别反应15分钟。通过加入槲皮素开始反应，通过加入等量含有0.1％TFA的40％乙腈溶液终止反应。反应终止后，将溶液离心(15000rpm，2分钟，4℃)，并将100μl所得上清用于HPLC分析，比较各温度条件下产生的产物量。结果发现，最适反应温度为45℃(图7)。
之后，检测所述酶的糖基受体特异性。如图8所示，使100μM各糖受体、作为糖基供体的1mM UDP-葡萄糖醛酸、50mM甘氨酸-NaOH(pH9.5)缓冲液、14mM 2-巯基乙醇及50ng上述纯化VvGT5酶在30℃下反应15分钟。通过加入糖基受体开始反应，通过加入等量含有0.1％TFA的40％乙腈溶液终止反应。反应终止后，将溶液离心(15000rpm，2分钟，4℃)，并将100μl所得上清用于HPLC分析，比较各糖基受体产生的产物量。
使用上述HPLC系统，在下述下条件下对花色素苷类进行分析。用于花色素苷的HPLC分析条件如下所示。在室温下使用Asahipak ODP-504E(4.6×250mm、昭和电工)作为色谱柱，使用流动相A(0.5％TFA/H2O)和流动相B(0.5％TFA/50％CH3CN)。洗脱条件如下：用B30％平衡3分钟后，进行15分钟的线性浓度梯度(B30％→B65％)，再进行1分钟的线性浓度梯度(B65％→B100％)后，再用B100％保留5分钟。而后再重新用B30％平衡10分钟。流速为0.7ml/分。在520nm处进行检测。在所述条件下，标准品的花葵素、花色素及花翠素按顺序分别在保留时间约25.7分钟、23.9分钟及20.8分钟洗脱。
分析的结果证明VvGT5特异性地作用于黄酮醇，其中，对槲皮素的活性最高(图8)，这与在葡萄叶中积累的主要黄酮醇葡萄糖苷酸为槲皮素3-葡萄糖苷酸的结论是一致的。此外还根据常规方法对所述酶进行动力学分析；对槲皮素、山奈黄素及异鼠李素的底物特异性(Km)按顺序分别为5.60±1.76μM、10.8±0.4μM及7.92±0.32μM，催化活性(kcat)按顺序分别为7.16±0.37s-1、6.05±0.05s-1及0.413±0.03s-1。由此，通过动力学参数也可证实VvGT5对槲皮素的活性最高。
其次，检测所述酶的糖基供体特异性。使作为各种糖的受体的100μM槲皮素、1mM各糖基供体(UDP-葡萄糖醛酸、UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖；均由SIGMA购入)、50mM甘氨酸-NaOH(pH9.5)缓冲液、14mM 2-巯基乙醇及50ng上述纯化VvGT5酶在30℃下反应15分钟。通过加入糖基受体开始反应，加入等量含有0.1％TFA的40％乙腈溶液终止反应。反应终止后，将溶液离心(15000rpm，2分，4℃)，并将100μl所得上清用于HPLC分析，比较各糖基供体产生的产物量。结果只有以UDP-葡萄糖醛酸为底物时得到了产物，对UDP-葡萄糖醛酸的底物特异性(Km)为17.7±2.9。此结果证明VvGT5对UDP-葡萄糖醛酸是特异性的，为UDP-葡萄糖醛酸依赖性黄酮醇3-O-葡萄糖醛酸转移酶(F3GAT)。
〔参考例1〕
<从葡萄中提取和纯化类黄酮>
将164g葡萄叶(赤霞珠(Cabernet Sauvignon)品种)在液氮中粉碎，在1.5L60％CH3CN及0.05％HCOOH中浸渍过夜，随后通过硅藻土垫过滤。将滤液减压浓缩至体积为1/3左右，将浓缩液注入600ml CHP-20P中，用600ml水洗涤后，用20％，30％，40％CH3CN/H2O各300ml x 2进行分段洗脱。发现20％-2组分中有多酚类的洗脱。对20％-2到40％-1的各组分进行浓缩及冷冻干燥，用HPLC进行分析。产量为20％-2(568.6mg)、30％-1(345.8mg)、30％-2(787.0mg)、40％-1(181.2mg)。
按照下文所述的两步程序，通过制备型HPLC纯化含有高纯度黄酮醇糖苷的30％-1组分及30％-2组分。
<制备HPLC条件1>
色谱柱：Develosil ODS-HG-15/30，
Figure BPA00001406959300261
50mm x 500mm
流动相：A-0.05％TFA，B-0.05％TFA/90％CH3CN
流速：32ml/分
梯度：B10iso(15分钟)，B15→B40％(100分钟)，B40％iso(30分钟)
检测：A350nm
在约103～104分种的洗脱时间确认出黄酮醇糖苷，对该组分进行浓缩及冷冻干燥，得到29.3mg。
而后，在用于制备HPLC的下述条件2对此组分进行再次分离。
<制备HPLC条件2>
色谱柱：YMC-Pack Polymer C18，
Figure BPA00001406959300262
20mm x 300mm
流动相：A-0.05％TFA，B-0.05％TFA/90％CH3CN
流速：6ml/分
梯度：B30iso(20分钟)，B30→B50％(60分钟)，B50％iso(10分钟)
检测：A350nm
在此条件下，发现了在31.01分钟和34.03分钟洗脱的具有黄酮醇糖苷吸收的峰A和峰B，对各个峰的组分进行浓缩及冷冻干燥，从峰A的组分中得到6.5mg，从峰B的组分中得到16.1mg。峰A与标准品的槲皮素3-葡萄糖苷保留时间一致。另一方面，对于峰B，如下通过以下NMR进行结构确定。
<通过质谱分析(MS)及NMR对各峰的确认等>
在Q-TOF Premier(Micromass公司制、UK)上，使用装有Z喷雾离子源的ESI，以阴性、V模式进行MS测定。通过45eV的碰撞能量，3KV的离子喷雾电压，质量锁定(lock spray)进行质量补正，使用亮氨酸脑啡肽(m/z554.2777[M-H]-)作为参照物。结果显示，峰B给出m/z 477.0664[M-H]-的分子离子，分子式为C21H17O13(err.：-1.0ppm)。此外，在相同条件下测定的峰A给出m/z 463.0878[M-H]-的分子离子，分子式为C21H19O11(err.：0.2ppm)，这与如上所述的标准品槲皮素3-葡萄糖苷一致，因此确认为槲皮素3-葡萄糖苷。
峰B的NMR的测定如下：在溶解于(CD3)2SO(DMSO-d6)后，使用2.50ppm DMSO-d6 1H和δ39.43的13C的残留峰作为内标，在DMX-500分光计(BRUKER BIOSPIN，Germany)上测定项目1H NMR、13C NMR、1H{13C}-HSQC、1H{13C}-HMBC、TOCSY及DQF-COSY。
上述MS及NMR的结果表明，峰B为槲皮素的葡萄糖苷酸，因在1H{13C}-HMBC中可看出从葡萄糖苷酸1位的质子到槲皮素的3位(δ132.95)的碳的峰，所以证明葡萄糖醛酸在3位结合，并可确认出该化合物为槲皮素3-O-葡萄糖苷酸(图9中的粗线表示HMBC)。因此，将该化合物作为槲皮素3-O-葡萄糖苷酸的标准品使用。
实施例3
基因表达分析
为鉴定VvGT5的功能域，根据“Noguchi，A.et al.，Plant J.，vol.54，p.415-427，2008”中所述的方法，通过SYBR-Green定量RT-PCR，使用7500实时PCR系统(Applied Biosystems)分析VvGT5基因在葡萄各器官中的基因表达模式。
所用葡萄为黑皮诺(Pinot Noir)品种及赤霞珠(Cabernet Sauvignon)品种。按照与实施例1同样的方法，从各器官(叶、叶柄、种子、果实、果皮)中提取总RNA，将使用Random Hexamer引物对0.5μg提取的RNA进行反转录(RT)，从而得到各器官的cDNA，并将其作为PCR的模板。
按照Primer Express 3.0程序(Applied Biosystems)，设计以下8种用于定量PCR的基因特异性引物。使用序列号5及6所示引物作为VvGT5特异性引物。对于作为比较对照物的花色素苷3-葡萄糖基转移酶的VvGT1、及VvGT5的同源基因VvGT6，可分别设计特异性引物用于分析(VvGT1特异性引物：序列号7及8，VvGT6特异性引物：序列号9及10)。采用葡萄的泛素延长酶(GenBank登录号：CAO48597)作为内标基因，并使用下述的基因特异性引物(序列号11及12)进行扩增。将各VvGT基因的表达水平用内标基因的表达量标准化，通过ΔΔCt法(Applied Biosystems)得到相对表达量。
qVvGT5-Fw1：
5’-GCT CCA TCT CCT CTG CTC AAA-3’(序列号5)
qVvGT5-Rv2：
5’-GAA AGC ACA AGG TCC TCT-3’(序列号6)
VvGT1-Fw：
5’-CCC ACC GCC GGT TAT ACC-3’(序列号7)
VvGT1-Rv：
5’-CGA CCG AGG TGG GTT TTC T-3’(序列号8)
VvGT6-Fw：
5’-GGT TCC CTG GTT GGC AAT TT-3’(序列号9)
VvGT5-Rv：
5’-GCA CCC GCC CCA CAA CCT T-3’(序列号10)
VvUBQ2-Fw：
5’-TCC AGG ACA AGG AAG GGA TTC-3’(序列号11)
VvUBQ2-Rv：
5’-GCC ATC CTC AAG CTG CTT TC-3’(序列号12)
其结果，可确认出VvGT5基因在其生成物积累的叶中显著表达(图10)。另一方面，VvGT1基因在果皮中特异性表达，这与公知文献(Ford，C.M.，et al.，J.Biol.Chem.，vol.273，p.9224-9233，1998)中记载的结果一致。令人感兴趣的是，还在果皮中发现了VvGT5基因的强列表达。VvGT6基因显示出与VvGT5基因类似的基因表达模式，推测这些基因在基因组上较接近的位置对两基因的协调性的基因表达模式产生了影响(图2)。
实施例4
葡萄及葡萄酒的类黄酮分析
由于实施例3的VvGT5的基因表达模式中表明黄酮醇3-葡萄糖苷酸也会积累在果皮中，所以对果皮类黄酮进行了分析。
使用3个葡萄品种(黑皮诺(Pinot Noir)、赤霞珠(Cabernet Sauvignon)及西拉(Syrah))的果皮和作为比较对照的黑皮诺(Pinot Noir)及赤霞珠(CabernetSauvignon)的叶，将鲜重0.8g的各样品进行冷冻干燥。将干燥体用刮刀(spatulas)破碎。在向样品中加入8ml含有0.1％甲酸的50％乙腈溶液后，在室温下进行30分钟超声波处理来提取类黄酮类。将超声波处理液离心(3000rpm，10分钟，4℃)。将所得上清用过滤器(Millex LH、孔径0.45μm、MILLIPORE株式会社制)过滤以用于HPLC分析。
HPLC分析条件如下，在柱温箱40℃下使用YMC-PAK-Polymer C18(4.6mm×250mm、YMC)作为色谱柱，使用流动相A(0.1％TFA/H2O)和流动相B(0.1％TFA/90％CH3CN)。洗脱条件如下：进行15分钟的线性浓度梯度(B20％→B60％)后，将系统在B60％保持10分钟。而后再重新用B20％平衡10分钟。流速为0.8ml/分。使用SPD-M10A光电二极管检测器(岛津制作所)在350nm处进行检测。在所述条件下，标准品的槲皮素3-葡萄糖苷酸(Q3GA)及槲皮素3-葡萄糖苷(Q3Glc)按顺序分别在保留时间约10.89分钟、11.21分钟洗脱。LC分析的结果确认了Q3GA在各葡萄品种的果皮中的积累(图11)。尽管在样品间的含量不同，但可认为此差异反映了果皮成熟程度的差异和品种间差异。
在MS分析中进一步确认了葡萄果皮中的Q3GA(图12)。
LC-MS分析条件如下，使用YMC-pak Polymer-C18(3.0mm×150mm、YMC)作为色谱柱。在流动相中，使用含有0.1％甲酸的水作为溶液A，使用含有0.1％甲酸的100％乙腈作为溶液B。洗脱进行20分钟，其中使用线性浓度梯度洗脱(溶液B：10％→70％)15分钟，而后，用溶液B 70％进行5分钟的等度洗脱。(流速：0.2ml/分、柱温箱：40℃)。
通过在光电二极管阵列检测器(SPD-M10A、岛津制作所)收集230～500nm处的数据，并测定A350nm处的色谱，来进行检测。另外，将PDA检测器与Q-TOF Premier(Micromass公司制、UK)检测器连接，用以下条件进行生成物分子量的测定。MS的测定条件设定为阴性、V模式(离子化：ESI，质量锁定参照物：亮氨酸脑啡肽，毛细管(Capillary)：2.6kV、锥(cone)：35V，碰撞能量：5eV)。
在该条件下，Q3Glc在R.T.12.32分洗脱，提供463.09[M-H]-的分子离子，3GlcA在R.T.12.41分洗脱，提供477.07[M-H]-的分子离子。可通过质谱色谱确认叶及果皮中的Q3GA峰。
而后，探究以葡萄为原材料的食品中的Q3GA。
对红葡萄酒(博若莱2007年、佳美品种)、红葡萄酒(勃艮第2006年、黑皮诺品种)及葡萄干(raisin)(葡萄干、中国产白葡萄)进行研究。
对于葡萄酒，在10ml葡萄酒中加入等量水，将所得溶液吸附于SEP-PAK1cc小柱(cartridge)(Waters公司)上，用10ml水洗涤后，用1ml的90％乙腈洗脱，得到10倍浓缩样品。
对于葡萄干，将10g葡萄干用液氮冷冻，在研钵中粉碎，用20ml的50％乙腈提取。在15ml提取物中加入85ml的水后，将其吸附于SEP-PAK 20cc小柱(Waters公司)上。将混合物用100ml水洗涤后，用2ml的90％乙腈洗脱，得到LC-MS样品液。
LC-MS的条件如下，使用YMC-Pack Polymer C18色谱柱(YMC、2.0mm×150mm、6μm)，对于流动相，使用含有0.1％甲酸的水作为溶液A，使用含有0.1％甲酸的90％乙腈作为溶液B。使用线性浓度梯度(溶液A 80％：溶液B 20％→溶液A 40％：溶液B 60％)洗脱15分钟，而后用溶液A 40％：溶液B 60％进行5分钟的等度洗脱。(流速：0.2ml/分钟)。
进行如下检测：用光电二极管阵列检测器(SPD-M10A、岛津制作所)收集230～500nm处的数据。此外，将PDA检测器与TOF-MS检测器(LCMS-IT-TOF、岛津制作所)连接，并测定产物的分子量。MS的测定条件设定为阴离子及阳离子的两种模式，测定分子量范围为100～1000Da，接口电压分别为4.5kV及-3.5kV。
在该条件下，作为标准品的Q3Glc及Q3GA在8.5分钟附近被洗脱。研究上述3个食品样品在8.5分钟附近的洗脱。在所有样品中，均在阴离子模式下检测出与Q3GA一致的m/z 477.04[M-H]-的分子离子。同时，还在阴离子模式下检测出与Q3Glc一致的m/z 463.06[M-H]-的分子离子。
这样，如VvGT5的基因表达模式所显示，可确认在葡萄果皮及包括葡萄果皮在内的食品(葡萄酒及葡萄干)中存在槲皮素3-葡萄糖苷酸。因此，VvGT5主要在葡萄的叶和果皮中表达，并且葡萄糖醛酸化发生在黄酮醇的3位。
实施例5
有关VvGT5的糖基供体选择性的点突变分析
如实施例2所示，证明VvGT5特异性地利用UDP-葡萄糖醛酸，但为证明决定该糖基供体选择性的氨基酸残基，通过使用Clustal-W进行氨基酸序列的多重序列比对(图13)。结果发现，在与VvGT5具有高同源性的葡萄花色素苷3-O-葡萄糖转移酶的VvGT1，以及分别来自拟南芥及矮牵牛的类黄酮3-O-葡萄糖转移酶的At3GlcT(UGT78D2；GenBank登录号：AAM91139)及Ph3GlcT(GenBank登录号：BAA89008)中高度保守的N末端第140位氨基酸附近存在的色氨酸(W)在VvGT5中被取代成精氨酸(R)。由VvGT1的结晶结构分析可知，这些氨基酸残基的C末端侧邻接的苏氨酸(T)与作为糖基供体的UDP-葡萄糖相互作用(Offen，W.et al.，EMBO J.，vol.25，p.1396-1405，2006)。因此说明，特异性地见于VvGT5精氨酸残基(序列号4的氨基酸序列的第140位氨基酸残基)与作为该糖基供体的UDP-葡萄糖醛酸发生了一些相互作用。
为证明在该独特的精氨酸残基在糖基供体选择性中的功能，使用QuickChange II定点突变试剂盒(Stratagene公司)，按照该试剂盒的推荐方法，制备将VvGT5的第140位精氨酸残基(R)被取代为色氨酸残基的VvGT5-R140W突变体(“R140W”的标记表示第140位的精氨酸(R)残基被色氨酸(W)残基取代的突变)，其中以插入了前述的野生型VvGT5的pET15b载体为模板并使用下述的合成低聚引物(序列号13及14)进行制备。
PCR条件为在96℃下进行30秒热变性后，进行96℃30秒→58℃1分钟→68℃7分钟为1循环的反应，重复16个循环。在PCR溶液中添加限制性内切酶Dpn I，在37℃处理混合物1小时后，将反应液10μl量转化到大肠杆菌(Mach株)。回收所得到的质粒，通过测序确认发生目标突变。
VvGT5 R140W Quik Fw：
5’-GGGTGGCAATTTGGACTGCTG-3’(序列号13)
VvGT5 R140W Quik Rv：
5’-CAGCAGTCCAAATTGC ACCC-3’(序列号14)
按照与实施例2同样的方法，将所制备的VvGT5-R140W突变体转化进大肠杆菌BL21株，添加1mM IPTG后，将转化体在18℃培养20小时，以制备出与His标签融合的VvGT5-R140W蛋白质。根据与实施例2同样的方法，对其糖供体选择性进行研究。结果表明VvGT5-R140W突变体不以UDP-葡萄糖醛酸为底物，取而代之，以UDP-葡萄糖为主要糖基供体(图14)。
由此可显示VvGT5的第140位精氨酸残基执行了识别UDP-葡萄糖醛酸的关键作用。由此可推测作为精氨酸残基的特征性侧链的胍基与作为葡萄糖醛酸的特征性官能团的羧酸之间的电相互作用对UDP-葡萄糖醛酸的识别非常重要。因此，也许可以认为以UDP-葡萄糖醛酸为特异性糖基供体的UGT酶中具备如VvGT5的R140的精氨酸残基。
工业实用性
如上所述，可从葡萄分离具有将葡萄糖醛酸转移到类黄酮的3位的新型活性的UGT酶(VvF3GAT)。此外，也可鉴定出决定对该UDP-葡萄糖醛特异性的氨基酸残基。通过运用本发明，可人为地在类黄酮的3位进行葡萄糖醛酸化。因此，本发明可用于开发功能性食品材料和开发可生产有用化合物的植物。因此，本发明可广泛应用在农业、食品产业、医药品产业及这些相关产业中。
序列表
SEQ ID No.1：合成DNA
SEQ ID No.2：合成DNA
SEQ ID No.3：合成DNA
SEQ ID No.4：合成DNA
SEQ ID No.5：合成DNA
SEQ ID No.6：合成DNA
SEQ ID No.7：合成DNA
SEQ ID No.8：合成DNA
SEQ ID No.9：合成DNA
SEQ ID No.10：合成DNA
SEQ ID No.11：合成DNA
SEQ ID No.12：合成DNA
SEQ ID No.13：合成DNA
SEQ ID No.14：合成DNA
Figure IPA00001406958900011
Figure IPA00001406958900031
Figure IPA00001406958900061
Figure IPA00001406958900071

Claims (14)

1.一种多核苷酸，其特征在于，为以下(a)～(f)中任一项所述的多核苷酸：
(a)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸由序列号3所示的核苷酸序列组成；
(b)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(d)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(f)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(g)～(j)中任一项的多核苷酸：
(g)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(h)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(i)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(j)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2中所述的多核苷酸，其特征在于，所述(c)～(j)中所述的多核苷酸分别为以下(c’)～(j’)中所述的多核苷酸：
(c’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中除了第140位氨基酸以外的1～15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(d’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列且与该序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸对应的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(e’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且是与该序列号3所示的核苷酸序列中第418～420位核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(f’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且是与该编码序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列中第418～420位的核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(g’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码由序列号4所示的氨基酸序列中除了第140位氨基酸以外的10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列组成，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(h’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸编码具有与序列号4所示的氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列且与该序列号4所示的氨基酸序列中第140位氨基酸对应的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；
(i’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与由序列号3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸，且是与该序列号3所示的核苷酸序列中第418～420位的核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质；或
(j’)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸是与编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸，且是与编码该序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸序列中第418～420位核苷酸对应的核苷酸为编码精氨酸的核苷酸的多核苷酸，且编码具有UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性的蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性为类黄酮3-O-葡萄糖醛酸基转移酶活性。
5.根据权利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有由序列号3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
6.根据权利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有编码由序列号4所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，其是DNA。
8.一种蛋白质，其特征在于，由权利要求1～7中任一项所述的多核苷酸编码。
9.一种载体，其特征在于，含有权利要求1～7中任一项所述的多核苷酸。
10.一种转化体，其特征在于，导入了权利要求1～7中任一项所述的多核苷酸。
11.一种转化体，其特征在于，导入了权利要求9所述的载体。
12.一种制造权利要求8所述蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求10或11中所述的转化体。
13.一种制造葡萄糖醛酸结合物的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求8所述的蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖醛酸和糖基受体底物生成葡萄糖醛酸结合物。
14.根据权利要求13中所述的方法，其特征在于，所述糖基受体底物为类黄酮。
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