WO2021230162A1 - プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法 - Google Patents

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WO2021230162A1
WO2021230162A1 PCT/JP2021/017556 JP2021017556W WO2021230162A1 WO 2021230162 A1 WO2021230162 A1 WO 2021230162A1 JP 2021017556 W JP2021017556 W JP 2021017556W WO 2021230162 A1 WO2021230162 A1 WO 2021230162A1
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WO
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amino acid
acid sequence
seq
protein
prenylflavonoid
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PCT/JP2021/017556
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English (en)
French (fr)
Inventor
栄一郎 小埜
慶造 藤井
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid.
  • Isoxanthohumol is a compound obtained by isomerizing xanthohumol contained in a hop (Humulus lupulus), and is a kind of prenylflavonoid having a prenyl group.
  • Prenylflavonoids such as isoxanthohumol and xanthohumol have been reported to have various useful biological activities (Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Document 1).
  • Prenylflavonoids ingested into the body are glucuronidated and metabolized in the liver by the action of UGT (UDP sugar-dependent glycosyltransferase) (Non-Patent Document 4).
  • prenylflavonoids such as isoxanthohumol and xanthohumol in vivo
  • prenylflavonoids are glucuronidated in the body, but the separation and purification of prenylflavonoid glucuronids such as isoxanthohumol glucuronids from animals such as humans can be obtained. It is costly and time consuming and impractical.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid such as isoxanthohumol.
  • the present invention relates to, but is not limited to, the following method for producing a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid.
  • One selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin which comprises the step of producing a glucuronoid conjugate of prenylflavonoid from UDP-glucuronoid and prenylflavonoid by a protein.
  • A1 Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a2 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, or inserted at positions other than the 140th arginine.
  • Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b2) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / at positions other than arginine at position 353.
  • the protein (b3) consisting of the added amino acid sequence and having the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • a protein (c1) sequence consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to position 353 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is arginine and having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid. Protein consisting of the amino acid sequence represented by No.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added at positions other than the 355th arginine. It has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 of the protein (c3) which consists of the amino acid sequence and has the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • a protein having an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 355th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is arginine and having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid [2] The production method according to the above [1], wherein the protein is isoxantofumole and / or xanthofumole.
  • a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid such as isoxanthohumol.
  • a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid can be produced using prenylflavonoid and UDP-glucuronic acid as raw materials by using a protein having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming UGT (VvGT5) derived from grapes expressed and purified in Escherichia coli and UGT (Sl_F7GAT) derived from Scutellaria indica by SDS-PAGE.
  • the lane numbers indicate molecular weight markers L1 and L2, vector control (soluble fraction of Escherichia coli transformed with an empty vector), L4 purified VvGT5, and L5 purified Sl_F7GAT.
  • FIG. 2A is a diagram showing HPLC analysis results (chromatogram) of a control reaction solution reacted with UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using a soluble fraction of Escherichia coli transformed with an empty vector.
  • FIG. 2B is a diagram showing the HPLC analysis results (chromatogram) of the reaction solution obtained by reacting UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol using UGT (Sl_F7GAT) derived from Scutellaria indica expressed in Escherichia coli (detection). : 280 nm).
  • FIG. 2C is a diagram showing HPLC analysis results (chromatogram) of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol using grape-derived UGT (VvGT5) expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results (HMBC and NOE) of NMR measurement of the reaction products of UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) by glucuronosyltransferase.
  • the method for producing a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid of the present invention is as follows (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3). )
  • ) Includes the step of producing a glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid from UDP-glucuronic acid and prenylflavonoid with one or more proteins selected from the group consisting of.
  • A1 Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (a2) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, or inserted at positions other than the 140th arginine.
  • Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b2) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / at positions other than arginine at position 353. Alternatively, it has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the protein (b3) consisting of the added amino acid sequence and having the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • a protein (c1) sequence consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to position 353 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is arginine and having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 of the protein (c3) which consists of the amino acid sequence and has the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 355th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is arginine and having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • prenylflavonoid is one or more selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin.
  • prenylnaringenin examples include 8-prenylnaringenin and 6-prenylnaringenin.
  • the prenylflavonoids are preferably isoxanthohumol and / or xanthohumol.
  • Isoxanthohumol is a prenylflavonoid having a hydroxyl group at the 7-position. Similar to isoxanthohumol, prenylflavonoids having a hydroxyl group at the 7-position include 8-prenylnaringenin and 6-prenylnaringenin. Isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin are prenylflavonoids represented by the following general formula (1).
  • R represents a methyl group or a hydrogen atom.
  • the prenylflavonoid represented by the general formula (1) is isoxanthohumol, and when R is a hydrogen atom, it is represented by the general formula (1).
  • the prenylflavonoid is 8-prenylnaringenin.
  • Xanthohumol is a prenylflavonoid represented by the following formula (2). Xanthohumol has hydroxyl groups at the 4'and 4-positions.
  • the amino acid number is an amino acid number from the N-terminal.
  • the proteins (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3) transfer glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid. Has the activity to do.
  • a protein having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of at least one prenylflavonoid selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin is used.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid is preferably the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of isoxanthohumol and / or xanthohumol.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid means that glucuronic acid (glucuronic acid residue) is transferred to the hydroxyl group of the above prenylflavonoid which is a glycosyl acceptor substrate using UDP-glucuronic acid as a sugar donor.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid is determined by, for example, reacting UDP-glucuronic acid with the above-mentioned prenylflavonoid in the presence of a protein to be evaluated, and analyzing the obtained reaction product by HPLC or the like. You can check.
  • a protein having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of isoxanthohumol can be used.
  • a protein having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of xanthohumol can be used.
  • a protein having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylnaringenin can be used.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of isoxanthohumol is the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 7-position of isoxanthohumol.
  • This reaction produces a glucuronic acid conjugate of isoxanthohumol in which glucuronic acid (glucuronic acid residue) is bound to the 7-position (hydroxyl group) of isoxanthohumol.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of xanthohumol is usually the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 4'and / or 4-position (preferably 4') of xanthohumol.
  • This reaction usually produces a glucuronic acid conjugate of xanthohumol in which glucuronic acid is bound to the 4'and / or (hydroxyl group) position of xanthohumol.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of xanthohumol is preferably the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 4'position of xanthohumol.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylnaringenin is usually the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 7-position of prenylnaringenin.
  • This reaction produces a glucuronic acid conjugate of prenylnaringenin in which glucuronic acid is bound to the 7-position (hydroxyl group) of prenylnaringenin such as 8-prenylnaringenin and 6-prenylnaringenin.
  • the number of glucuronic acids transferred to prenylflavonoids is preferably one.
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 7-position of isoxanthohumol (or prenylnaringenin) can also be said to be the activity of glucuronidating the 7-position of isoxanthohumol (or prenylnaringenin).
  • the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl groups at the 4'and / or 4-position of xanthohumol can also be said to be the activity of glucuron-oxidizing the 4'and / or 4-position of xanthohumol.
  • the above (a1) to (a3), (b1) to (b3) and (c1) to (c3) (preferably (a1), (a2), (a3), (b1), (b2). ) And (b3)) by using one or more proteins selected from the group, using UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol as raw materials, the 7th position (more specifically, the 7th position) of isoxanthohumol.
  • a glucuronide conjugate of isoxanthohumol in which the hydroxyl group) is glucuron-oxidized (a glucuronic acid residue is bonded to the 7-position) can be produced.
  • the above (a1) to (a3), (b1) to (b3) and (c1) to (c3) (preferably (a1) to (a3) and (c1) to (c3), More preferably, by using one or more proteins selected from the group consisting of (c1), (c2) and (c3)), 4'of xanthohumol using UDP-glucuronic acid and xanthohumol as raw materials.
  • a glucuronide conjugate of xanthohumol in which the position and / or the 4-position (the hydroxyl group) is glucuron-oxidized can be produced.
  • the above (a1) to (a3), (b1) to (b3) and (c1) to (c3) (preferably (a1), (a2), (a3), (b1)). , (B2) and (b3)), by using one or more proteins selected from the group, glucuron oxidation of the 7-position (hydroxyl) of prenylnaringenin using UDP-glucuronic acid and prenylnaringenin as raw materials.
  • a glucuronide conjugate of prenylnaringenin can be produced.
  • the protein of (a1) is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of UDP-glucuronosyltransferase VvGT5 derived from grapes of the genus Grapevine (Vitis vinifera). It has been reported that the 140th arginine residue of grape-derived VvGT5 plays an essential role in the recognition of UDP-glucuronic acid (WO2010 / 84879).
  • the protein of (b1) is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the UDP-glucuronosyltransferase SlUGT derived from Skullcapa latteviolacea v. Yakusimensis. It has been reported that the arginine residue at position 353 is essential for the recognition of UDP-glucuronic acid in SlUGT derived from Scutellaria indica (Eiichiro Kono, Chemistry and Biology, Vol. 50, No. 1,201, 16- 22).
  • the protein of (c1) is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is UDP-glucuronosyltransferase (AmUGTcg10) derived from Antirrhinum majus of the genus Qualcomm of the Plantain family. It has been reported that the arginine residue at position 355 of Qualcomm-derived AmUGTcg10 is essential for the recognition of UDP-glucuronic acid (Noguchi A et al (2009) Plant Cell. 21 (5): 1556-1572). ..
  • the amino acid sequence of Qualcomm-derived AmUGTcg10 is set forth in Japanese Patent No. 4927774 with SEQ ID NO: 13.
  • VvGT5 and SlUGT have the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the above prenylflavonoid. It has not been reported so far that AmUGTcg10 also has an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of the above prenylflavonoid.
  • WO2010 / 84879 states that VvGT5 was found to be a flavonol-specific UPP-glucuronic acid-dependent flavonol 3-position glucuronide transferase, but glucuronic acid was added to the 3-position of flavonols. From the transferring activity, it is unpredictable to have the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid.
  • the protein of the above (a2) is usually a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 140th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is arginine.
  • the protein of the above (b2) is usually a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 353rd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is arginine.
  • the protein of the above (c2) is a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at the position corresponding to the 355th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is arginine.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is preferably 1 to 8. 1 to 7 or 1 to 6, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is preferably 1 to 8, 1 to 7, or 1 to 1. The number is 6, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • one or more (for example, 1 to 9) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of a protein as any and one or more amino acids in the same sequence. It means that there is a deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acids at a position in the sequence, and two or more of the deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. ..
  • the protein of (a3) has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and is located at the 140th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It consists of an amino acid sequence in which the amino acid is arginine.
  • the amino acid sequence identity (sequence identity) with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more or 94% or more, more preferably. Is 95% or more, 96% or more or 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the protein of the above (b3) has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and is located at the position corresponding to the 353rd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. It consists of an amino acid sequence in which the amino acid is arginine.
  • the amino acid sequence identity (sequence identity) with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more or 94% or more, more preferably. Is 95% or more, 96% or more or 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the protein of the above (c3) has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and is located at the position corresponding to the 355th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. It consists of an amino acid sequence in which the amino acid is arginine.
  • the amino acid sequence identity (sequence identity) with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more or 94% or more, more preferably. Is 95% or more, 96% or more or 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • Amino acid sequence identity (sequence identity) can be calculated with default parameters using, for example, analysis software such as BLAST.
  • the amino acid at the position corresponding to the 140th arginine (arginine residue) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence (primary structure) of the protein (polypeptide) to be compared.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 reference amino acid sequence
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 reference amino acid sequence
  • the amino acid at the position corresponding to the 140th arginine is the 140th arginine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but in a protein having an amino acid sequence different from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid at the position corresponding to the 353rd arginine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence (reference) of SEQ ID NO: 4 with respect to the amino acid sequence (primary structure) of the protein (polypeptide) to be compared.
  • aligned based on the homology between the amino acid sequence) and the amino acid sequence it means the amino acid at the position corresponding to the 353rd position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid at the position corresponding to the 353rd arginine is the 353rd arginine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, but in a protein having an amino acid sequence different from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the amino acid has a different amino acid sequence. It may not be the 353rd.
  • the amino acid at the position corresponding to the 355th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence (reference) of SEQ ID NO: 6 for the amino acid sequence (primary structure) of the protein (polypeptide) to be compared.
  • the amino acid at the position corresponding to the 355th arginine is the 355th arginine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, but in a protein having an amino acid sequence different from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, It may not be the 355th.
  • the position corresponding to the 140th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence is also referred to as "the position corresponding to the 140th position of SEQ ID NO: 2".
  • the position corresponding to the 353rd arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the amino acid sequence is also referred to as "the position corresponding to the 353rd position of SEQ ID NO: 4".
  • the position corresponding to the 355th arginine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence is also referred to as "the position corresponding to the 355th position of SEQ ID NO: 6".
  • the amino acid at the position corresponding to position 140 of SEQ ID NO: 2 can be specified by using a known sequence comparison program such as Clustal W.
  • ClustalW can usually use default parameters.
  • ClustalW can be used from websites such as the DNA Data Bank of Japan (DNA Data Bank of Japan: DDBJ) and the European Bioinformatics Institute (EBI).
  • the amino acid residue at a specific position of any protein corresponds to any position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 4 can be easily identified.
  • the amino acid residue at a specific position of any protein is represented by SEQ ID NO: 4. It is possible to easily identify which position corresponds to in the amino acid sequence. The same applies to the position corresponding to the 355th position of SEQ ID NO: 6 in any protein.
  • 1 selected from the group consisting of (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3).
  • the protein of the species or more one or more proteins selected from the group consisting of (a1), (a2) and (a3) may be used.
  • one or more proteins selected from the group consisting of (b1), (b2) and (b3) may be used as the protein.
  • one or more proteins selected from the group consisting of (c1), (c2) and (c3) may be used as the protein.
  • proteins of (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3) are also hereinafter referred to as prenylflavonoid glucuronide transferase.
  • prenylflavonoid glucuronide transferase (a1) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (b1) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and (c1) SEQ ID NO: 6
  • One or more proteins selected from the group consisting of proteins consisting of the amino acid sequences represented by (a1) and / or (b1) are more preferable, and (a1) the amino acid represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein consisting of a sequence is more preferable.
  • the proteins of (a1) and / or (b1) are more preferred, and the protein of (a1) is even more preferred. In one embodiment, for example, when obtaining a glucuronide conjugate of xanthohumol, the protein of (c1) is more preferred.
  • the proteins (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3) are not limited in their origin or production method.
  • a polynucleotide encoding a protein can be introduced into a non-human host such as a microorganism by a known genetic engineering technique, and the obtained transformant can be cultured to express the protein for production.
  • the desired protein can be obtained by purifying the protein from the culture in which the transformant is cultured. Protein purification can be performed according to conventional methods.
  • Examples of the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the protein of (a1) include a polynucleotide (specifically, DNA) containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an example of the polynucleotide encoding the protein of (a1).
  • a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein of (b1) for example, a polynucleotide containing the 1st to 1365th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, preferably the base represented by SEQ ID NO: 3.
  • Polynucleotides containing sequences include.
  • Examples of the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the protein of (c1) include a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is an example of the polynucleotide encoding the protein of (c1).
  • the proteins (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3) transfer glucuronic acid to the hydroxyl group of the prenylflavonoid.
  • the degree of purification thereof is not particularly limited as long as it has activity.
  • Culture means any of a culture medium, a cultured cell or a cultured cell, a cultured cell or a crushed product of the cultured cell.
  • prenylflavonoid glucuronide transferase when prenylflavonoid glucuronide transferase is accumulated in a cultured cell or cell, the cell or cell is subjected to a usual method (for example, ultrasonic wave, lysozyme, freeze-thaw, etc.) after the culture. After crushing the protein, a crude protein extract can be obtained by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.). When the above protein is accumulated in the culture medium, prenylflavonoid glucuronic acid is obtained by separating the cells or cells from the culture supernatant by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after the completion of the culture.
  • a usual method for example, ultrasonic wave, lysozyme, freeze-thaw, etc.
  • a culture supernatant containing a transfer enzyme can be obtained.
  • Purification of prenylflavonoid glucuronidyltransferase contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be carried out according to a usual separation or purification method.
  • the separation or purification method for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis method, ultrafiltration method and the like are used alone or in combination as appropriate. be able to.
  • proteins of (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), (b3), (c1), (c2) and (c3) are the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl). It can also be produced by a chemical synthesis method such as the method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the prenylflavonoid and UDP-glucuronic acid are reacted with one or more of the above proteins as a catalyst to generate a glucuronic acid conjugate of the prenylflavonoid (the hydroxyl group) in which the prenylflavonoid (the hydroxyl group) is gluclon-oxidized. be able to.
  • reaction liquid for example, in an aqueous medium such as water or a buffer solution.
  • aqueous medium such as water or a buffer solution.
  • the initial concentration of prenylflavonoid in the reaction solution may be, for example, 0.1 to 50 mM.
  • Prenylflavonoid can be added to the reaction solution by dissolving it in a solvent such as ethanol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like.
  • the molar ratio of UDP-glucuronoid to prenylflavonoid in the reaction solution at the start of the reaction is preferably 1 to 30.
  • the pH of the reaction solution shall be, for example, 7 to 10. Is preferable, and more preferably 7.2 to 9.5.
  • the pH is the pH at 25 ° C.
  • the reaction temperature can be, for example, 25 to 50 ° C, preferably 27 to 47 ° C.
  • the reaction time may be set as appropriate. The reaction time can be, for example, 10 minutes to 4 hours.
  • the pH of the reaction solution shall be, for example, 7 to 8. It is possible, preferably 7.2 to 7.7.
  • the reaction temperature can be 25-40 ° C, preferably 27-37 ° C.
  • the reaction time may be set as appropriate. For example, it can be 10 minutes to 4 hours.
  • the pH of the reaction solution is, for example, 7.5 to 9. It can be 5, preferably 8.5 to 9.5.
  • the reaction temperature can be 25 to 50 ° C, preferably 27 to 47 ° C.
  • the reaction time may be set as appropriate. For example, it can be 10 minutes to 4 hours.
  • Prenylflavonoid is not limited to its production method or the like.
  • Isoxanthohumol can be prepared, for example, from a hop extract through a process such as heating. By heating the hop extract, isoxanthohumol can be produced in the extract.
  • the hop extract is usually prepared by extracting the hop flower with a solvent and, if necessary, through a process related to purification, and can be obtained by a known method for preparing a hop extract. Examples of the extraction method include an extraction method using an ethanol solvent, which is used as a method for preparing a hop extract used for beer brewing.
  • the hop extract is commercially available, and a commercially available hop extract can also be used.
  • the heating of the hop extract for producing isoxanthohumol is preferably carried out at 80 to 140 ° C. (more preferably 85 to 100 ° C.) for 15 minutes to 5 hours (more preferably 20 minutes to 3 hours).
  • Purification of the hop extract for preparing isoxanthohumol is carried out by known methods. Examples of the purification method include the use of HPLC, an adsorption column, and the like, and methods such as precipitation utilizing a change in solubility.
  • Isoxanthohumol can also be produced by heating xanthohumol.
  • the heating temperature at this time is preferably 80 to 140 ° C. (more preferably 85 to 100 ° C.) for 15 minutes to 5 hours (more preferably 20 minutes to 3 hours).
  • the isoxanthohumol obtained by the isomerization treatment can be concentrated or purified by a known method (for example, filtration, vacuum concentration, freeze-drying, etc.), if necessary.
  • Xanthohumol and 8-prenylnaringenin are prenylflavonoids contained in hops and the like.
  • Xanthohumol and 8-prenylnaringenin can be prepared, for example, by purifying from hop extracts by known methods.
  • Commercially available products can also be used for prenylflavonoids.
  • purified prenylflavonoids may be used, or plant-derived raw materials rich in prenylflavonoids may be used as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • an isoxanthohumol glucuronic acid conjugate in which the 7-position (hydroxyl group) of isoxanthohumol is glucuron-oxidized is produced.
  • a xanthohumol glucuronide conjugate in which the 4'-position and / or the 4-position (preferably the 4'-position) (hydroxyl group) of xanthohumol is usually glucron-oxidized is produced.
  • prenylnaringenin When prenylnaringenin is used, a prenylnaringenin glucuronide conjugate in which the 7-position (hydroxyl group) of prenylnaringenin is usually oxidized with glucuron is produced.
  • the glucuronid conjugate of prenylflavonoid produced can be separated or purified from the solution by a known method. Specifically, for example, separation by a synthetic adsorbent, separation by reverse phase chromatography, precipitation utilizing a change in solubility, or the like can be used alone or in combination as appropriate.
  • the production method of the present invention may include a step of purifying a glucuronide conjugate of prenylflavonoid.
  • glucuronid conjugate of prenylflavonoid can be confirmed by known methods (eg, mass analysis, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high performance liquid chromatography (HPLC), etc.).
  • the glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid obtained by the production method of the present invention is useful as a material for functional foods, a reagent for investigating the function of the glucuronic acid conjugate of prenylflavonoid in vivo, and the like.
  • the present invention further discloses the following manufacturing method.
  • a method for producing an isoxanthohumol glucuronide conjugate which comprises a step of producing an isoxanthohumol glucuronide conjugate from the above.
  • A11 Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (a21) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, or inserted at positions other than the 140th arginine.
  • the amino acid corresponding to the 140th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence of arginine, and glucuronic acid is added to the hydroxyl group at the 7-position of isoxanthofumole.
  • Protein having transfer activity (b11) Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b21) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 1 to 9 amino acids are present at positions other than the 353rd arginine.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of a protein (b31) consisting of a deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequence and having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 7-position of isoxanthofumole. It consists of an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 353rd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is arginine, which has 90% or more identity with respect to the above, and is at the 7th position of isoxanthofmol. Protein with activity to transfer glucuronic acid to the hydroxyl group of
  • UDP-glucuronosyltransferase (PfUGT50) derived from Perilla family Perilla genus Perilla (Perilla frutecesns) and UDP derived from Pedaliaceae sesame seed (Sesamum indexum) described in Patent No. 4927774.
  • -Glucuronosyltransferase (SiUGT23) is also expected to have the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group of prenylflavonoid.
  • these enzymes can also generate a glucuronide conjugate of isoxanthohumol in which the 7-position of isoxanthohumol is oxidized from UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol, for example. .. It is also predicted that these enzymes can generate a glucuronic acid conjugate of prenylnaringenin in which the 7-position of prenylnaringenin is glucuron-oxidized from UDP-glucuronic acid and prenylnaringenin.
  • the above enzyme can generate a glucuronic acid conjugate of xanthohumol in which the 4'and / or 4-position of xanthohumol is glucuron-oxidized from UDP-glucuronic acid and xanthohumol. .. Also described herein is the following method of producing a glucuronic acid conjugate using a perilla or sesame-derived UDP-glucuronic acid transferase.
  • UDP-glucuronoid and prenyl by one or more UDP-glucuronoid transferases selected from the group consisting of USDO-glucuronoid transferase (PfUGT50) derived from perilla and UDP-glucuronoid acid transferase (SiUGT23) derived from sesame seeds.
  • Preparation of a glucuronoid conjugate of prenylflavonoid comprising the step of producing a glucuronoid conjugate of prenylflavonoid from a flavonoid (one or more selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthofumol and 8-prenylnaringenin).
  • UGT UDP gluconosyltransferase
  • VvGT5 The amino acid sequence of the gluconosyltransferase VvGT5 (hereinafter referred to as VvGT5) derived from grapes is shown in SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding this is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Sl_F7GAT The amino acid sequence of the flavonoid 7-position glucuronosyltransferase Sl_F7GAT (hereinafter referred to as Sl_F7GAT) of Scutellaria indica is shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding this is shown in SEQ ID NO: 3.
  • VvGT5 and Sl_F7GAT each cDNA (VvGT5 cDNA sequence: SEQ ID NO: 1, Sl_F7GAT cDNA sequence: SEQ ID NO: 3) was added to the E. coli expression vector pET15b (manufactured by Novagen) according to the previously reported methods (References 1 and 2).
  • the recombinant protein was extracted from the collected Escherichia coli using a BugBuster (registered trademark) Protein Operation Regent (manufactured by Merck Millipore), and a HisTrap (registered trademark) High Performance (manufactured by GE Healthcare) column was used. The protein was purified.
  • FIG. 1 shows the results of confirming UGT (VvGT5) derived from grapes expressed and purified in Escherichia coli and UGT (Sl_F7GAT) derived from Scutellaria indica by SDS-PAGE.
  • the lane numbers of L1 to L5 are as follows.
  • the band at the position indicated by the arrow in FIG. 1 is the band of the recombinant protein.
  • L1 Molecular weight marker
  • L2 Molecular weight marker
  • L3 Vector control (soluble fraction of Escherichia coli transformed with empty vector)
  • L4 Purified VvGT5
  • L5 Purified Sl_F7GAT
  • NC vector control
  • 2 kDa / pI 5.89
  • 48.3 kDa / pI 6.72
  • N-terminal His tag sequence is not included
  • the reaction was stopped by adding an equal amount of acetonitrile to the reaction solution, filtered through a Millex filter (LH-4, 0.45 ⁇ m, manufactured by Merck Millipore), and the supernatant after centrifugation was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC). Analyzed in.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a soluble fraction of E. coli transformed with the vector pET15b (empty vector) not encoding VvGT5 and Sl_F7GAT was used instead of the above-mentioned recombinant UGT protein.
  • the reaction was carried out under the same conditions as above except that a soluble fraction was added instead of the recombinant UGT protein, and the supernatant of the reaction solution was analyzed by HPLC.
  • FIG. 2A is a diagram showing the results of HPLC analysis of a control reaction solution reacted with UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using a soluble fraction of Escherichia coli transformed with an empty vector (detection). : 280 nm). Elution of the IX peak is confirmed around the retention time of about 12.3 minutes.
  • FIG. 2A is a diagram showing the results of HPLC analysis of a control reaction solution reacted with UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using a soluble fraction of Escherichia coli transformed with an empty vector (detection). : 280 nm). Elution of the IX peak is confirmed around the retention time of about 12.3 minutes.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a control reaction solution reacted with UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using a soluble fraction of Escher
  • FIG. 2B is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using UGT (Sl_F7GAT) derived from Scutellaria indica expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm).
  • FIG. 2C is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) using grape-derived UGT (VvGT5) expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm).
  • VvGT5 grape-derived UGT
  • IX is the substrate isoxanthohumol (retention time about 12.3 minutes) and IXG (retention time about 8.9 minutes) is the product isoxanthohumol.
  • the 7th position of the molle indicates a glucuron-oxidized glucuronide conjugate.
  • Conc vertical axis on the right indicates the concentration of liquid B.
  • the peak fraction of the product was purified by elution stepwise using a Sep-Pak column.
  • the peak fraction of the reaction product was loaded onto 35 cc of Sep-pakC18 (manufactured by Waters) and stepwise with 3 CV (column volume) washed with water, 3 CV of 5% acetonitrile aqueous solution, 3 CV of 40% acetonitrile aqueous solution, and 3 CV of 80% acetonitrile aqueous solution. Eluted into.
  • FIG. 3 and Table 1 show the results of NMR measurement of the reaction products of UDP-glucuronic acid and isoxanthohumol (IX) by glucuronyltransferase.
  • Table 1 shows the chemical shifts of 1H and 13C.
  • FIG. 3 shows the results of HMBC (Heteroncular Multiple Bond Correlation) and NOE (Nuclear Overhauser Effect), which are key to determine the sugar binding position to IX.
  • HMBC Heteroncular Multiple Bond Correlation
  • NOE Nuclear Overhauser Effect
  • Example 2 As a UGT, flavonoid 7-position glucuronosyltransferase AmUGTcg10 (UGT88D4) derived from Qualcomm Snapdragon of the Plantain family (Reference 1: Noguchi A et al (2009) Plant Cell. 21 (2009) The reactivity with xanthofumol (XN) was examined.
  • the amino acid sequence of the glucuronidation enzyme AmUGTcg10 (hereinafter referred to as AmUGTcg10) derived from goldfish is shown in SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding this is shown in SEQ ID NO: 5, respectively.
  • the cDNA of AmUGTcg10 (DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5) was cloned into the Escherichia coli expression vector pET15b (manufactured by Novagen) with HisTag added to the N-terminal.
  • Escherichia coli One Shot (registered trademark) BL21 Star (registered trademark) (DE3) cells (manufactured by Thermo Fisher Scientific) were transformed, and recombinant Escherichia coli was selected with ampicillin.
  • the transformant was cultured in the same manner as in Example 1, the recombinant protein was extracted from Escherichia coli, and the target UGT protein was purified.
  • the reaction was stopped by adding an equal amount of acetonitrile to the reaction solution, filtered through a Millex filter (LH-4, 0.45 ⁇ m, manufactured by Merck Millipore), and the supernatant after centrifugation was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC). Analyzed in.
  • HPLC analysis conditions are the same as those used for the product analysis in Example 1.
  • a soluble fraction of Escherichia coli transformed with the vector pET15b (empty vector) not encoding AmUGTcg10 was used instead of the above-mentioned recombinant UGT protein.
  • the reaction was carried out under the same conditions as above except that a soluble fraction was added instead of the recombinant UGT protein, and the supernatant of the reaction solution was analyzed by HPLC.
  • Glucuronic acid conjugate (glucuronic acid glycoside) of xanthohumol in a recombinant UGT protein-dependent manner from a reaction solution obtained by reacting UDP-glucuronic acid and xanthohumol (XN) using AmUGTcg10 expressed in Escherichia coli. ) Is found.
  • prenylflavonoids such as isoxanthohumol can be glucuronidated using the plant-derived flavonoid UGT.
  • the present invention is useful in the field of food and drink. It is also useful for making glucuronic acid conjugates produced in vivo.

Abstract

本発明は、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法を提供することを目的とする。 本発明は、（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルフラボノイドからプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含み、上記プレニルフラボノイドが、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される１種以上である、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法に関する。

Description

プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法
本発明は、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法に関する。
イソキサントフモールは、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ）に含まれるキサントフモールが異性化した化合物であり、プレニル基を有するプレニルフラボノイドの一種である。イソキサントフモール、キサントフモール等のプレニルフラボノイドは、多様な有用生物活性を有することが報告されている（非特許文献１～３及び特許文献１）。体内に摂取されたプレニルフラボノイドは肝臓でＵＧＴ（ＵＤＰ糖依存的糖転移酵素）の働きによってグルクロン酸抱合化されて代謝される（非特許文献４）。
特開２０１８－９５５８０号公報
Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ　（２０１９）　Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．　６７：　８２９１－８３０２ Ｄｏｓｔａｌｅｋ　ｅｔ　ａｌ　（２０１７）　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，　２２：　１７６１ Ｍｕｋａｉ　（２０１７）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　８２（２）：　２０７－２１５ Ｆａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　（２０１９）　Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．　６７：　１１６５０－１１６５６
イソキサントフモール、キサントフモール等のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の生体内での機能を調べるためには、充分な量の化合物を得てその活性を調べる必要がある。上記のようにプレニルフラボノイドは体内でグルクロン酸抱合化されるが、ヒト等の動物からイソキサントフモールのグルクロン酸抱合体などのプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を分離及び精製して得ることは、コスト及び時間がかかり実用的ではない。
本発明は、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）－グルクロン酸から、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する植物由来のＵＤＰ－糖転移酵素（ＵＧＴ）を見出した。イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドにグルクロン酸を転移する活性を有する植物由来のＵＧＴは、これまで報告されていない。
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法に関する。
〔１〕下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルフラボノイドからプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含み、上記プレニルフラボノイドが、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される１種以上である、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法。
（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１４０番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３５３番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｃ１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、３５５番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｃ３）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
〔２〕上記プレニルフラボノイドが、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールである、上記〔１〕に記載の製造方法。
本発明によれば、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法を提供することができる。本発明によれば、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質を用いて、プレニルフラボノイド及びＵＤＰ－グルクロン酸を原料として、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を製造することができる。
図１は、大腸菌で発現させ、精製したブドウ由来のＵＧＴ（ＶｖＧＴ５）及びヤクシマタツナミソウ由来のＵＧＴ（Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果を示す図である。レーン番号は、Ｌ１及びＬ２が分子量マーカー、Ｌ３がベクターコントロール（空ベクターで形質転換した大腸菌の可溶性画分）、Ｌ４が精製したＶｖＧＴ５、Ｌ５が精製したＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴを示す。 図２Ａは、空ベクターで形質転換した大腸菌の可溶性画分を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させたコントロールの反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２Ｂは、大腸菌に発現させたヤクシマタツナミソウ由来ＵＧＴ（Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２Ｃは、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ５）を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。 図３は、グルクロン酸転移酵素による、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）の反応生成物のＮＭＲ測定の結果（ＨＭＢＣ及びＮＯＥ）を示す図である。
本発明のプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法は、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルフラボノイドからプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含む。
（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１４０番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３５３番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｃ１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、３５５番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｃ３）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
本発明において、プレニルフラボノイドは、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される１種以上である。プレニルナリンゲニンとして、８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニン等が挙げられる。一態様において、プレニルフラボノイドは、好ましくはイソキサントフモール及び／又はキサントフモールである。
イソキサントフモールは、７位に水酸基を有するプレニルフラボノイドである。イソキサントフモールと同様に７位に水酸基を有するプレニルフラボノイドに、８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニンがある。イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
一般式（１）においてＲがメチル基である場合、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイドは、イソキサントフモールであり、Ｒが水素原子である場合、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイドは、８－プレニルナリンゲニンである。
キサントフモールは、下記式（２）で表されるプレニルフラボノイドである。キサントフモールは、４´位及び４位に水酸基を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
本明細書中、アミノ酸の番号は、Ｎ末端からのアミノ酸番号である。
上記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）のタンパク質は、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有する。本発明においては、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種のプレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質を用いる。一態様において、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性は、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性であることが好ましい。
本発明において、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性とは、ＵＤＰ－グルクロン酸を糖供与体として、糖受容体基質である上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸（グルクロン酸残基）を転移し、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体とＵＤＰ（ウリジン二リン酸）とを生じる反応を触媒する活性を意味する。
プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性は、例えば、ＵＤＰ－グルクロン酸と、上記プレニルフラボノイドとを評価対象となるタンパク質の存在下で反応させ、得られる反応物をＨＰＬＣ等で分析することによって確認することができる。
本発明において、イソキサントフモールのグルクロン酸抱合体を製造する場合は、イソキサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質を使用することができる。キサントフモールのグルクロン酸抱合体を製造する場合は、キサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質を使用することができる。プレニルナリンゲニンのグルクロン酸抱合体を製造する場合は、プレニルナリンゲニンの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質を使用することができる。
イソキサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性とは、イソキサントフモール７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性である。この反応により、イソキサントフモールの７位（の水酸基）にグルクロン酸（グルクロン酸残基）が結合しているイソキサントフモールのグルクロン酸抱合体が生成する。
キサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性とは、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（好ましくは４´位）の水酸基にグルクロン酸を転移する活性である。この反応により、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（の水酸基）にグルクロン酸が結合しているキサントフモールのグルクロン酸抱合体が生成する。一態様においては、キサントフモールの水酸基にグルクロン酸を転移する活性は、好ましくは、キサントフモールの４´位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性である。
プレニルナリンゲニンの水酸基にグルクロン酸を転移する活性とは、通常、プレニルナリンゲニンの７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性である。この反応により、８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニン等のプレニルナリンゲニンの７位（の水酸基）にグルクロン酸が結合しているプレニルナリンゲニンのグルクロン酸抱合体が生成する。プレニルフラボノイドに転移するグルクロン酸の数は、１つであることが好ましい。
イソキサントフモール（又はプレニルナリンゲニン）の７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性は、イソキサントフモール（又はプレニルナリンゲニン）の７位をグルクロン酸化する活性ということもできる。キサントフモールの４´位及び／又は４位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性は、キサントフモールの４´位及び／又は４位をグルクロン酸化する活性ということもできる。
一態様においては、上記（ａ１）～（ａ３）、（ｂ１）～（ｂ３）及び（ｃ１）～（ｃ３）（好ましくは（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｂ３））からなる群より選択される１種以上のタンパク質を用いることにより、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモールを原料として、イソキサントフモールの７位（より詳細には７位の水酸基）がグルクロン酸化された（７位にグルクロン酸残基が結合している）イソキサントフモールのグルクロン酸抱合体を製造することができる。
別の一態様においては、上記（ａ１）～（ａ３）、（ｂ１）～（ｂ３）及び（ｃ１）～（ｃ３）（好ましくは（ａ１）～（ａ３）及び（ｃ１）～（ｃ３）、より好ましくは（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３））からなる群より選択される１種以上のタンパク質を用いることにより、ＵＤＰ－グルクロン酸及びキサントフモールを原料として、キサントフモールの４´位及び／又は４位（の水酸基）がグルクロン酸化されたキサントフモールのグルクロン酸抱合体を製造することができる。
さらに別の一態様においては、上記（ａ１）～（ａ３）、（ｂ１）～（ｂ３）及び（ｃ１）～（ｃ３）（好ましくは（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｂ３））からなる群より選択される１種以上のタンパク質を用いることにより、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルナリンゲニンを原料として、プレニルナリンゲニンの７位（の水酸基）がグルクロン酸化されたプレニルナリンゲニンのグルクロン酸抱合体を製造することができる。
（ａ１）のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ブドウ科ブドウ属のブドウ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素ＶｖＧＴ５のアミノ酸配列である。ブドウ由来のＶｖＧＴ５は、その１４０番目のアルギニン残基がＵＤＰ－グルクロン酸の認識に必須な役割を果たしていることが報告されている（ＷＯ２０１０／８４８７９）。
（ｂ１）のタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、シソ科タツナミソウ属ヤクシマタツナミソウ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ　ｌａｅｔｅｖｉｏｌａｃｅａ　ｖ．　ｙａｋｕｓｉｍｅｎｓｉｓ）由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素ＳｌＵＧＴのアミノ酸配列である。ヤクシマタツナミソウ由来のＳｌＵＧＴは、３５３番目のアルギニン残基がＵＤＰ－グルクロン酸の認識に必須であることが報告されている（小埜栄一郎、化学と生物、Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１，２０１２，１６－２２）。
（ｃ１）のタンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
配列番号６で表されるアミノ酸配列は、オオバコ科キンギョソウ属のキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＡｍＵＧＴｃｇ１０）である。キンギョソウ由来のＡｍＵＧＴｃｇ１０は、その３５５番目のアルギニン残基がＵＤＰ－グルクロン酸の認識に必須であることが報告されている（Ｎｏｇｕｃｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２００９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．　２１（５）：１５５６－１５７２）。キンギョソウ由来のＡｍＵＧＴｃｇ１０のアミノ酸配列は、特許第４９２７７７４号に配列番号１３で示されている。
ＶｖＧＴ５及びＳｌＵＧＴが、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有することは、これまで報告されていない。ＡｍＵＧＴｃｇ１０についても、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有することは、これまで報告されていない。ＷＯ２０１０／８４８７９には、ＶｖＧＴ５がフラボノールに特異的なＵＤＰ－グルクロン酸依存的フラボノール３位グルクロン酸転移酵素であることが明らかになったことが記載されているが、フラボノールの３位にグルクロン酸を転移する活性から、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有することは予測できるものではない。
上記（ａ２）のタンパク質は、通常、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質である。上記（ｂ２）のタンパク質は、通常、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質である。上記（ｃ２）のタンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
上記（ａ２）及び（ｂ２）のタンパク質において、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。上記（ｃ２）のタンパク質において、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。
本明細書中、タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数個（例えば１～９個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。
上記（ａ３）のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなる。上記（ａ３）のタンパク質において、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
上記（ｂ３）のタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなる。上記（ｂ３）のタンパク質において、配列番号４で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
上記（ｃ３）のタンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなる。上記（ｃ３）のタンパク質において、配列番号６で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。
本明細書中、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目のアルギニン（アルギニン残基）に相当する位置にあるアミノ酸とは、比較対象のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列（一次構造）について、配列番号２のアミノ酸配列（基準のアミノ酸配列）とアミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行った場合に、配列番号２のアミノ酸配列中の１４０番目に対応する位置のアミノ酸を意味する。従って、１４０番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸は、配列番号２で表されるアミノ酸配列では１４０番目のアルギニンであるが、配列番号２で表されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列のタンパク質においては、１４０番目とはならない場合がある。配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸についても、同様である。配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸とは、比較対象のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列（一次構造）について、配列番号４のアミノ酸配列（基準のアミノ酸配列）とアミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行った場合に、配列番号４のアミノ酸配列中の３５３番目に対応する位置のアミノ酸を意味する。３５３番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸は、配列番号４で表されるアミノ酸配列では３５３番目のアルギニンであるが、配列番号４で表されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列のタンパク質においては、３５３番目とはならない場合がある。配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸についても、同様である。配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸とは、比較対象のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列（一次構造）について、配列番号６のアミノ酸配列（基準のアミノ酸配列）とアミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行った場合に、配列番号６のアミノ酸配列中の３５５番目に対応する位置のアミノ酸を意味する。３５５番目のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸は、配列番号６で表されるアミノ酸配列では３５５番目のアルギニンであるが、配列番号６で表されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列のタンパク質においては、３５５番目とはならない場合がある。
本明細書中、アミノ酸配列における配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目のアルギニンに相当する位置を、「配列番号２の１４０番目に相当する位置」ともいう。アミノ酸配列における配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目のアルギニンに相当する位置を、「配列番号４の３５３番目に相当する位置」ともいう。アミノ酸配列における配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目のアルギニンに相当する位置を、「配列番号６の３５５番目に相当する位置」ともいう。
配列番号２の１４０番目に相当する位置のアミノ酸を、上記（ａ２）～（ａ３）等の任意のタンパク質において特定することは、容易である。
配列番号２の１４０番目に相当する位置のアミノ酸の特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷのような既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、通常、デフォルトパラメーターを用いることができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）等のウェブサイトから利用することができる。比較を行いたい２つのタンパク質のアミノ酸配列を入力してプログラムを実行することによって、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行うことができる。ここで、配列番号２のアミノ酸配列を、２つのタンパク質の１つとして入力することによって、任意のタンパク質の特定位置のアミノ酸残基が、配列番号２で表されるアミノ酸配列においてどの位置に相当するかを容易に特定することができる。任意のタンパク質における配列番号４の３５３番目に相当する位置についても同様である。ＣｌｕｓｔａｌＷのような配列比較プログラムを用いて、配列番号４のアミノ酸配列を、２つのタンパク質の１つとして入力することによって、任意のタンパク質の特定位置のアミノ酸残基が、配列番号４で表されるアミノ酸配列においてどの位置に相当するかを容易に特定することができる。任意のタンパク質における配列番号６の３５５番目に相当する位置についても同様である。
本発明の一態様において、（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質として、（ａ１）、（ａ２）及び（ａ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用してよい。別の一態様において、上記タンパク質として、（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｂ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用してよい。さらに別の一態様において、上記タンパク質として、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用してよい。
（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）のタンパク質を、以下ではプレニルフラボノイドグルクロン酸転移酵素ともいう。
一態様において、プレニルフラボノイドグルクロン酸転移酵素として、（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び（ｃ１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群より選択される１種以上のタンパク質が好ましく、（ａ１）及び／又は（ｂ１）のタンパク質がより好ましく、（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。一態様において、例えば、イソキサントフモール又はプレニルナリンゲニンのグルクロン酸抱合体を得る場合は、（ａ１）及び／又は（ｂ１）のタンパク質がより好ましく、（ａ１）のタンパク質が更に好ましい。一態様において、例えば、キサントフモールのグルクロン酸抱合体を得る場合は、（ｃ１）のタンパク質がより好ましい。
上記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）のタンパク質は、その由来や製造方法に制限されない。例えば、公知の遺伝子工学的手法によって、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを微生物等の非ヒト宿主に導入して、得られる形質転換体を培養して当該タンパク質を発現させて製造することができる。より具体的には、形質転換体を培養した培養物から、タンパク質を精製することにより、所望のタンパク質を得ることができる。タンパク質の精製は通常の方法に従って行うことができる。（ａ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド（具体的には、ＤＮＡ）が挙げられる。配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、（ａ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一例である。（ｂ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号３で表される塩基配列の１～１３６５番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。（ｃ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、（ｃ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一例である。
（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）のタンパク質は、上記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するものであれば、その精製度も特に制限されない。本発明の効果を奏することになる限り、上記の培養物や、タンパク質の粗精製物を使用することもできる。培養物は、培養液、培養菌体又は培養細胞、培養菌体又は培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。
具体的には、プレニルフラボノイドグルクロン酸転移酵素が培養菌体内又は培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体又は細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）によりタンパク質の粗抽出液を得ることができる。上記タンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体又は細胞と培養上清とを分離することにより、プレニルフラボノイドグルクロン酸転移酵素を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液又は培養上清中に含まれるプレニルフラボノイドグルクロン酸転移酵素の精製は、通常の分離又は精製方法に従って行うことができる。分離又は精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
また、（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。
本発明においては、上記のタンパク質の１種以上を触媒として、上記プレニルフラボノイド及びＵＤＰ－グルクロン酸を反応させて、プレニルフラボノイド（の水酸基）がグルクロン酸化されたプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させることができる。
上記の反応は、好ましくは液（反応液）中、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。
反応液中のプレニルフラボノイドの初期濃度は、例えば、０．１～５０ｍＭであってよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて反応液に添加することができる。
反応開始時の反応液中のプレニルフラボノイドに対するＵＤＰ－グルクロン酸のモル比（ＵＤＰ－グルクロン酸／プレニルフラボノイド）は、１～３０が好ましい。
本発明の製造方法において上記（ａ１）、（ａ２）及び（ａ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用する場合は、反応液のｐＨは、例えば、７～１０とすることが好ましく、より好ましくは７．２～９．５である。ｐＨは、２５℃におけるｐＨである。反応温度は、例えば、２５～５０℃とすることができ、好ましくは２７～４７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。反応時間は、例えば１０分～４時間とすることができる。
本発明の製造方法において上記（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｂ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用する場合は、反応液のｐＨは、例えば、７～８とすることができ、好ましくは７．２～７．７である。反応温度は、２５～４０℃とすることができ、好ましくは２７～３７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。例えば１０分～４時間とすることができる。
本発明の製造方法において上記（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を使用する場合は、反応液のｐＨは、例えば、７．５～９．５とすることができ、好ましくは８．５～９．５である。反応温度は、２５～５０℃とすることができ、好ましくは２７～４７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。例えば１０分～４時間とすることができる。
プレニルフラボノイドは、その製造方法等に何ら制限されない。イソキサントフモールは、例えば、ホップ抽出物から加熱等のプロセスを経て調製することができる。ホップ抽出物を加熱することにより、該抽出物中にイソキサントフモールを生成させることができる。ホップ抽出物は、通常、ホップの毬花を溶媒で抽出し、必要に応じて精製に係るプロセスを介して調製され、公知のホップ抽出物の調製方法により得ることができる。抽出方法として、例えば、ビール醸造に用いられるホップ抽出物の調製法として用いられる、エタノール溶媒による抽出法が挙げられる。ホップ抽出物は市販されており、市販のホップ抽出物を使用することもできる。イソキサントフモールを生成させるためのホップ抽出物の加熱は、８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）行うことが好ましい。イソキサントフモールを調製するためのホップ抽出物の精製は、公知の方法で実施される。精製方法として、例えば、ＨＰＬＣや吸着カラム等の使用や、溶解度の変化を利用した析出などの方法が挙げられる。また、イソキサントフモールは、キサントフモールを加熱することによって製造することもできる。この際の加熱温度は、好ましくは８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）を採用することができる。異性化処理により得られたイソキサントフモールは、必要に応じて、公知の方法（例えば、ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥等）により濃縮したり、精製したりすることができる。
キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、ホップ等に含まれるプレニルフラボノイドである。キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、例えば、ホップ抽出物から公知の方法で精製して調製することができる。
プレニルフラボノイドは、市販品を使用することもできる。
本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、精製されたプレニルフラボノイドを使用してもよく、プレニルフラボノイドを豊富に含む植物由来原料等を使用してもよい。
本発明においては、例えば、イソキサントフモールを用いた場合は、イソキサントフモールの７位（の水酸基）がグルクロン酸化されたイソキサントフモールグルクロン酸抱合体が生成する。キサントフモールを用いた場合は、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（好ましくは４´位）（の水酸基）がグルクロン酸化されたキサントフモールグルクロン酸抱合体が生成する。プレニルナリンゲニンを用いた場合は、通常、プレニルナリンゲニンの７位（の水酸基）がグルクロン酸化されたプレニルナリンゲニングルクロン酸抱合体が生成する。
生成したプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体は、溶液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、合成吸着剤による分離、逆相クロマトグラフィーによる分離、溶解度の変化を利用した析出等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の製造方法は、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を精製する工程を含んでいてもよい。
プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体が得られたことは、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。
本発明の製造方法で得られるプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体は、機能性食品の材料、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の生体内での機能を調べるための試薬等として有用である。
本発明は、さらに以下の製造方法を開示する。
＜１＞下記（ａ１１）、（ａ２１）、（ａ３１）、（ｂ１１）、（ｂ２１）及び（ｂ３１）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモールからイソキサントフモールのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含む、イソキサントフモールのグルクロン酸抱合体の製造方法。
（ａ１１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１４０番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソキサントフモールの７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ａ３１）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、イソキサントフモールの７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ１１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２１）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３５３番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソキサントフモールの７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
（ｂ３１）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、イソキサントフモールの７位の水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
上記のタンパク質以外に、特許第４９２７７７４号に記載されているシソ科シソ属のシソ（Ｐｅｒｉｌｌａ　ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＰｆＵＧＴ５０）及びゴマ科ゴマ属のゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ）由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＳｉＵＧＴ２３）も、プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有すると予測される。したがってこれらの酵素も、例えば、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモールから、イソキサントフモールの７位がグルクロン酸化されたイソキサントフモールのグルクロン酸抱合体を生成させることができると予測される。またこれらの酵素は、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルナリンゲニンから、プレニルナリンゲニンの７位がグルクロン酸化されたプレニルナリンゲニンのグルクロン酸抱合体を生成させることができると予測される。また上記酵素は、ＵＤＰ－グルクロン酸及びキサントフモールから、キサントフモールの４´位及び／又は４位がグルクロン酸化されたキサントフモールのグルクロン酸抱合体を生成させることができると予測される。
本明細書には、シソ又はゴマ由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素を使用する、以下のグルクロン酸抱合体の製造方法も記載されている。
シソ由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＰｆＵＧＴ５０）及びゴマ由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＳｉＵＧＴ２３）からなる群より選択される１種以上のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルフラボノイド（イソキサントフモール、キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンからなる群より選択される１種以上）からプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含む、プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法。
シソ由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＰｆＵＧＴ５０）及びゴマ由来のＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＳｉＵＧＴ２３）のアミノ酸配列は、特許第４９２７７７４号に配列番号５及び配列番号２３でそれぞれ示されている。
なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全ては、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法に従った。
＜実施例１＞
植物酵素によるイソキサントフモール（ＩＸ）のグルクロン酸抱合体の製造
（ＵＧＴについて）
植物においては特定のフラボノイドの位置特異的にＵＤＰ糖をドナーとして糖を転移する活性を有するＵＤＰ糖転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子がゲノム中に１００を超える多重コピーとして存在しており、多くは低分子有機化合物の配糖体化に関わっていると考えられている。しかしながら前述のようにこれまでにプレニルフラボノイドに対してグルクロン酸抱合化活性のある植物ＵＧＴは同定されていないために、配列から候補遺伝子の推定をすることはできなかった。
（植物ＵＧＴの選定）
ＵＧＴとして、シソ目シソ科ヤクシマタツナミソウ属ヤクシマタツナミソウのフラボノイド７位グルクロン酸転移酵素Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ（ＵＧＴ８８Ｄ５）（参考文献１：Ｎｏｇｕｃｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２００９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．　２１（５）：１５５６－１５７２）と、フラボノイド３位に特異性のあるフラボノイド３位グルクロン酸転移酵素ＶｖＧＴ５（ＵＧＴ７８Ａ１１）（参考文献２：Ｏｎｏ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ　（２０１０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２２（８）：２８５６－２８７１）について、ＩＸへの反応性を検討した。ＶｖＧＴ５はブドウ由来のグルクロン酸転移酵素である。
ブドウ由来のグルクロン酸転移酵素ＶｖＧＴ５（以下、ＶｖＧＴ５）のアミノ酸配列を配列番号２に、これをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１にそれぞれ示す。ヤクシマタツナミソウのフラボノイド７位グルクロン酸転移酵素Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ（以下、Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）のアミノ酸配列を配列番号４に、これをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号３にそれぞれ示す。
（組換えタンパク質の発現及び精製）
ＶｖＧＴ５及びＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴについて、既報の方法（参考文献１～２）に従って、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にそれぞれのｃＤＮＡ（ＶｖＧＴ５のｃＤＮＡの配列：配列番号１、Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴのｃＤＮＡの配列：配列番号３）をＮ末にＨｉｓＴａｇを付加した形でクローン化し、大腸菌Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（登録商標）　ＢＬ２１　Ｓｔａｒ（登録商標）　（ＤＥ３）　ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に形質転換し、アンピシリンで組換え大腸菌（以下、組換え大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）という）を選抜した。形質転換体はＬＢ培地（５０ｍＬ）で培養し、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使ってタンパク質を発現させた。集菌した大腸菌からＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使って組換えタンパク質を抽出し、ＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムを用いて、目的のＵＧＴタンパク質を精製した。
（タンパク質検出：ウェスタンブロット解析）
精製した２種のＵＧＴタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のプレキャストのアクリルアミドゲル（エクストラＰＡＧＥワン　プレキャストゲル（１０－２０％，　１３ｗｅｌｌｓ，　Ｗ１００ｍｍ×Ｈ１００ｍｍ×Ｔ３．２ｍｍ（ガラス製），ナラカイテスク（株））で電気泳動した。
電気泳動後、ゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐトランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロッティングし、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ溶液（ナカライテスク（株））でブロッキングした後、抗ＨｉｓＴａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を一次抗体として反応させ、その後、ＥＣＬ－抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ　ｌｉｎｋｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を二次抗体として反応させた。　
その後、ＥＣＬ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させて、Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ蛍光検出機（ＢｉｏＲａｄ）で発現タンパク質量を定量した。
図１に、大腸菌で発現させ、精製したブドウ由来のＵＧＴ（ＶｖＧＴ５）及びヤクシマタツナミソウ由来のＵＧＴ（Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果を示す。Ｌ１～Ｌ５のレーン番号は、以下の通りである。図１中に矢印で示す位置のバンドが、組換えタンパク質のバンドである。
Ｌ１：分子量マーカー、Ｌ２：分子量マーカー、Ｌ３：ベクターコントロール（空ベクターで形質転換した大腸菌の可溶性画分）、Ｌ４：精製したＶｖＧＴ５、Ｌ５：精製したＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴ
その結果、ベクターコントロール（Ｎ．Ｃ．）ではバンドが検出されてないのに対し、ＶｖＧＴ５（図１のＬ４のレーン）及びＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴ（図１のＬ５のレーン）についてはそれぞれの推定サイズ（５０．２ｋＤａ／ｐＩ＝５．８９，　４８．３ｋＤａ／ｐＩ＝６．７２、Ｎ末のＨｉｓタグの配列は含まない）近傍に明瞭な組換えタンパク質の発現が確認されたため、可溶性画分に充分組換えタンパク質が発現していると判断し、次に酵素活性を検討した。
（酵素反応）
組換え大腸菌の培養液（５０ｍＬ）から調製した組換えＵＧＴタンパク質を用いて小スケールで活性評価を行った。
組換えＵＧＴタンパク質（ＶｖＧＴ５又はＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）に、ＩＸ（糖受容体）、ＵＤＰ－グルクロン酸（糖供与体）をそれぞれ終濃度０．２ｍＭ、２ｍＭ濃度で加え、０．１ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で３０℃で２時間反応させた。反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
コントロールには、上記の組換えＵＧＴタンパク質の代わりに、ＶｖＧＴ５及びＳｌ＿Ｆ７ＧＡＴをコードしないベクターｐＥＴ１５ｂ（空ベクター）で形質転換した大腸菌の可溶性画分を使用した。組換えＵＧＴタンパク質の代わりに可溶性画分を添加した以外は、上記と同じ条件で反応を行い、反応液の上清をＨＰＬＣで分析した。
（生成物の分析）
ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
（装置）
Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＩＬ－２０ＡＣ
Ｐｕｍｐ：Ａ、Ｂ：ＬＣ－１０ＡＤ
ＤＩＯＤＥ　ＡＲＲＡＹ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（いずれも（株）島津製作所製）
（分析条件）
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＦＣ－ＯＤＳ　１５０ｍｍ×４．６ｍｍφ３μｍ（（株）島津製作所製）
移動相：Ａ液：０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡ／１００％ＣＨ３ＣＮ
流速：０．６ｍＬ／分
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液２０％→７０％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液７０％（６ｍｉｎ）、Ｂ液７０％→２０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液２０％（１３．５ｍｉｎ）
カラムオーブン：４０℃
ＰＤＡ検出：２３０～６００ｎｍを測定
サンプル注入量：１０μＬ
（結果）
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに、反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す。
図２Ａは、空ベクターで形質転換した大腸菌の可溶性画分を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させたコントロールの反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。保持時間約１２．３分付近にＩＸのピークの溶出が確認される。
図２Ｂは、大腸菌に発現させたヤクシマタツナミソウ由来ＵＧＴ（Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴ）を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２Ｃは、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ５）を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃ中、ＩＸは、基質であるイソキサントフモール（保持時間約１２．３分）を、ＩＸＧ（保持時間約８．９分）は、生成物であるイソキサントフモールの７位がグルクロン酸化されたグルクロン酸抱合体を示す。Ｂ．ｃｏｎｃ（右の縦軸）は、Ｂ液濃度を示す。
Ｓｌ＿Ｆ７ＧＡＴとＶｖＧＴ５について、ＩＸを糖授与体として、ＵＤＰ－グルクロン酸（糖供与体）と共に反応させたところ、保持時間８．９分付近に組換えＵＧＴタンパク質依存的にＩＸのグルクロン酸抱合体（グルクロン酸配糖体）と思われる生成物が見出された。
（ＩＸグルクロン酸抱合体の精製）
生成物のピークの画分を、Ｓｅｐ－Ｐａｋカラムを用いてステップワイズに溶出することで精製を行った。反応生成物のピークの画分を３５ｃｃのＳｅｐ－ｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）に負荷し、水洗い３ＣＶ（カラムボリューム）、５％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、４０％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、８０％アセトニトリル水溶液３ＣＶでステップワイズに溶出した。水洗い及び５％アセトニトリル水溶液画分はピークがなく、４０％アセトニトリル水溶液溶出画分にＩＸグルクロン酸配糖体が検出された。
この生成物をさらに分取ＨＰＬＣで精製し、ＮＭＲ測定に供した。
（構造決定）
ＮＭＲ測定はＣＤ３ＯＤ／Ｄ２Ｏ（８０：２０）中で実施した。図３及び表１に、グルクロン酸転移酵素による、ＵＤＰ－グルクロン酸及びイソキサントフモール（ＩＸ）の反応生成物のＮＭＲ測定の結果を示す。表１は、１Ｈ及び１３Ｃの化学シフトである。図３は、ＩＸへの糖結合位置の決定の鍵となるＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｂｏｎｄ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）及びＮＯＥ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｅｆｆｅｃｔ）の結果である。表１中、化学シフト（δ）の単位はｐｐｍ、カップリング定数（Ｊ）の単位はＨｚである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
これにより、生成物は、ＩＸの７位（の水酸基）にグルクロン酸が１つ付加されたイソキサントフモールモノグルクロニド（ＩＸＧＡ、ＩＸＧｌｃＡ、ＩＸ７ＧＡ又はＩＸ７ＧｌｃＡと記載することもある）であることが確認された。
＜実施例２＞
ＵＧＴとして、オオバコ科キンギョソウ属のキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）由来のフラボノイド７位グルクロン酸転移酵素ＡｍＵＧＴｃｇ１０（ＵＧＴ８８Ｄ４）（参考文献１：Ｎｏｇｕｃｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２００９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．　２１（５）：１５５６－１５７２）について、キサントフモール（ＸＮ）への反応性を検討した。
キンギョソウ由来のグルクロン酸転移酵素ＡｍＵＧＴｃｇ１０（以下、ＡｍＵＧＴｃｇ１０）のアミノ酸配列を配列番号６に、これをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号５にそれぞれ示す。
（組換えタンパク質の発現及び精製）
既報の方法（参考文献１）に従って、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＡｍＵＧＴｃｇ１０のｃＤＮＡ（配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ）をＮ末にＨｉｓＴａｇを付加した形でクローン化し、大腸菌Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（登録商標）　ＢＬ２１　Ｓｔａｒ（登録商標）　（ＤＥ３）　ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に形質転換し、アンピシリンで組換え大腸菌を選抜した。実施例１と同じ方法で、形質転換体を培養し、大腸菌から組換えタンパク質を抽出し、目的のＵＧＴタンパク質を精製した。
（タンパク質検出：ウェスタンブロット解析）
実施例１と同じ方法で、精製したＵＧＴタンパク質を電気泳動し、ウェスタンブロット解析を行って、組換えタンパク質の発現を確認した。
次に酵素活性を検討した。
（酵素反応）
組換え大腸菌の培養液（５０ｍＬ）から調製した組換えＵＧＴタンパク質を用いて小スケールで活性評価を行った。
組換えＵＧＴタンパク質（ＡｍＵＧＴｃｇ１０）に、キサントフモール（ＸＮ）（糖受容体）、ＵＤＰ－グルクロン酸（糖供与体）をそれぞれ終濃度０．２ｍＭ、２ｍＭ濃度で加え、０．１ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で３０℃で２時間反応させた。反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの分析条件は、実施例１で生成物の分析に使用した条件と同じである。
コントロールには、上記の組換えＵＧＴタンパク質の代わりに、ＡｍＵＧＴｃｇ１０をコードしないベクターｐＥＴ１５ｂ（空ベクター）で形質転換した大腸菌の可溶性画分を使用した。組換えＵＧＴタンパク質の代わりに可溶性画分を添加した以外は、上記と同じ条件で反応を行い、反応液の上清をＨＰＬＣで分析した。
大腸菌に発現させたＡｍＵＧＴｃｇ１０を用いて、ＵＤＰ－グルクロン酸及びキサントフモール（ＸＮ）を反応させた反応液から、組換えＵＧＴタンパク質依存的にキサントフモールのグルクロン酸抱合体（グルクロン酸配糖体）が見出される。
以上の結果から、植物由来のフラボノイドＵＧＴを用いて、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドをグルクロン酸抱合化できることが明らかとなった。
本発明は、飲食品分野等において有用である。また生体内で生成されるグルクロン酸抱合体の標品を作製するのに有用である。

Claims (2)

  1. 下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）及び（ｃ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、ＵＤＰ－グルクロン酸及びプレニルフラボノイドからプレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体を生成させる工程を含み、
    前記プレニルフラボノイドが、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される１種以上である、
    プレニルフラボノイドのグルクロン酸抱合体の製造方法。
    （ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１４０番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
    （ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１４０番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
    （ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、３５３番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
    （ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号４で表されるアミノ酸配列の３５３番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
    （ｃ１）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｃ２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、３５５番目のアルギニン以外の位置において１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
    （ｃ３）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列の３５５番目に相当する位置にあるアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなり、前記プレニルフラボノイドの水酸基にグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質
  2. 前記プレニルフラボノイドが、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールである、請求項１に記載の製造方法。

     
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